Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Специфические проблемы России в области безопасности и подлинности напитков и методы их контроля 9
1.1. Исследование токсичности различных видов этанола и особенностей его метаболизма в зависимости от концентрации и физиологических особенностей организма 11
1,2.Токсикологическая характеристика этилового спирта, алкогольных напитков и содержащихся в них примесей 19
1.3. Контроль качества безопасности и подлинности напитков 25
1 4 Спектроскопия ЯМР 2Н в изотопном анализе органических веществ 41
Глава2. Разработка и совершенствование некоторых прямых и косвенных методов контроля токсичности и идентификации напитков 46
2.1. Определение общей суммарной токсичности примесей в АП 46
2.2. Экспресс-идентификация спирта и водок с помощью реактивных индикаторных полосок (РИП) 57
2.3 Выявление аутентичности напитка эталону с помощью лазерного компьютерного анализатора (ЛКА) 63
Глава 3. Анализ изотопного состава как арбитражный метод идентификации и контроля безопасности алкогольной продукции 71
3.1. Интегральный анализ изотопов углерода 73
3.2. Дифференциальный изотопный анализ методами количественной спектроскопии ЯМР 77
3.3. Количественная спектроскопия ЯМР в качественном и количественном анализе АП из винограда 96
Выводы 103
Литература 104
Приложение
- Исследование токсичности различных видов этанола и особенностей его метаболизма в зависимости от концентрации и физиологических особенностей организма
- Определение общей суммарной токсичности примесей в АП
- Интегральный анализ изотопов углерода
Введение к работе
В современных экономических и политических условиях России обеспечение
безопасности и качества пищевой продукции требует немедленного
технического перевооружения и существенных изменений системы её
контроля и идентификации на всех стадиях жизненного цикла. Федеральный
Закон «О техническом регулировании» знаменует начало разработки новых
требований к каждому виду продуктов питания, включая и напитки,
которые должны быть сформулированы в виде технических регламентов, главное требование которых - обеспечение химической и биологической безопасности в целях защиты жизни и здоровья граждан , а также предотвращение действий, вводящих в заблуждение потребителей.
Изменение экономических отношений в России отразилось на всех сторонах жизни общества. Проявилось это и на рынке напитков ( в первую очередь алкогольсодержащей продукции - АП) Изменился ассортимент и появились новые разновидности всевозможных напитков и, конечно, АП. Появилось большое число фальсификатов. Повысилась токсичность многих безалкогольных напитков и традиционных разновидностей винно-водочной продукции, что вызывает у медиков особую тревогу и побуждает разобраться в сложившейся ситуации. Установить тип этилового спирта в АП сложно, т.к. требования к гидролизному и синтетическому спиртам практически соответствуют требованиям ГОСТа на пищевой спирт. Это провоцирует производителей водок и ликёро-водочных изделий на использование непищевых спиртов. Дешёвые алкогольные напитки, изготовленные с нарушением технологии, оказывают более выраженное токсическое действие. Вторыми после водок по объёму реализации идут ликёро-водочные изделия ( ликёры, пунши, настойки, аперитивы ), которые содержат значительное количество компонентов как растительного происхождения, так и синтетические добавки, способные повышать токсический потенциал этилового спирта. Всё более стрессонаполненный образ жизни в России начала XXI века вынуждает человека «балансировать на краю собственного генотипа» и ведёт к злоупотреблениям психоактивными веществами. Прогнозы предполагают рост значимости проблемы зависимости от алкоголя и алкогольных отравлений , в том числе обусловленных их трудно контролируемой безопасностью и качеством. АП является, к сожалению, компонентом пищевого рациона большого числа взрослых, трудоспособных людей. Среди продуктов питания они не имеет аналогов по губительным социальным и медицинским последствиям при «передозировке ». Это остро ставит вопрос по обеспечению подлинности, качества и безопасности АП ( ничуть не меньшей, чем для лекарственных препаратов! ). Охрана здоровья человека и нации требуют совершенствования действующего законодательства, процедур экспертизы АП. Почти все существующие методики СаНПИНов и ГОСТов, используемые в практике контроля безопасности и подлинности напитков ( прежде всего АП) основаны на элементном и компонентном анализе. Они не позволяют выявить в напитках присутствие ненормированных токсичных и опасных компонентов, обусловленных как использованием каких-то не сертифицированных
технологий их производства, так и явной фальсификацией. Наибольшую опасность представляют фальсификаты АП, особенно, содержащие высокую концентрацию этанола. Одним из наиболее экономически выгодных и распространённых видов фальсификации АП является использование вместо пищевого этанола (спирта) (ПЭ ) технических (гидролизного - ГЭ, и синтетического - СЭ) как для производства водок , так и для « синтеза » вин, коньяков и иной АП. В случае качественной очистки этанола совокупность методов и требований ГОСТов и СаНПИНов не позволяет отличить ПС от СС и ГС, хотя последние запрещены к использованию в пищевых и медицинских целях. Это обусловлено тем, что более 30 лет назад в Московском институте гигиены им. Ф.Ф Эрисмана проводилась сравнительная оценка токсических свойств этиловых спиртов разного происхождения. Эксперименты показали, что острая токсичность гидролизного и синтетического спиртов превышает токсичность спирта, произведённого из пищевого сырья, их хроническая токсичность существенно выше в отношении понижения условно-рефлекторной деятельности и толерантности животных к этанолу. Это послужило основанием отказа в рекомендации использовать такие спирты для производства алкогольных напитков. Установление однозначного соответствия обеспечивается расшифровкой полного качественно-количественного состава продукта, включая весь набор следовых количеств микропримесей. На современном уровне аналитической техники это возможно, но очень трудоёмко. Решение проблемы требует введения аналитических подходов разных иерархических уровней. Для идентификации напитков не обязательно расшифровывать их полный элементно-компонентный состав. Согласно ГОСТ 51293-99 задача решается, если применить какой-либо инструментальный подход, способный сформировать однозначный многомерный идентификационный образ объекта. Контроль безопасности, качества (нормативные требования) и подлинности алкогольной продукции до настоящего времени не стал достаточно организованным, технологичным процессом, гарантирующим соответствие этим показателям. Федеральный Закон " О техническом регулировании " пока только в общих чертах обозначил ситуацию.
Современный арсенал биологических и физико-химических методов и подходов по их сложностям и целям можно условно разделить на основные группы :
1) Первичные: выявление токсичности напитка, его отдельных выделенных
компонентов или суммарной токсичности примесей ( биотестирование).
2) Экспресс-методы, доступные потребителю для качественной быстрой
разбраковки по степени несоответствия или полного соответствия эталону,
нормативу, стандарту: индикаторные трубки, полоски, реактивные бумаги.
3) Обобщённый многофакторный контроль аутентичности без идентификации
отдельных компонентов: " кибер-нос ", " кибер-язык ", спектрально-
люминесцентный анализатор (СЛАП), лазерный компьютерный анализатор
(ЛКА), капиллярный электрофорез, специальные хроматографические методики.
4) Нормативные: контроль качественного и количественного состава
компонентов напитков, разновидности хроматографии, хромато-масс-
спектрометрия, ИК- и УФ-спектроскопия, ЯМР высокого разрешения, атомно-
адсорбционная спектроскопия..
5) Арбитражные ( в какой-то мере " абсолютные " ): ЯМР-спектроскопия
(включая и анализ распределения изотопов); изотопная масс-спектрометрия.
Необходим жёсткий анализ соответствия ныне действующей нормативно-правовой базы современным требованиям контроля подлинности и безопасности напитков (в общем случае всех пищевых продуктов), введение в ТР новых подходов, концепций, методов обеспечения и контроля токсикологической безопасности ПП для жизни и здоровья граждан России. Намерение России вступить в ВТО требует обеспечить соответствие разрабатываемых ТР международным требованиям.
От острых отравлений АП в России ежегодно умирает до 50 тысяч человек. Это ставит задачу расширенного контроля ее безопасности и качества в ряд важнейших отечественных национальных проблем безопасности жизнедеятельности.
Этанол вырабатывается из пищевого или не пищевого сырья методами спиртового брожения либо гидратации этилена с последующей перегонкой и ректификацией. АП из пищевого этанола (ПЭ): этиловый питьевой спирт, спиртные напитки, вино. Применение синтетического этанола (СЭ) и гидролизного этанола (ГЭ) из непищевого сырья для их приготовления запрещает Федеральный закон от 22.11.95 № 171-ФЗ "О государственном регулировании производства и оборота этилового спирта, алкогольной и спиртосодержащей продукции". Ответственность за его нарушение регламентирована Федеральным законом от 08.07.99 № 143-ФЗ. Таким образом, существуют правовые нормы регулирования производства и оборота этилового спирта, алкогольной и спирто-содержащей продукции. Эффективное их соблюдение возможно лишь при наличии методов однозначной идентификации этанола в отношении сырьевой основы (ПЭ, СЭ или ГЭ). Важность проблемы особо возросла в связи с прекращением 01.01.02 г. действия Федерального закона от 31.03.99 № 61-ФЗ "О временном запрете импорта этилового спирта", поскольку дешевый импортный СЭ высокой степени очистки, декларируемый как ПЭ, стал ещё более широко использоваться для производства фальсифицированной АП. Необходим пересмотр норм и правил контроля АП, разработка и введение в обязательные сертификационные схемы новых методик и алгоритмов идентификации сырьевой природы этанола и ненормируемых токсических примесей, характерных для новых технологий его получения.
Основной объект исследования настоящей работы - напитки, в первую очередь - алкогольная продукция , поскольку из медицинской статистики следует, что до 70 % острых и хронических отравлений, значительная доля потери трудоспособности и ранняя смертность граждан России тесно связаны с потреблением АП (рис.1).
Начиная с 1992 года и до последнего времени к числу причин, определяющих рост алкогользависимой заболеваемости и смертности в Российской Федерации, относят увеличение потребления населением суррогатов алкоголя, а также образцов незаконно произведенной и некачественной алкогольной продукции. Среди представителей медицины, в кругу экспертов, политиков, журналистов и в обществе в целом существует стойкое убеждение в
том, что одна из главных причин отравлений алкоголем, связана с употреблением низкокачественных и нелегально произведённых алкогольных напитков.
Рис.1 Изменение показателей в % к 1984г.=100% ( 38 ).
Для примера, в официальном документе «Итоги деятельности
Государственной санитарно-эпидемиологической службы Министерства здравоохранения РФ по надзору за производством, реализацией спиртов и алкогольной продукции в Российской Федерации за 2002 год» сообщается, что «...Уровень потребления алкоголя в России на душу населения в год является одним из самых высоких в мире. При этом, не менее четверти от этого объема составляет токсичный, фальсифицированный алкоголь, часто технический и не предназначенный для потребления людьми...... В качестве еще одной
иллюстрации можно привести Материалы расширенного заседания экспертов Государственной думы, Совета Федерации, Торгово-промышленной палаты РФ, Федеральных министерств и ведомств, органов власти субъектов РФ, участников алкогольного рынка на тему: «Проблемы алкогольного рынка России» от 29 октября 2002 года. На странице 7 части 2 этого документа утверждается, что «...Отравления алкоголем и смерти от случайных отравлений в подавляющем большинстве случаев являются результатом потребления алкогольных напитков, произведенных нелегально, т.е. незаконно...». Не удивительно, что в средствах массовой информации обыденными являются словосочетания «токсичный
суррогат», «токсичный фальсификат» или утверждения типа того, что все смертельные отравления алкоголем в том или ином регионе России спровоцированы употреблением некачественной водки.
%40
*
»
-,18
3 .
!0
Россия Германия Франция Дания Бельгия
Финляндия Норвегия Швеция Австрия Нидерланды
Рис. 2 Алкогольная смертность в десяти странах Европы в 1995г. (доли
алкогольной смертности в обшей с 15 лет) ( 38 ).
Квадраты — регистрируемое потребление; кружки — оценка реального
потребления; числа — ожидаемая продолжительность жизни мужчин.
Согласно результатам работы, проведенной в НИИ скорой помощи им. Н.В.Склифосовского, в которой методом газовой хроматографии исследовали жидкости вызвавшие отравление, большая часть образцов этих жидкостей представляла качественные алкогольные напитки, а меньшая часть - являлась водками низкого качества (превышение требований ГОСТ по содержанию альдегидов, высших спиртов, эфирных масел, ацетона). И, наконец, незначительная часть образцов, представленных на исследование в стандартной упаковке из под вино-водочной продукции, содержала помимо этанола значительные количества метанола, ацетона, этиленгликоля, высших спиртов
или других растворителей. Иными словами большая часть отравлений была обусловлена передозировкой алкоголя (Белова М.В. и соавт., 1999).
По данным Центра лечения острых отравлений Санкт-Петербурга в 1991 году в стационары города с диагнозом отравление алкоголем и его суррогатами было госпитализировано 859 человек, в 1993 году - 2863 и в 1994 - 2040
Разработка, апробация, отбор и использование новых подходов и методик любого уровня сложности для обеспечения контроля токсикологической безопасности ( а также и подлинности! ) напитков - одна из важнейших национальных задач, прямо соответствующая трём проблемам критических технологий РФ « Безопасность и контроль качества с/х сырья и пищевых продуктов », «Производство и переработка с/х сырья », « Системы жизнеобеспечения и защиты человека ». Создание широкого спектра новых методик - от интегральных методов экологической токсикологии, основанных на биотестировании, до наиболее информативных инструментальных методов количественного химического анализа (изотопного, элементного, компонентного) для дифференциальной идентификации токсикантов - первый и наиболее сложный этап на пути её решения.
Важной областью контроля АП является контроль виноградных вин (регион производства винограда, год производства вина, выявление шаптализации, натуральности и т.д.).Для этих целей в Европе используют методику SNIF-NMR, которая требует полного извлечения этанола из вин. Из-за этого она недостаточно экспрессна и неэкономична. Можно использовать в этом случае разработанную нами методику, акцентируя внимание на содержание 2Н в вине. Хотя типичный спектр ЯМР Н вина при содержании этанола около 10% об. позволяет получить сигналы групп СНг и СНз этанола за разумное время эксперимента (около часа), их интенсивность недостаточна для точного измерения их площадей. Сигнал 2Н воды в этих спектрах имеет, как и должно быть, намного большую интенсивность, т.к. содержание воды в вине более 90% мол. Интенсивность этого сигнала можно измерять с погрешностью ~ 1% отн. за 10-20 мин.( спектрометры с частотой от 300МГц, ампулы 10 мм.).Повышенная чувствительность аппаратуры и цифровая обработка спектров позволяет проводить диагностику вина и по сигналам 2Н этанола.
Цель работы - исследовать воздействие различных видов этанола на живой организм и метаболизм этанола при различных концентрациях и при наличие активных добавок, провести критический анализ существующей практики и новых тенденций в области техники контроля напитков и их сырья, разработать новые и усовершенствовать известные методики для создания надежных комплексных схем и алгоритмов контроля их безопасности, качества, подлинности. Поставленная цель определила следующие задачи: -На основе анализа публикаций и опыта отечественных и международных организаций сформулировать с учетом специфических особенностей России наиболее актуальные проблемы в анализе напитков.
-Разработать и опробовать в лабораторных условиях новые надежные, экспрессные и экономичные подходы, методы и алгоритмы комплексного контроля безопасности, токсичности, качества и подлинности напитков.
Исследование токсичности различных видов этанола и особенностей его метаболизма в зависимости от концентрации и физиологических особенностей организма
По статистическим данным, из 6 пьянствующих человек, 2 становятся хроническими алкоголиками. Это происходит , конечно, не мгновенно, но обязательно происходит.
В настоящее время практически окончились споры о том, является алкоголизм болезнью или проявлением элементарной распущенности нравов. Доказано, что «Алкоголюм» - это хроническая, прогрессирующая, болезнь характеризующаяся потерей контроля при употреблении алкоголя, в которой различают несколько стадий заболевания с характерными для каждой стадии признаками. Алкоголизм был официально признан болезнью в 1956 году. Отметим, что на первой стадии болезни в крови еще не появляется в заметных количествах уксусный альдегид, токсичный для организма.
Негативные изменения в нервной системе и (главным образом!) в печени - это уже вторая стадия. Гематоэнцефалический барьер не является надежным барьером для небольших по размерам молекул спирта и некоторое его количество поступает в мозг. Основігую часть поступившего спирта нервные клетки направляют в спинномозговую жидкость. Многолетние исследования показали, что алкоголь и продукты его распада вмешиваются в процесс обмена веществ, протекающий в нервных клетках.
Проведённые в последнее время исследования о действии на человека малых доз алкоголя, дали в руки медиков неоценимые по важности материалы. Установлено, что любая доза спиртного, сколь бы мала она ни была, оказывает влияние на живой организм и (в первую очередь!) на центральную нервную систему. В частности, после принятия малой дозы алкоголя, составляющей примерно 60 граммов, угнетается правое полушарие мозга человека, которое "отвечает" за принятие решений. Что означает это угнетение? Прежде всего, у человека заметно увеличивается время для обработки информации, биотоки мозга значительно изменяются, что ведет к раздражению, а затем и угнетению нервной системы. Паралич психических центров, прежде всего, сказывается на тех процессах, которые называются суждением и критикой. Наблюдения показывают, что выпившие не становятся умнее и развитее, и если они думают иначе, то это зависит от начавшегося ослабления высшей деятельности их мозга - по мере того, как слабеет критика, нарастает самоуверенность.
Механизм действия алкоголя —"короткое замыкание" в мозгу. Состояние абстиненции (синдром похмелья) обусловлено высокой концентрацией ацетальдегида.
Вторая стадия характеризуется также началом поражения печени. По количеству больных циррозом определяют уровень алкоголизации в стране. Различают три нарастающие по тяжести формы патологии печени при алкоголизме: жировую дистрофию, алкогольный гепатит и цирроз.Начальная стадия распада этанола осуществляется главным образом в печени под воздействием фермента алкогольдегидрогеназы, который превращает алкоголь в ацетальегид. Затем ацетальдегид разносится током крови по всем органам и тканям, где происходят его дальнейшие химические превращения до воды и углекислого газа. На второй стадии заболевания отмечается падение активности фермента алкогольдегидрогеназы и снижение спиртоутилизирующей функции клеток печени.Это приводит к жировому перерождению печени (жировой гепатоз), который со временем прогрессирует в алкогольный гепатит и на третьей стадии - в неизлечимый цирроз печени.
Важнейшая причина гибели алкоголиков — цирроз печени. Проходя через печеночный барьер, этиловый спирт отрицательно влияет на печеночные клетки, которые под влиянием разрушительного действия этого ядовитого продукта погибают. На их месте образуется соединительная ткань, или попросту рубец, не выполняющий печеночной функции. Печень постепенно уменьшается в размерах, т.е. сморщивается, сосуды печени сдавливаются, кровь в них застаивается, давление повышается в 3-4 раза. Эти изменения называются -цирроз печени. Алкогольный цирроз печени - одно из наиболее тяжелых и безнадежных в смысле лечения заболеваний человека. По данным ВОЗ, около 80% больных умирает течение года после первого печеночного кровотечения.
Алкоголь оказывает также токсическое действие на яички и яичники. Под влиянием злоупотребления алкоголем наблюдается жировое перерождение семенных канальцев и разрастание соединительной ткани в паренхиме яичек у лиц, страдающих алкоголизмом.
Антиалкогольный иммунитет российской нации за последние десятилетия оказался подавленным и в последнее время Россия ,к великому сожалению, вышла на первое место в потреблении алкоголя.
Проблема алкоголизации населения усугубляется использованием в алкогольной продукции технических спиртов ( синтетического, полученного чисто химическим путём, и гидролизного, полученного брожением гидролизатов непищевого сырья ) и денатурированных спиртов ( пищевых спиртов, содержащих денатурирующие добавки, исключающие возможность использования их в пищевых и медицинских целях ) появилась в 70-е годы и актуальна до сих пор.
Если бы спирт очищался до критериев химически чистого продукта ( до класса « особо чистый, то есть практически не содержащий примесей ), то проблем с его использованием не было бы: спирт он и есть спирт.
Все биологические эффекты определились бы токсичностью и санитарно-гигиенических характеристик собственно спирта как химического вещества. Но получать сверхчистый спирт для приготовления алкогольных напитков экономически нецелесообразно ( по крайней мере в настоящее время ). Веками проверено, что алкогольные напитки, полученные дистилляцией ( или иным способом ) продуктов брожения качественного пищевого сырья, при их умеренном употреблении особой опасности организму человека не представляют. А вот использование некачественного ( а особенно не пищевого ! ) исходного сырья представляет реальную угрозу здоровью и безопасности жизни, так как при неполной очистке спирт содержит большое количество опасных примесей. Эти-то примеси и могут явиться причиной тяжёлых отравлений, при использовании технических спиртов в пищевой промышленности и медицине.
Определение общей суммарной токсичности примесей в АП
Перед различными государственными организациями стоит постоянная задача определения качества пищевых продуктов. В настоящее время при этом чаще используются физико-химические методы анализа. Известно, что современные аналитические методы позволяют определить минимальное количество токсического соединения в образце. К таким системам относятся различные физико-химические методы (газожидкостная хроматография, ЯМ?, масс-спектрометрия и др.). Однако всем этим методам присущи существенные недостатки: громоздкость аппаратуры, высокая стоимость анализа и необходимость в специальной подготовке кадров. Физико-химические методы контроля загрязнения являются слишком дорогостоящими и сложными для проведении массовых анализов необходимых при мониторинге пищевых продуктов. Кроме того, какое бы развитие эта техника не получила в дальнейшем, нельзя получить ответ на основной вопрос - насколько опасно количество ксенобиотика и особенно смеси различных и часто неизвестной природы токсических веществ для жизнедеятельности высших организмов.
Учитывая это обстоятельство, в США уже в начале 80-х появились законы Federal Water Pollution Control Act (1972) и Toxic Substances Control Act (1976), затем и в Европе [ European Pharmacopeia, 2n ed., Maisonneuve, Sainte-Ruffe,
1980, Chapter V.2.I.5.], которые утвердили механизмы определения токсичности любых образцов. Тесты, основанные на биологических объектах, включались в общую аналитическую процедуру обязательно как первичные методы оценки общей токсичности отдельных компонентов и их смесей. Поэтому в развитых странах в обязательном порядке предусматривается тестирование с использованием чувствительных к токсикантам живых организмов (в основном пресноводные или морские организмы - простейшие, рыбы и т.д.). Большинство этих анализов очень длительны по времени (24 часа и более), требуют большого количества анализируемого материала и субъективны в оценке, поскольку требуют подсчета процента погибших организмов.
Сравнительная оценка различных типов биологических систем, проведенная в последнее десятилетие, позволила выделить из множества биосенсоров один, в значительной степени свободный от перечисленных недостатков. Морские люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждения (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат) с экспрессностыо, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие ксенобиотиков. Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую зффективігую трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений. Отклик люминесцентных бактерий на токсические вещества полностью коррелирует с таковым у других биологических организмов и величина 50%-ного тушения свечения ЕС50 полностью коррелирует с величиной LD50 для высших растений и человека [110,111], а также с другими биосенсорами.
В ряде стран на основе морских светящихся бактерий производятся аналогичные биосенсоры под различными торговыми марками. Так известен норматив Германии на использование ЛЕОМинесцентных бактерий в токсикологии (DK 628.1/3:620.1:543.39, март 1991г.). В России производятся тест-системы на основе морских и пресноводЕіьіх светящихся бактерий. Реакция люминесцентного биосенсора сравнивалась многократно с откликом других биологических систем.
Поскольку биосенсор реагирует на токсические соединения самой разЕЮобразЕюй химической природы, т.е. характеризуется широким спектром анализируемых веществ и внешних факторов, он успешно используется в качестве первичного метода при исследовании на токсичность водных вытяжек из объектов окружающей среды, новых химических веществ, материалов и изделий. В случае определения факта токсичности производится дальнейшее исследование другими методами для установления ее природы. Возможно не только быстро и экономно определить токсичность, но и выяснить другие важные свойства объекта: стабильность, токсичность продуктов деградации и способность к биоаккумулироваїЕИіо.
Культуры тканей животных, О6ЫЧЕЕО используемые для определения токсичности веществ, имеют определеЕЕЕіьіе ЕЕедостатки: длительность теста, большая чувствительность к технологии, высокой стоимостью оборудования и проведения теста. Необходимость быстроты, низкой стоимости и стандартизации метода побуждает внедрять методики с использованием биолюминесцентных бактерий.
Люминесцентный бактериальный тест - это комплект реагентов с биолЕоминисцеЕгпюй активностью в комплексе с люминометрами специального назначеЕшя. Введение в реакционную смесь пробы с токсическим соединением вызывает спад свечения (типичный отклик биосенсора на действие токсического соединения или их смеси представлеЕі на рисунке 3).
Степень токсичности образца (Т) вычисляется измерителыЕым прибором по формуле Т=(1о-1)Ло где 1о и I соответствеЕЕЕЕО ИЕІТЄНСИВЕЕОСТЬ свечения контрольной и опытной проб.
Специальная светорегистрирующая аппаратура позволяет измерить ИЕЕТЄІЕСИВНОСТЬ свечения реагента до и после введения неизвестного токсиканта в образце небольшого объема (0,2-0,5 мл). Экспресс-анализ занимает 5 минут,
МОЕЕИТОрИЕЕГ ВОЗМОЖЄЕІ В ПОЛЄВЬІХ УСЛОВИЯХ.
Биосенсор интегрирует эффекты смесей токсикантов, обеспечивая общий индекс ТОКСИЧЕЕОСТИ образца. Тем самым метод предпочтителеЕі в качестве первичЕЮго теста и способеЕЕ быстро ответить на вопрос: присутствуют или нет в среде токсические агеЕЕты в опасЕЕой для живого организма концеЕітрации.
Мониторинг образцов с ПРИМЄЕЕЄЕЕИЄМ биосеЕЕСора и аппаратуры, выпускаемой в России ориентирован на использоваЕЕие реаетивов и сервисЕЕых приспособлеіЕий исЕШЮчительно отечественного производства.
Интегральный анализ изотопов углерода
Жидкостно-сцинтилляционная спектрометрия. Одним из наиболее экзотических и эффективных методов выявления ферментативных ( пищевой гидролизный ) и синтетического спиртов является определение содержания радиоактивных минорных изотопов С и Н ( тритий ) в спиртовых композициях. Входящие в состав этанола атомы углерода, всегда имеют растительное происхождение: в ферментативных ПЭ и ГЭ — из современных растений, в СЭ — из ископаемых, превратившихся в нефть и газ. Если радиоактивные изотопы водорода и кислорода в природе отсутствуют, то радиоуглерод 4С и Н3 (тритий) постоянно образуется в верхних слоях атмосферы под действием быстрых нейтронов. Это обуславливает присутствие С и Н в живой материи. Радиоактивность углерода в ПЭ и ГЭ оценивается в 14-15 распадов на 1 грамм углерода в мшг/ту. В СЭ она должна отсутствовать. В природе углерод и водород представлены рядом изотопов, в том числе и радиоактивными С14 и Н3 с периодами полураспада соответственно 5730 лет и 12,26 лет. Содержание указанных выше " чистых " (5 - излучателей в растениях и полученных из них ферментативных спиртах соответствует их содержанию в атмосфере и изменяется год от года незначительно. В ископаемых материалах ( нефти, газах ), из которых получают синтетические спирты, за миллионы лет их формирования изотопный состав существенно изменился и содержание С14 и Н3 практически упало до нуля.
По содержанию С14 в образцах различных спиртов (методом жидкостно-сцинтилляционной спектрометрии) можно определить к каким типам спиртов они относятся: ферментативным или синтетическим, а также какова в растворе доля ферментативного и синтетического спиртов.Это наглядно иллюстрируется результатами проведённых нами пробных измерений активности С14 ряда спиртов, изготовленных из различного вида сырья.
Число р-частиц, излученных в миігуту, для образца синтез-спирта характеризует фоновую составляющую. Видно, что радиоактивность пищевых и гидролизных спиртов существенно превосходит таковую синтетических. Это подтверждает также значение для смешанной пробы.
Анализ погрешностей измерений при доверительном уровне 0,95 позволяет заключить, что использованная методика позволяет выявить присутствие синтез-этанола в пищевом только при содержании первого 20 % и более, а технический гидролизный и пищевой этим методом неразличимы.
Поэтому рассмотренный метод может быть привлечён для решения практических задач при условии значительного совершенствования аппаратурно-методической базы, снижения погрешностей в 5 и более раз и при условии проведения скрининга представительного массива образцов спиртов достоверно известного происхождения. Масс-спектрометрия изотопных отношений .
Проведен анализ (совместно с проф. A.M. Зякуном) этанолов из разного сырья методом МСИО углерода (табл.15). Основу методики составляет измерение различий в соотношении природных содержаний стабильных изотопов 12С и 13С. Если известен состав углерода модельных этиловых спиртов, то по составу углерода смеси легко вычислить соотношение компонентов. Без учёта возможных вариаций изотопных соотношений в этанолах однородной сырьевой природы погрешность пробоподготовки и непосредственно измерений не превышает ± 0,5 % об.
Анализ серии смесей ПЭ и СЭ показал (табл.16), что надёжное определение синтетического компонента в ПЭ возможно при содержании его 10 % и выше. Из полученных результатов следуют заключения:
- гидролизный этанол и пищевой из зерна методом МСИО практически неразличимы;
- индивидуальный синтетический этанол надёжно идентифицируем;
- смеси этанолов из кукурузы или сахарного тростника с синтетическим могут иметь содержание С , характерное для зернового пищевого сырья, используемого традиционно в России.
Благодаря высокой точности измерений метод МСИО очень ценен для доказательства изотопной аутентичнтношения известных компонентов. Однако, его использование для идентификации этанолов неизвестного генезиса необходимо дополнять результатами иных аналитических процедур, в частности, разработанных нами и рассмотренных ниже.
Метод ядерного магнитного резонанса ( ЯМР ) позволяет измерять интенсивности сигналов избирательного поглощения энергии электромагнитного поля любыми ядрами, спин которых не равен нулю. Для регистрации количественных спектров ЯМР с высокой точностью вещество не нужно как-то модифицировать. Этанол и его водные растворы вообще не требуют никакой пробоподготовки. Недостаток метода ЯМР - его не очень высокая чувствительность, что создаёт принципиальные трудности количественного анализа изотопного распределения ядер с очень низким содержанием Это требует точности измерения интенсивностеи отдельных сигналов в спектрах ЯМР 13С 0,5 % и выше и стало возможным на рутинной аппаратуре лишь в последние несколько лет. Как сказано выше в начале 80-х годов профессор Мартен (Нант, Франция ) создал и впоследствии внедрил в практику анализа аутентичности, то есть подлинности напитков ( вин, соков и этанола, получаемого из них ) метод измерения селективного распределения дейтерия в различных положениях молекул с помощью ядерного магнитного резонанса, названный им SNIF-NMR.3TOT метод нашёл широкое применение для решений многообразных прикладных задач диагностики ( или идентификации, контроля, выявления) технологической, ботанической и географической природы веществ, композиций, купажей. На базе метода SNIF-NMR нами была создана и опробована практически приемлемая для реального контроля методика для выявления природы этанола в крепких алкогольных напитках и спиртовых купажах (смесях, композициях).
