Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Химия хитина и его производных. проблемы и перспективы технологий их получения и использования 9
1.1. Химическая структура и принципы получения хитина и его производных 9
1.2. Физико-химические свойства и практическое использование хитина и его производных 20
1.3. Состояние вопроса о сырьевых источниках хитина 30
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 35
2.1. Определение степени дезацетилирования (СД) 35
2.2. Определение характеристической вязкости растворов хитозана 36
2.3. Определение зольности 38
2.4. Определение белка 38
2.5. Исследование ИК-спектров хитина и хитозана 40
2.6. Определение концентрации ионов металлов Си +, Zn +, Cd , Pb , Mn в воде 40
2.7. Методика исследования антибактериальных свойств хитозана 43
2.8. Методика калориметрических измерений 43
2.8.1. Конструкция калориметра 43
2.8.2. Методика проведения калориметрического опыта 46
2.9. Статистический анализ 49
ГЛАВА 3. Разработка метода получения хитина и хитозана из гриба вешенка обыкновенная 50
ГЛАВА 4. Идентификация хитозана, полученного из гриба вешенка обыкновенная 63
ГЛАВА 5. Теплоемкость и термодинамические характеристики хитина и хитозана. Термодинамика процесса синтеза хитозана из хитина 66
ГЛАВА 6. Исследование возможности извлечения из воды некоторых примесей хитозаном из вешенки обыкновенной .72
6.1. Исследование адсорбции ионов тяжелых металлов хитозаном из вешенки обыкновенной 72
6.2. Исследование антибактериальной активности хитозана из вешенки обыкновенной 76
ГЛАВА 7. Обсуждение результатов 81
Выводы 90
Библиографический список 92
Приложение 107
- Физико-химические свойства и практическое использование хитина и его производных
- Определение концентрации ионов металлов Си +, Zn +, Cd , Pb , Mn в воде
- Идентификация хитозана, полученного из гриба вешенка обыкновенная
- Исследование адсорбции ионов тяжелых металлов хитозаном из вешенки обыкновенной
Физико-химические свойства и практическое использование хитина и его производных
В настоящее время проявляют внимание к хитину и хитозану как к одному из природных высокомолекулярных нетоксичных полисахаридов, что связано с общим развитием химии полисахаридов и синтетических полимеров (Neel І.Д965), а также с тем, что хитин и его производное хитозан, обладая спектром уникальных физико-химических свойств и биологической активностью нашли применение во многих направлениях практического применения (Быков В.П., 1977; Милушева Р.Ю. и др.,1991; Тютерев С.Л. и др., 1994; Албулов А.И. и др., 1999; Горяйнов Г.И. и др., 1999; Феофилова Е.П. и др., 1999; Гальбрайх Л.С.,2001).
Большой интерес представляет свойство полимеров растворяться в воде, так как концентрированные, высоковязкие растворы могут быть применены в качестве мазевых основ при изготовлении лекарственных составов и косметических кремов, а также концентрированные растворы хитозана обладают хорошими адгезионными свойствами, ярко выражены бактерицидные свойства растворов (March L.E., Giauque W.F., 1962). Избирательная адсорбционная способность хитозана обусловлена образованием связей между гидроксильными, аминными и ацетамидными группами его макромолекул с функциональными (или полярными) группами молекул органических веществ. Эти связи более прочны, чем их водородные связи с молекулами воды (Косарев А.В. и др., 1995; Арнетт Э.М., 1967). Полярные органические вещества могут прочно адсорбироваться на хитине, хитозане и их производных (Косарев А.В. и др., 1995; Chen R., 1995; Weltrowski М., et al., 1995). Эти биополимеры обратили на себя внимание ученых почти 200 лет назад. Хитин был открыт в 1811 году (H.Braconnot, A.Odier), а хитозан в 1859 году (C.Rouget), хотя свое нынешнее название получил в 1894 году (F.Hoppe-Seyler). В первой половине 20 века к хитину и его производным был проявлен заслуженный интерес, в частности к нему имели непосредственное отношение три Нобелевских лауреата: E.Fischer (1903 г.) - синтезировал глюкозамин, P.Karrer (1929 г.) - провел деградацию хитина с помощью хитиназ, и, наконец, W.N. Haworth (1939 г.) установил абсолютную конфигурацию глюкозамина.
В России работы по хитину и хитозану активно начались в начале 70-х годов и в настоящее время переживают настоящий бум. Достигнутый уровень отечественных разработок сравним с мировым, а в ряде случаев превосходит известные зарубежные работы. В настоящее время известно более 70 направлений использования хитина и его производных в различных отраслях промышленности (Быков В.П., 1977), наиболее важными из которых во всем мире признаны:
Пищевая промышленность - используется в качестве загустителя и структурообразователя для продуктов диетического питания (Кайминып И.Ф., 1999), способствующих выведению радионуклидов из организма, для создания простых и многокомпонентных эмульсий, соусов, паст, съедобных колбасных оболочек, осветления пива, соков, вин, для предотвращения ухудшения аромата пищевых продуктов (Knorr D., Daly М., 1988; Knorr D., 1984). Медицина - для лечения ран (заявка 63-190821 Япония; патент МКИ А 61 Бельгия; патент № 3903268 США), ожогов, язв (патент МКИ 167-55 США) производства хирургических нитей (Hirano Sh. et al., 1985), искусственной кожи (заявка 63-4541 Япония), лекарственных форм антисклеротического, антикоагулянтного (Horton D., Just Е.К., 1973; Fukuda Н., Kikuchi Y., 1977) и антиартрозного действия, диагностики и лечения злокачественных опухолей (Hirano Sh., Ohe Y., 1975), язвы желудка (патент МКИ 167-55 США), хитозан улучшает всасывание и эффективность труднорастворимых лекарственных форм, способствующих их пролонгированному действию; хитозан эффективен при лечении парадонтоза и кариеса зубов (Тюпенко Г.И. и др., 1989), в качестве средства борьбы с ожирением, связывания и выведения из организма холестерина, профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний; лечения заболевания костей (заявка 63-156726 Япония), влияет на некоторые факторы коагуляции крови (Fukuda Н., Kikuchi Y., 1978; Hirano S. et al., 1985); в качестве заменителя гиалуроновой кислоты для хирургии глаза (Hirano S., 1986).
Фармацевтическая промышленность постоянно испытывает потребность в расширении ассортимента вспомогательных веществ, обладающих одновременно формообразующими и фармакотерапев-тическими свойствами. Одним из таких веществ является карбоксиметилхитозан, выгодно отличающийся от хитозана способностью растворяться в гидрофильных средах и сохраняющий при этом его такие важные качества, как биосовместимость и биоактивность. Специфика применения гидрогелей для лечения ожогов и вялотекущих ран обусловливает предъявляемые к ним требования: адекватные сорбционные свойства, пластичность, стерильность, гидрофильность, а также отсутствие раздражающего и общетоксического действия на организм (Лившиц B.C., 1988). В полной мере перечисленным требованиям отвечает карбоксиметиловый эфир хитозана (Краками Г., 1986). В результате микробиологических исследований установлено, что гидрогели карбоксиметилхитозана оказывают антимикробное действие, величина которого существенно не зависит от концентрации карбоксиметилхитозана (Крафт Л.А. и др., 1999). При этом, показано, что эффект антимикробного действия проявляется тотчас с момента контакта гелей с микроорганизмами, а наибольшее антимикробное действие гидрогели оказывают на дифтероиды и грибы рода Кандида.
Косметика - использование в качестве увлажнителя, эмульгатора, антистатика и смягчающего средства для ухода за волосами и кожей лица (заявка № 3703760 ФРГ; заявка № 3715576 ФРГ; заявка 61-254517 Япония), при производстве шампуней (заявка № 2597335 Франция, заявка 62-138418 Япония; заявка № 62-221615 Япония; заявка № 63-165307 Япония), гелей, лака для ногтей (заявка № 3537333 ФРГ; заявка № 3723911 ФРГ), увлажняющих кремов, мыла (Идзумэ М., 1989), тональной жидкой пудры, зубных паст (заявка № 61-151112 Япония), в качестве стабилизатора аромата духов.
Сельское хозяйство - в качестве биостимулятора, обеспечивающего повышение урожайности овощей на 25-40% (заявка № 53-127824 Япония; заявка № 63-139102 Япония), средства борьбы с нематодами почв в закрытых грунтах (патент W 086/04586, ЕПВ), стеблевой и корневой гнилью, ржавчиной (заявка № 54-41326 Япония; заявка № 62-198604 Япония), специальные покрытия для фруктов, увеличивающих сроки их хранения, кормовая добавка с хитозаном, повышающая резистентность животных к инфекционным заболеваниям (Sikakis J.P., 1988), стимулятор роста растений (заявка № 63-33310 Япония), как противовирусное средство (заявка № 53-59027).
Определение концентрации ионов металлов Си +, Zn +, Cd , Pb , Mn в воде
Определение концентрации ионов металлов в водных растворах проводили методом атомно-абсорбционной спектрометрии (Ермаченко Л.А., 1997). В основе метода лежит эффект резонансного поглощения излучения определенной длины волны (так называемой резонансной линии) свободными атомами определяемого элемента при прохождении этого излучения через атомный пар исследуемого образца. Атомы элемента, находящиеся в невозбужденном стабильном состоянии, способны селективно поглощать световую энергию определенной длины волны, переходя из основного состояния в возбужденное. Поглощение света свободными атомами описывается законом Бугера-Ламберта-Бера, который можно записать в виде: - интенсивность падающего излучения, - интенсивность излучения, прошедшего через поглощающий слой толщины - в, С - концентрация определяемого элемента в поглощающем слое, А оптическая плотность поглощающей среды (абсорбция).
При фиксированной толщине поглощающего слоя и выбранной для данного элемента длине волны проходящего излучения величина абсорбции линейно зависит от концентрации определяемого элемента. Определение ионов металлов в воде проводили на атомно-абсорбционном спектрометре «Сатурн ЗП-1».
В мерную колбу 100 см помещали анализируемую порцию подкисленной пробы, содержащей 0,2-1 мг металла для установления анализируемых пределов каждого элемента. Доводили до метки водой. Проводили измерение при условиях, соответствующих определяемому элементу (табл. 1). Параллельно проводили измерение холостой пробы, в которой анализируемая порция заменена водой. Перед каждой серией определений готовили для каждого исходного раствора не менее 4 градуировочных растворов, охватывающих диапазон определения концентраций для каждого элемента. Эти градуировочные растворы готовили разбавлением исходных растворов HN03 = 0,03 моль/дм . Для каждого определяемого металла распыляли серию градуировочных растворов, а в качестве нулевого - холостой раствор. Строили графически зависимости содержания металлов в мг/дм3 градуировочных растворов на оси абсцисс и соответствующие значения величины абсорбции на оси ординат. По калибровочному графику определяли для каждого элемента концентрации, соответствующие величинам абсорбции анализируемой пробы и холостой пробы. Для каждого определяемого элемента концентрацию, выраженную в мг/дм определяли по формуле: 100-(СІ-С0) абсорбции холостой пробы,(мг/дм ), V объем подкисленной пробы, отобранной для анализа, (см3).
Для исследований использовали суточную культуру представителей наиболее распространенной условно патогенной флоры - кишечной палочки Escherichia coli и стафилококка эпидермального Staphylococcus epidermidis. Штаммы этих микроорганизмов были выделены из фекалий и отделяемого влагалища практически здоровых людей. Готовили взвесь бактерий на физиологическом растворе ( 0,9% NaCl ) концентрацией в 5 ед. (500 млн микробных клеток на мл). Из исходной взвеси проводили десятикратное разведение и для опыта использовали концентрации микробных клеток в 5 тыс клеток/мл, 50 тыс клеток/мл и 5 млн клеток/мл. В контрольную пробирку хитозан не добавляли, а в опытной пробирке хитозан находился в соотношении 1:100 (5 мл взвеси микробных клеток + 50 мг хитозана). Через 5 часов, 1 сутки и 2 суток инкубации при комнатной температуре (при периодическом встряхивании) из опытной и контрольной пробирок делали мерные высевы на чашки с мясопептонным агаром. Через 2 суток культивирования при 37С в аэробных условиях оценивали количество микроорганизмов (количество колонии образующих единиц, КОЕ).
Калориметрические измерения проводили на калориметре с адиабатической оболочкой, смонтированном на кафедре общей химии Алтайского государственного медицинского университета по типу калориметра СМ. Скуратова (Скуратов СМ., Колесов В.П. и др., 1966). Термохимическая экспериментальная часть работы была выполнена совместно с сотрудниками лаборатории термохимии НИИ Химии при НГГУ им. Н.И. Лобачевского. Калориметр позволяет при несложной технике эксперимента измерять тепловые эффекты изучаемых процессов с точностью - « 3% (Иванов А.В., 1996), достаточной для задач данной работы. Схема калориметра приведена на рис. 2 и 3.
Идентификация хитозана, полученного из гриба вешенка обыкновенная
В то же время, ряд ученых, анализируя современные данные, сделали вывод о том, что растительный и животный хитин идентичны (Банникова Г.Е. и др., 1988; Kurita К., et al., 1975; Cabib Е 1984; Sannan Т. et al., 1987). Этот вывод основан на сведениях о химическом составе, удельном весе, удельном вращении плоскости поляризации и периоде идентичности при рентгеноструктурном анализе. Отдельными и немногочисленными исследованиями установлено, что хитин из грибов, в частности, из грибов вида вешенка обыкновенная (Pleurotus ostreatus) из семейства Трихоломовые, или Рядовковые (Tricholomataceae) , порядка Пластинчатые, или Агариковые (Aqaricales), класса Базидиомицеты (Basidiomycetes), отдела Грибы (Mycota), сходен по своим физико-химическим свойствам с хитином ракообразных (Феофилова Е.П. и др., 1980). Поэтому нам представлялась весьма привлекательной возможность разработки экологически чистой многоцелевой биотехнологии получения хитина и его производных из отходов легко выращиваемого в теплицах гриба вешенка обыкновенная.
Сопоставление данных о составе клеточной стенки, структуре и свойствах хитина грибов рода Вешенка (Пинече-Ковас К. и др., 1984) с аналогичными данными о панцирях морских ракообразных (Нудьга Л.А. и др., 1971) свидетельствовало о необходимости и возможности использования в разрабатываемом методе уже известных и научно обоснованных технологий извлечения хитина и получения из него хитозана. В связи с этим, на первом этапе разработки методики решалась задача выбора из известных методик наиболее оптимальной технологии получения этих полисахаридов из классического сырья - панцирей морских ракообразных, и получения с ее использованием хитина и хитозана из грибов вешенка обыкновенная. На втором этапе решалась задача изменения методики, взятой за основу, в соответствии с особенностями качественного и количественного состава используемого сырья.
На всех этапах разработки методики получения хитина и хитозана в качестве критериев оптимальности условий служили показатели чистоты (наличие белковых, минеральных и пигментных примесей, СД), сохранности полимерной структуры (молекулярная масса, СП) хитозана, а также его выход относительно теоретического. Полученный нами по классической методике препарат хитозана из вешенки обыкновенной имел характеристики не вполне соответствующие общепринятым стандартам качества (низкую СД, высокое содержание пигментов, недостаточную дисперсность, повышенную жесткость и др.). Это было связано с тем, что исходное сырье отличалось от традиционного. Панцирь краба содержит около 20% хитина, 40%, белков, 30% минеральных солей, тогда как грибы вешенка содержат хитина в 3-4 раза больше, но значительно меньше белков и минеральных солей. Поэтому, данная методика выделения хитина и хитозана нами была существенно изменена.
Были проведены дополнительные исследования по влиянию времени щелочного гидролиза на содержание белка, влиянию времени экспозиции в растворе кислоты на содержание золы в хитине, влиянию концентрации перекиси водорода на процесс обесцвечивания хитина из гриба вешенка; по замене метанола на этанол; влиянию температуры, времени дезацетиллирования на значение СД, содержание белка, золы в хитине, характеристическую вязкость растворов хитозана. При модификации методики в качестве критериев оптимальности условий служили показатели чистоты (наличие белковых, минеральных и пигментных примесей), СД, сохранности полимерной структуры (молекулярная масса, степень полимеризации) хитозана, а также его выход относительно теоретического. В результате проведенных экспериментов была разработана оптимальная технологическая схема получения хитина и хитозана из вешенки обыкновенной, а также полученный нами по разработанному методу препарат хитозана по органолептическим и физико-химическим свойствам соответствовал общепринятым стандартам качества (Ленинджер А., 1976). Практический выход хитина из отходов производства вешенки обыкновенной составил 4,75-6,25% от массы сырья, а выход хитозана из хитина - 82-85% от теоретически возможного. Мы провели идентификацию полученных хитина и хитозана. Из данных исследования элементного анализа следует, что для хитозана из вешенки обыкновенной характерно такое же соотношение углерода, водорода и азота, как и для хитозана из краба камчатского и рачка гаммаруса, и оно близко к вычисленному по формуле хитозана соотношению этих элементов. Как известно, хитозан из морских ракообразных отличается от хитина более низким содержанием углерода и более высоким содержанием азота (в хитине С - 47,3%; Н - 6,4%; N -6,9%) (Muzzarelli R.A.A., 1977). Эта особенность, как оказалось, свойственна и хитозану из вешенки обыкновенной. Анализ ИК-спектров хитина и хитозана, выделенных из вешенки обыкновенной, показал, что их основные характеристики, отражающие наличие отдельных химических групп также совпадают с таковыми для хитина и хитозана, полученными для этих биополимеров из других источников (Foster, Webber, 1960).
Наши исследования указывали на возможность промышленного получения хитина и хитозана из вешенки обыкновенной, которая в отличие от традиционного сырья, является экологически чистым сырьем, воспроизводство которого легко управляемо, возможно в любое время года в разных регионах. Однако, переход от всякого экспериментального производства к промышленному возможен лишь после научного обоснования условий основных звеньев процесса, исследования возможности их варьирования. В связи с этим, для прогнозирования протекания процесса синтеза хитозана в различных условиях, разработки в последующем оптимальных технологических схем его промышленного производства, а также для проектирования необходимых для этого конструкций, была исследована теплоемкость хитина и хитозана, рассчитаны их термодинамические функции.
Исследование адсорбции ионов тяжелых металлов хитозаном из вешенки обыкновенной
Преимуществами использования хитозана для очистки или доочистки воды является его множественный эффект: он одновременно снижает содержание всех загрязняющих воду примесей. Поэтому, несмотря на достаточно высокую стоимость хитозана, технологии очистки воды с его использованием рассматриваются как реальная альтернатива традиционным методам очистки сточных вод промышленных предприятий, открытых водоемов и др. (Кириллова Л.Н. и др., 1999; Коновалова И.Н. и др., 2000; Bade ML.,Wick R., 1987; Sievers D.M., 1989; патент Франция).
Примечательно, что это направление практического использования интенсивно развивается, несмотря на малую изученность механизмов извлечения хитозаном из воды столь широкого спектра разнообразных по структуре примесей. В связи с этим, мы исследовали антибактериальную активность хитозана, а также адсорбцию им ионов тяжелых металлов.
В исследовании использовали водные растворы катионов цинка, свинца, меди, кадмия и марганца. После экспозиции хитозана с водными растворами исследованных катионов металлов концентрация последних существенно снижалась. Снижение было особенно значительным для ионов цинка, свинца и кадмия. Даже при исходных концентрациях этих катионов в 5-10 раз превышающих ПДК после сорбции их оставалось меньше, чем допустимо стандартами для питьевой воды (менее 1 ПДК). В ранее проведенных нами экспериментах с хитозаном, полученным из рачка Gammarus, мы наблюдали сходные результаты.
Таким образом, хитозан, полученный из вешенки обыкновенной, обладает высокой сорбционной способностью в отношении катионов многих тяжелых металлов, что позволяет прогнозировать его эффективное использование наряду с хитозаном из традиционного сырья в качестве адсорбента для очистки питьевой воды.
Совместно с сотрудниками кафедры микробиологии Алтайского государственного медицинского университета мы провели исследования антибактериальных свойств хитозана из вешенки обыкновенной. Для исследований были выбраны представители наиболее распространенной условно патогенной флоры - стафилококк эпидермальный (Staphylococcus epidermidis) и кишечная палочка (Escherichia coli). Штаммы этих микроорганизмов были выделены из фекалий и отделяемого влагалища людей.
Исследования показали, что экспозиция хитозана как с Е. coli, так и со S. epidermidis приводила к значительному уменьшению количества бактерий относительно контрольных проб на протяжении 5-48 часов эксперимента. Это указывает на то, что хитозан из вешенки обыкновенной обладает выраженной антибактериальной активностью, продемонстрированной многочисленными исследованиями и для хитозана из морских ракообразных (Rhoades J., Roller S., 2000; Sano H., Shibasaki R., 2001).
Механизм выявленного феномена может быть связан как с бактерицидным эффектом хитозана, так и с адсорбцией им микроорганизмов. На вклад адсорбции в антибактериальное действие хитозана указывают результаты исследования зависимости антибактериальной активности полимера от количества микроорганизмов в инкубационной среде. Эта кинетическая особенность, как известно, типична для адсорбционных процессов. Отметим, что на адсорбционный механизм антибактериальной активности хитозана указывают и данные Sano et al. (2000), согласно которым при взаимодействии этого полисахарида с микроорганизмами во взвеси не появлялось каких-либо компонентов бактериальных клеток, т.е. не происходило разрушения последних.
Таким образом, хитозан из вешенки обыкновенной обладает высокой антибактериальной активностью в отношении представителей грамотрицательных и грамположительных условно-патогенных бактерий, которые могут быть реальными компонентами воды открытых водоемов в случае их антропогенного загрязнения. Поэтому он может быть использован для очистки питьевой воды не только от тяжелых металлов, но от микроорганизмов.
Полученные в работе данные позволяют заключить, что получение хитина и хитозана из отходов промышленного производства вешенки обыкновенной является целесообразным с точки зрения экологической безопасности, поскольку позволяет сократить ущерб, наносимый массовым отловом морских ракообразных, рационально использовать отходы экологически чистого промышленного производства грибов вешенка, дает возможность получать биодеградабельные полимеры, широко используемые в различных областях хозяйственной деятельности человека, в частности, для очистки воды от токсичных примесей (рис. 17)
Результаты работы создают научную основу для промышленного получения хитина и хитозана из вешенки обыкновенной и широкого их использования наряду с хитином и хитозаном из традиционного сырья.
