Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 8
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 15
1.1 Общая характеристика пектиновых веществ и флавоноидов
растительной клетки 15
Пектиновые вещества растительной клетки 18
Красящие вещества высших растений 30
Дубильные вещества растений 46
1.2. Механизмы микробной деградации пектина растительной клетки 50
1.2.1.Характеристика ферментов, расщепляющих пектиисодержащее сырье....52
Микроорганизмы - продуценты ферментов пектолитического комплекса 58
Роль неполитических ферментов в физиологических процессах
у высших растений 69
1.2.4. Биосинтез пектолитических ферментов у микроорганизмов 77
1.3. Биотехиологическая деградация отходов растительного сырья 84
1.3. і .Использование псктолитических ферментов при выделении и осветле-
нии плодово-ягодных соков и для улучшения сокоотдачи 84
1.3.2. Выделение биопектина из отходов плодово-ягодного сырья 92
1.4. Выделение пишевых красителей и таннина из отходов растительного
сырья 111
Природные и синтетические красители I И
Способы выделения натуральных пищевых красителей 113
Использование красителей в различных отраслях народного хозяйства 120
Роль фенольных соединений как витаминов и пищевых добавок 123
Способы выделения дубильных веществ 125
1.5. Использование пектолитических ферментов при биологической мо
чке льна 129
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 132
Микроорганизмы, используемые для биотехнологической утилизации отходов растительного сырья 132
Условия хранения исследуемых микроорганизмов 134
Питательные среды и условия культивирования микроорганизмов 134
Условия культивирования дрожжей Zygofabospora marxiana BKMY-848 135
Выращивание грибов вусловиях глубинной ферментации 136
2.4. Ферментные препараты, используемые при утилизации отходов расти
тельного сырья 137
Методы определения активностей ферментов 137
Определение активности антибиотиков , 139
# 2.7. Основные методы предварительной обработки растительных субстра-
тов 139
2.8. Методы биохимического, физико-химического иорганолептического
анализов отходов растительного сырья 143
Определение влажности сырья ускоренным методом на приборе Чижовой 143
Метод определения содержания сухих веществ в растворах с использованием рефрактометра 144
Определение зольности методом сжигания 144
2.8.4.0пределение кислотности 144
Определение титруемой кислотности 144
Определение восстанавли вающих Сахаров 144
Определение содержания гемицеллюлозы 144
# 2.8.8. Определение содержания пектиновых веществ 146
2.8.9. Определение общего азота по Несслеру 147
2.8.10. Определение белка по методу Лоури 147
2.9. Приготопленне гелей для гель-хроматографии и заполнение колонок 148
Приготовление ДЭАЭ-целлюлозы 148
Приготовление сефадексов 148
Приготовление и заполнение колонок 148
Приготовление и нанесение образца на колонку 149
Определение молекулярных масс разделяемых веществ 150
2.10. Техника проведения гель-хромато['рафии в тонком слое 150
2.10.1. Выделение белка при изоэлсктричеекой точке 151
2.11. Анализ полученного плодово-ягодного пектина „151
2.11.1. Определение растворимости, % по массе 151
2.1 1.2.Определение массовой доли свободных и метоксилированных карбо
ксильных групп 152
2.11.3. Определение массовой доли пектовой кислоты 153
2.1 1.4. Определение массовой доли балластных веществ. 154
Определение рН 1%-ного раствора пектина 155
Определение температуры гелеобразования 1% раствора 155
Сорбция солей тяжелых металлов 155
2.12. Анализ полученных красителей и таннина 156
2.12.1. Определение количества красящих веществ в натуральных пище
вых красителях 156
2.12.2. Определение абсолютно сухого вещества в красителе (весовой
метод) 157
2.12.3. Калориметрический метод определения содержания флавоноидов....158
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 159
ГЛАВА 3. Биосинтез ферментов пектолитического комплекса у дрожжей Zygofabospora marxiana ВКМ Y-848 и получение очищенного препарата
эндополигалактуроназы 159
3.1. Получение пектиновых сиропов 160
3.2. Использование различных пектиновых сиропов в качестве компонен
тов питательной среды при биосинтезе дрожжевой эндополигалактуро
назы 161
3.3. Изучение влияния количества вносимого цитрусового пектинового
сиропа на активность полигалактуроназы у Zygofabospora marxiana
и Aspergillus foetidus 171
3.4. Влияние времени культивирования на накопление полигалактуроназы
на средах с цитрусовым пектином. 179
3;5. Выделение и очистка внеклеточной эндополигалактуроназы из дрож
жей Zygofabospora marxiana 187
З.б.Определение изоэлектрической точки внеклеточной эндополигалакту
роназы, выделенной из дрожжей Zygofabospora marxiana '. 194
3.7.0пределение аминокислотного состава внеклеточной эндополигалакту
роназы, выделенной из дрожжей Zygofabospora marxiana 197
ГЛАВА 4. Использование ферментов пектолитического комплекса
при осветлении соков, полученных из отходов плодово-ягод
ного сырья. 198
Характеристика используемого сырья 199
Выбор микроорганизмов - продуцентов неполитических ферментов, используемых при обработке плодово-ягодного сырья 201
Разработка условий использования эндополигалактуроназы при осветлении соков, полученных из отходов плодово-ягодного сырья 204
4.3.1.Влияние дозы фермента на выделение сока из отходов яблочной, сморо
диновой и виноградной мезги 205
4.3.2. Влияние температуры и времени ферментативной обработки на выделе
ние соков из отходов плодово-ягодного сырья 218
ГЛАВА 5. Изучение возможности получения пектина из отходов плодово-
ягодного сырья микробиологическим путем 245
5.1. Подготовка сырья для получения пектина 246
5.2. Характеристика комплекса ферментных препаратов, используемых
при гидролизе отходов плодово-ягодного сырья , 248
5;3. Получение плодово-ягодных пектинов 250
5.4. Получение пектинов из отходов плодово-ягодного сырья при использо
вании мультиэнзимных комплексов пектолитических ферментов 255
5.5. Изучение возможности интенсификации условий выделения пектинов
при энзиматической конверсии растительных отходов 258
5.6. Физико-химические, органолептические и биохимические свойства вы
деленных пектинов 262
5.7. Исследование функциональных свойств пектинов.. 265
ГЛАВА 6. Получение антоцианового красителя и таннина из отходов растите
льного сырья микробиологическим путем 268
Кукуруза как источник антоцианового красителя 270
Характеристика продуцентов ферментных препаратов, используемых
при обработке отходов кукурузы 271
6.3. Изучение возможности получения красителя из отходов кукурузы при
использовании мультиэнзимных препаратов культуральной жидкости
микроорганизмов-продуцентов 272
6.4. Изучение условий интенсификации выхода красителя при фермента
тивной обработке сырья 276
Влияние рН на увеличение выхода и качество красителя 276
Влияние температуры на выход красителя и на изменение интенсивности окраски 278
Влияние дозы ферментного препарата на выход красителя 281
Влияние времени выдерживания на интенсивность красителя 283
6.5.Биохимическая, физико-химическая и органолептическая характерис
тика выделенного красителя 286
6.6. Получение растительного красного пигмента при использовании отече
ственных и зарубежных ферментных препаратов 288
Подбор экстрагента для выделения красящих веществ из кукурузы 288
Выделение красящих веществ из кукурузы при комплексной обработке кислотами и цитратом натрия лимоннокислым 289
6.6.3.Выделение красителя из шрота при действии ферментных препаратов..290
6.6.4. Последовательная обработка кукурузного шрота ферментными препа
ратами «Пектинекс 5X-L» и «Целловиридин Г20Х» 291
Последовательная обработка кукурузного шрота ферментными препаратами «Пектофоетидин П10Х» и «Целловиридин Г20Х» 295
Совместное действие ферментных препаратов «Целловиридин Г20Х»
и «Пектофоетидин П10Х» ....297
6.7 Получение таннина из отходов кукурузы микробиологическим путем 299
ГЛАВА 7. Использование дрожжевой эндополигалактуроназы в процессе
мочки льна.... '. 303
Определение качества воды, используемой при мочке льна 305
Биологическая мочка льносоломы при использовании пектолитичес-
ких ферментных препаратов 306
Влияние продолжительности основной биологической мочки льна на выход и качества льноволокна 307
Влияние температуры мочки льна на выход и качество льноволокна...314
7.3. Биологическая мочка льна при многократном использовании мочиль
ной жидкости 322
ВЫВОДЫ 325
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 329
Введение к работе
Анализ информации о состоянии окружающей среды свидетельствует о том, что в настоящий момент заірязнение стало обыденным словом, хотя на самом деле это актуальная и очень сложная проблема. Организм человека оказался неспособным приспособиться к изменениям в природе, что привело к напряжению его адаптационных и биохимических механизмов, вплоть до изменения нормального его функционирования.
Несовершенство технологических процессов, отрицательное воздействие производства на окружающую среду привело к неправильному использованию огромного количества сырья, изымаемого из природной среды, т.к. в конечный продукт превращается в среднем лишь 1,5-2,0%, основная же его масса переходит в производственные и бытовые отходы, из которых только лишь 3% используется в качестве вторичного сырья. Поэтому разработка научных основ рационального использования растительных отходов, снижение их экологической опасности - одна из проблем общества, в решении которой может помочь использование живых организмов или их составных частей в практических целях.
Ограниченность сырьевых ресурсов и экологически вредные для человека изменения в природе ставят вопрос о разработке научно - обоснованной комплексной и экологически безопасной технологии переработки вторичного сырья и необходимости создания производства нового поколения пищевых продуктов, сбалансированных по главным составляющим компонентам: белкам, углеводам, жирам, ферментам и другим биологически активным веществам. Поэтому проведение исследований энзиматических и микробиологических превращений с целью создания безотходных и экологически безопасных технологий деградации растительного сырья и их отходов с использованием пектолитических ферментов для более эффективного использования полезных свойств растительного сырья, устранения дефицита питания и энергии, улучшения качества продуктов и охраны окружающей
среды является актуальной в настоящее время.
Эти обстоятельства требуют внимательного рассхмотрения вопросов по изучению биотехнологии деградации плодово-ягодного сырья и их отходов при использовании пектолитических ферментов в пищевой промышленности, в частности, консервной и соковой промышленности, в виноделии при осветлении соков и улучшении сокоотдачи, производстве пектинов — биологически активной добавки к пище, при получении пищевых красителей и таннинов.
В связи с расширением спроса на пектолитические ферменты, актуальными являются исследования, направленные на изучение физиолого-биохимических особенностей роста дрожжей, синтез фермента, получение и очистку дрожжевой полигалактуроназы, не имеющей сопутствующей пектинэстеразы, а также разработка рациональных способов предварительной обработки сырья, повышение ферментативного гидролиза, использование различных микробных ассоциаций для деградации растворимых субстратов, получение высококачественных продуктов, биологически активных добавок к пише.
Цель м задачи исследования. Целью настоящей работы является теоретическое и экспериментальное обоснование биотехнологических основ деградации отходов растительного сырья ферментами пектолитического комплекса при осветлении соков и улучшении сокоотдачи, получении плодово-ягодных пектинов, пищевых красителей и таннинов, биологической мочке льна.
В задачи исследований входило:
изучение биохимического состава отходов плодово-ягодного сырья;
выбор дрожжей Zygofabospora marxiana как продуцента, обеспечивающего достаточно максимальный уровень биосинтеза полигилактуроназы; подбор оптимальной среды и режимов культивирования; получение высокоочищенного ферментного препарата, изучение физико-химических свойств полученного препарата;
— изучение возможности использования дрожжевой полигалактуроназы при
осветлении соков и улучшении сокоотдачи;
— выделение пектинов - биологически активной добавки к пище
ферментативным путем из отходов плодово-ягодного сырья;
— разработка способа выделения пищевых красителей и таннинов из отходов
кукурузы;
— изучение возможности использования п оли гал акту рон азы при мочке
неиспользованной льносоломы;
Рассматриваемые проблемы решались в соответствии с программой «Биотехнология» УНЦ РХТУ им. Д. И. Менделеева «Влияние экологических факторов на качество пищевых продуктов и пищевых добавок на основе микробного синтеза и разработка более совершенных стандартов контроля качества этих продуктов»; с Межведомственной инновационной программой «Биотехнология для медицины и агропромышленного комплекса»; программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники»; проекта «Новые эффективные биотехнологические процессы микробного синтеза ферментов, антибиотиков, белково-жировых кормовых компонентов и других биологически активных соединений», предложенного ВНИИ Биотехнологии.
Научная новизна. В представленной диссертационной работе научно обоснована и экспериментально доказано:
перспективность биодеградации отходов плодово-ягодного сырья, получение на их основе ценных продуктов, а также разработка процессов утилизации отходов, снижение вредных воздействий на окружающую среду;
впервые выделена и очищена дрожжевая полигалактуроназа из Zygofabospora marxiana ВКМ Y-848, выращенная на среде, содержащей пектиновые гидролизаты конкретного вида сырья, проведена очистка данного препарата и изучены свойства очищенных препаратов;
впервые изучена возможность использования дрожжевой
полигалактуроназы при обработке отходов плодово-ягодного сырья, осветлении соков и увеличении скорости фильтрации соков;
впервые на основании выявленных зависимостей выхода пектина от действия активного комплекса пектолитических ферментов разработана технология выделения ферментативным путем при использовании дрожжевой полигалактуроназы пектинов, антоцианового красителя и таннинов;
впервые обоснована и доказана возможность использования дрожжевой эндополигалактуроназы при мочке льна.
Практическая значимость работы. Проведенные исследования явились основой для решения эколого-биологических задач по совершенствованию комплексной переработки различного плодово-ягодного сырья и их отходов при использовании микроорганизмов и ферментных препаратов микробного: происхождения. Наряду с получением ценных продуктов, автором одновременно решаются вопросы снижения загрязнения окружающей среды отходами растительных субстратов и токсичными продуктами их деструкции:
даны рекомендации по оптимизации биосинтеза дрожжевой полигалактуроназы с использованием в качестве компонента питательной среды пектиновых гидролизатов;
даны рекомендации по поддержании культуры длительное время в активном состоянии;
получен высокоочищенный препарат дрожжевой эндополигалактуроназы и изучены его свойства;
показана возможность использования дрожжевой эндополигалактуроназы при осветлении соков и увеличении скорости их фильтрации; выделении пектинов, антоциановых красителей и таннинов. Технологическая новизна предложенных технологий подтверждена патентами;
разработаны способы обработки льносоломы с использованием дрожжевой полигалактуроназы.
Разработанные в результате исследований представления о процессах деградации- отходов растительного сырья вносят существенный вклад в научные и практические основы создания экологически безопасных технологий и производства чистых продуктов.
Результаты исследований микробных сообществ культивирования, получение препарата способствуют дальнейшему расширению представлений о механизмах протекающих реакций при деградации растительного сырья, пектиновых субстратов, продуктов их разложения, будут полезны практикам, занимающимся вопросами пищевых технологий, получением пищевых и биологически активных добавок.
Теоретические и прикладные положения работы нашли конкретное воплощение в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий в Московском Государственном Университете пищевых производств, а также изложены в учебном пособии «Теоретические основы биотехнологии. Биохимические основы синтеза биологически активных веществ» для студентов высших учебных заведений по специальности «Биотехнология», в монографии «Биотехнологическая деградация отходов растительного сырья», в ряде изданных методических указаний, используются в курсовых и дипломных проектах и работах.
Значимость работы дважды подтверждена дипломами 1-ои степени по номинации «Биологически активная добавка» на выставке-конкурсе Министерства образования РФ, Министерства промышленности, науки и технологий РФ, МГУПП.
Основные положения, выносимые па защиту:
— теоретические положения процессов биоконверсии и деструкции
растительных отходов с использованием монокультур и микробных
ассоциаций;
— результаты исследований по биосинтезу полигалактуроназы дрожжами
Zygofabospora marxiana ВКМ Y-848, выращенными на средах, содержащих
пектиновые гидролизаты отходов конкретного вида сырья, очистке фермента и изучению его свойств;
— результаты по изучению возможности использования дрожжевой
полигалактуроназы, при увеличении сокоотдачи и осветлении соков;
выделение пектина из отходов растительного сырья при использовании ферментов пектолитического комплекса;
получение пищевого антоцианового красителя и таннина: из отходов кукурузы;
— возможность использования пектолитических ферментов при мочке
льносоломы.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на следующих конференциях: Всесоюзная конференция «Микроорганизмы в сельском хозяйстве», г.Москва, 1986 г.; на научных конференциях МГУПП, 1994-2004 гг.; научно-практической конференции «Биотехнология в ФЦП «Интеграция», г.Санкт-Петербург, 1999 г,; научной конференции, посвященной 300-летию создания г.Санкт-Петербурга, г.Санкт-Петербург, 2002 г.; выставке-конкурсе «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации», г.Москва, 2002 г., 2003 г.,2004 г.; Международной практической конференции по сертификации и переводу предприятий на международные системы управления, г.Москва, март 2003 г.; Второй Международной практической конференции «Обязательные требования в сфере обращения лекарственных средств (нормативное обеспечение)», октябрь 2004.
По материалам выполненных исследований опубликовано 38 работ, поданы 2 заявки, на оформление патентов, опубликованы 2 книги, 2 справочника.
Результаты работы, изложены в трудах конференций, журналах «Микробиология», «Ферментная и спиртовая промышленность», «Доклады АН СССР», серия биологическая, «Пищевая промышленность», «Хранение и
переработка сельскохозяйственного сырья», «Труды ВНИИФС», «Труды «Микроорганизмы в сельском хозяйстве»; в двух кратких справочниках по иммунопрепаратам, в: книге «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК», в сборнике научных трудов «Технологии и техника пищевых производств. Итоги и-перспективы развития на. рубеже XX и XXI веков», в> сборниках трудов МТИПП, МГУПП; в учебном пособии УМО по образованию в области химической технологии и биотехнологии издательства «Элевар» (Москва), методических указаниях к выполнению лабораторных работ по разделам «Биологически активные вещества» издательства МГУПП;
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 365 страницах, включающих 92 таблиц, 100 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследований, 7 глав собственных исследований, выводов, списка литературы, включающего 384 источника.
