Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время в мире наблюдается растущий интерес к использованию психрофильных и психротолерантных микроорганизмов в биотехнологии (Margesin, Schinner, 1994; Russell, 1998; Gerday et al, 2000; Lettinga et al, 2001; Margesin et al., 2003; Liu et al, 2011). Показано, что психрофильные и психротолерантные микроорганизмы представляют интерес с точки зрения защиты растений (Subramanian et al., 2011), биоремедиации в условиях низких температур (Gratia et al, 2009), поиска низкотемпературных ферментов (Gerday et al., 2000; Siddiqui and Cavicchioli, 2006; Feller, 2013). До сих пор основными источниками психрофильных и психротолерантных изолятов остаются Антарктика и Арктика (Kotsyurbenko, 2005; Кочкина и др., 2007; Wang et al., 2009; Ganzert et al., 2011), в отдельных случаях - альпийские почвы (Zhang et al., 2010). Исследования, проведённые в Красноярском государственном аграрном университете, показали, что карстовые пещеры Средней Сибири являются уникальным природным источником психрофильных и психротолерантных бактерий и грибов (Хижняк и др., 1999, 2001, 2003, Нестеренко, 2007; Хижняк, 2009). Показано, что психрофильные и психротолерантные бактерии сибирских пещер представляют большой практический интерес для сельскохозяйственной биотехнологии в качестве безопасного для теплокровных биологического средства защиты растений от болезней при низких температурах начала вегетационного периода (Хижняк и др., 2009; Ланкина, 2010; Илиенц, 2011). Присутствие психрофильных и психротолерантных микроорганизмов отмечено также в пещерах Урала (Кузьмина и др., 2012).
Однако карстовые пещеры, сходные по своим физико-химическим, микроклиматическим и геологическим характеристикам с пещерами Сибири и Урала, широко распространены практически по всей территории бывшего Советского Союза. В этой связи представляется актуальным провести сравнительное изучение эколого-биологических характеристик бактерий, входящих в состав микробных сообществ карстовых пещер разных регионов, а также сравнить потенциал этих сообществ в качестве источника психрофильных и психротолерантных штаммов с потенциалом холодных поверхностных и подземных вод.
Целью настоящего исследования является сравнительное изучение эколого-биологических характеристик бактерий, входящих в состав микробных сообществ низкотемпературных пещер Сибири, Дальнего Востока и Западного Кавказа.
Основные задачи:
-
Изучить влияние температуры на скорость роста бактерий, входящих в состав микробных сообществ пещер Сибири, Дальнего Востока и Западного Кавказа.
-
Изучить влияние температуры на скорость роста бактерий, входящих в состав микробных сообществ холодных поверхностных и подземных вод Красноярского края.
3. Сравнить таксономический состав психрофильных и
психротолерантных бактерий в пещерах Средней Сибири, Дальнего Востока,
Западного Кавказа и в холодных поверхностных и подземных водах
Красноярского края.
4. Сравнить потенциал изучаемых пещерных сообществ и сообществ
холодных поверхностных и подземных вод в качестве источников
психрофильных и психротолерантных штаммов для сельскохозяйственной и
экологической биотехнологии.
Научная новизна. Впервые показано присутствие психрофильных и психротолерантных бактерий в пещерах Западного Кавказа и Дальнего Востока и определён уровень их генетического сходства с известными видами. В составе автохтонной микробиоты пещер Сибири обнаружены представители родов, ранее в пещерах региона не отмечавшиеся (p.p. Flavobacterium, Pedobacter, Janthinobacterium). Впервые проведено сравнительное изучение влияния температуры на скорость роста психрофильных и психротолерантных бактерий, выделенных из пещер Средней Сибири, Западного Кавказа и Дальнего Востока. Установлено, что по температурным кривым роста психрофильные и психротолерантные бактерии пещер Западного Кавказа и Дальнего Востока аналогичны бактериям из сибирских пещер.
Установлено, что биологическое разнообразие психрофильных и психротолерантные бактерий, выделяемых из низкотемпературных поверхностных и подземных вод, существенно ниже, чем в пещерных экосистемах.
Продемонстрирована возможность использования психрофильных и психротолерантных бактерий, выделенных из пещер Западного Кавказа и Дальнего Востока, в качестве биофунгицидов для защиты зерновых культур от корневых гнилей и альтернариоза в условиях Сибири. Из пещер Красноярского края, Западного Кавказа и Дальнего Востока выделены 11 психрофильных и психротолерантных бактериальных штаммов, проявляющих высокую антагонистическую активность в отношении одновременно представителей p.p. Alternaria, Bipolaris и Fusarium.
Защищаемые положения:
1. В карстовых пещерах Западного Кавказа и Дальнего Востока присутствуют
адаптированные к низким температурам бактерии, по своим экологическим
особенностям аналогичные бактериям, населяющим пещеры Сибири, однако
отличающиеся от последних по таксономическому составу.
2. Биологическое разнообразие психрофильных и психротолерантных
бактерий, выделяемых из низкотемпературных поверхностных и подземных
вод Красноярского края, ниже, чем в исследуемых пещерных экосистемах.
3. Бактериальные сообщества пещер Западного Кавказа и Дальнего Востока
наряду с сообществами пещер Сибири могут быть использованы в качестве
источника штаммов для биологической борьбы с гельминтоспориозом, фузариозом
и альтернариозом в условиях континентального климата, характерного для
России.
Практическое значение работы. Выделенные из пещер штаммы, проявляющие антагонизм в отношении фитопатогенных грибов pp. Alternaria, Bipolaris и Fusarium, используются в работах в рамках трёхстороннего Соглашения о научно-техническом сотрудничестве между Beihang University (Beijing University of Aeronautics and Astronautics, Пекин, КНР), Красноярским государственным аграрным университетом и Сибирским государственным аэрокосмическим университетом имени академика М. Ф. Решетнёва в области разработки биологических методов защиты растений в биорегенеративных системах жизнеобеспечения и в условиях закрытого грунта от 20.10.2011 (Справка от 25.05.2012). Штаммы L1-2 и UOZK-2 (в соавторстве с к.б.н. Ланкиной Е.П., д.б.н. Хижняком СВ.) депонированы во Всеросийской коллекции промышленных микроорганизмов, г. Москва (регистрационные номера Ас-1832 и В-10596 соответственно) и в настоящее время проходят процедуру патентования в качестве основы препаратов для биодеградации органических отходов антропогенного происхождения при низких температурах в условиях пещер (штамм L1-2) и для защиты зерновых культур от корневой гнили и листовой пятнистости (штамм UOZK-2). Углеводородокисляющие штаммы НЗа, НЗб, Н5, Н6 использованы в работах по биологической деструкции полиэтилена в рамках российско-китайского проекта "Исследование микроорганизмов и механизма биодеградации полиэтилена в связи с разнообразием микробных популяций на примере пищеварительного тракта Sitotroga cerealella (Olivier)" (отчёт по гранту 10-08-91157-ГФЕНа), а также в работах по биологической ремедиации загрязнённых мазутом почв пос. Кедровый Емельяновского района Красноярского края (Справка от 05.06.2012). Выделенные из низкотемпературных экосистем Средней Сибири, Западного Кавказа и Дальнего Востока изоляты психрофильных и психротолерантных бактерий используется в преподавании дисциплины "Биотехнология" для специальностей 110102, 110203 на кафедре защиты растений и биотехнологии ФГБОУ ВПО КрасГАУ (Акты внедрения от 5.09.2011).
Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Материалы исследований были представлены на: XII Международной научной школе конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (Абакан, 2009); II (Омск, 2010, 1-е место) и III (Краснодар, 2010, 6-е место) этапах Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди студентов, аспирантов и молодых ученых Минсельхоза РФ; XL VIII Международной научно-студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2010); IV Международной научной конференции молодых ученых «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых» (Новосибирск, 2010); III Международной (заочной) научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные тенденции развития Российской науки» (Красноярск, 2010); Международной научно-практической конференции "Инновационные подходы в ветеринарии, биологии и экологии" (Троицк, 2010); II Международной
научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы науки и техники» (Уфа, 2010); конкурсе Красноярского регионального отделения Российского аграрного движения на «Лучший инновационный проект в сфере АПК» (Красноярск, 2010, лауреат); конкурсе инновационных работ «Лучший инновационный проект в сфере сельскохозяйственных наук» (Красноярск, 2010, 1-е место); Третьей и Четвертой общегородской ассамблеях «Красноярск. Технологии будущего» (Красноярск, 2010, 2011); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011); Международной научно-практической конференции «Аграрная наука - основа инновационного развития АПК» (Курган, 2011); 7-ой международной научно-практической конференции «Найновите постижения на европейската наука» (София, 2011); Международной заочной научной конференции «Проблемы современной аграрной науки» (Красноярск, 2011); 3-м Байкальском Микробиологическом Симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы и вирусы в водных экосистемах» (Иркутск, 2011); 39 COSPAR Scientific Assembly (Mysore, 2012).
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 191 страницах текста, содержит 98 рисунков и 12 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения, практических рекомендаций, выводов и списка литературы, содержащего ссылки на 223 источника, из которых 105 - на иностранных языках.
Личный вклад автора. Анализ образцов, эксперименты, обработка и интерпретация полученных результатов выполнены лично автором. Образцы из пещер и низкотемпературных источников Средней Сибири собраны автором. Образцы из пещеры Сарма предоставлены участниками исследовательской экспедиции "Арабика-2010" (спелеосекция СФУ и Красноярский спелеоклуб), из пещеры Снежная -СЕ. Мазиной (спелеосекция МГУ). Образцы из пещеры Кузнецовская и пещеры Лисья предоставлены к.б.н. Сидоровым Д.А. (Биолого-почвенный институт РАН, Дальневосточное отделение).
Секвенирование гена 16S рРНК бактериальных изолятов выполнено в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (г. Пермь), во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (г. Москва).
Благодарности. Работа выполнена при частичной поддержке РФФИ (грант 10-08-91157-ГФЕНа от 2010 г.). Автор выражает искреннюю благодарность д.б.н. СВ. Хижняку за методическое руководство, к.б.н. Сидорову Д.А. за образцы грунта из пещер Лисья и Кузнецовская, П.В. Рудко, В.В. Сухачеву, Н.В. Кинчиной и другим участникам экспедиции "Арабика-2010" за образцы грунта из пещеры Сарма, к.б.н. СЕ. Мазиной за образцы грунта из пещеры Снежная, к.с.-х.н. В.К. Пурлауру за помощь в сборе образцов для выделения фитопатогенных грибов, к.х.н. Романченко А.С. за помощь в проведении атомно-силовой микроскопии.
