Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Кадмий и цинк в системе «почва —растение» . 8
1.1. Кадмий и цинк в биосфере 8
1.2. Токсическое действие Cd и Zn иа растительные и животные организмы .13
1.3. Ответная реакция живых систем на поступление тяжелых металлов 15
Глава 2. Способы определения концентрации кадмия и цинка в почве и живых системах 24
2.1. Прямое определение металлов 24
2.2. Определение кадмия и цинка методами химического анализа 29
Глава 3. Объекты и методы исследования 39
3.1. Объекты исследования ..39
3.2. Методы исследования 43
Глава 4. Исследование комплексообразования кадмия и цинка с модельными л и га идам и, содержащими биологически значимые функциональные группы 51
4.1. Синтез комплексных соединений кадмия и цинка с модельными лиган-дами 51
4.2. Спектрофотометрическое исследование комплексов кадмия и цинка с модельными лигандами , 53
4.3. Исследование комплексообразования кадмия и цинка с модельными ли-гандами методом ВЭЖХ 54
Глава 5. Влияние поступления ионов кадмия и цинка в ткани растений различных видов на развитие растений 57
5.1. Элементный анализ пшеницы, выращенной на почве с повышенным содержанием кадмия 51
5.2. Выращивание и анализ растений различных видов (пшеница, ярутка, горох) на почве с повышенным содержанием кадмия 60
5.3. Выращивание и анализ растений различных видов (пшеница, ярутка, горох) на почве при одновременном внесении в почву кадмия и цинка...64
5.4. Сравнительное изучение металлоустойчивости дикорастущих растений семейства злаковые 74
5.5. Исследование металлосодержащих веществ в газообразных выделениях растений 76
Глава 6. Изучение комплексообразования кадмия и цинка с биологически активными веществами 80
6.1. Синтез комплексных соединений кадмия и цинка с биологически активными лигандами 80
6.2. Спектрофотометрическое исследование комплексных соединений кадмия с биологически активными лигандами 81
6.3. Хроматографическое исследование комплексов кадмия и цинка с биологически активными лигандами 83
Выводы 84
Список литературы 85
- Токсическое действие Cd и Zn иа растительные и животные организмы
- Определение кадмия и цинка методами химического анализа
- Синтез комплексных соединений кадмия и цинка с модельными лиган-дами
Введение к работе
Актуальность темы. Проблема химического отклика растений на токсическое действие тяжелых металлов пока слабо изучена. Выработанные в ходе эволюции механизмы предотвращения токсического действия тяжелых металлов, в том числе кадмия и цинка, оказываются недостаточными для защиты растений от высокого уровня этих металлов в почве. При сильном загрязнении почвы растения испытывают тяжелометальный стресс, вызывающий повреждение фотосинтетической системы и создающий условия для угнетения роста и развития растений и в конечном итоге для их гибели.
Накопление кадмия в пищевых и кормовых растениях и его миграция по пищевым цепям способны нанести реальный вред здоровью человека.
Реакция разных видов растений на повышенное содержание кадмия и цинка в почве неодинакова. Одни виды накапливают эти тяжелые металлы в значительных концентрациях без особого вреда для своей жизнедеятельности (гипераккумуляторы). Другие виды при относительно небольших концентрациях тяжелых металлов в почве перестают образовывать плоды и даже обнаруживают признаки некроза корней. При этом химическая природа таких различий остается малоисследованной. В этой связи интересен вопрос о возможности образования комплексных соединений кадмия и цинка с веществами, встречающимися в тканях растений и их экологической роли, так как именно такие соединения представляют собой химический ответ растительных организмов на повышенное содержание этих металлов в почве. Интересен также вопрос о способах выведения тяжелых металлов из растений, так как именно этот механизм, вероятно, помогает многим растениям адаптироваться к жизни в условиях загрязнения почвы тяжелыми металлами.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение экологической роли комплексообразования кадмия и цинка с биологически активными лигандами, встречающимися в растительных тканях. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить комплексообразование кадмия и цинка с модельными лиган-
дами, содержащими биологически значимые функциональные группы
методами физико-химического анализа.
^ 2. Вырастить растения разных видов на почвах с повышенным содержа-
нием кадмия, а также при одновременном внесении кадмия и цинка.
Проанализировать растения разных видов для изучения накопления тяжелых металлов в различных органах.
Обнаружить и изучить органические соединения, связанные с кадмием и цинком в тканях выращенных растений.
^ 5. Исследовать некоторые растения на предмет выделения тяжелых ме-
таллов через листья при транспирации,
6. Изучить комплексообразование кадмия и цинка с биологическими ли-
гандами, встречающимися в растительных тканях.
Научная новизна и практическая значимость работы. Среди результа
тов, полученных впервые, наиболее существенны следующие:
1. У растений разных видов эволюционно сформированы разные механизмы
защиты от избытка кадмия в почве: у злаковых функцию защитных агентов
выполняют вещества флавоноидной природы (пшеница - флавоноид три-
цин), у гороха посевного - соединения с сульфгидрильными группами, у
ярутки полевой - вещества, сочетающие сульфгидрильные и фенольные
группы, что и обеспечивает их различную устойчивость к данному тяжелому
металлу.
а 2. Показано, что в растениях комплексообразование с серусодержащими ли-
гандами играет роль фиксации кадмия, а с полифенольными соединениями -функцию транспортировки данного тяжелого металла по растению.
Наличие цинка в почве замедляет поток кадмия в растение, смягчая кадмиевый стресс.
Одним из путей вывода кадмия из растений является его выделение в виде газообразных кадмийсодержащих органических соединений.
Полученные научные результаты могут быть использованы в практике научных исследований различных НИИ СО РАН.
Положения, выносимые на защиту. Комплексообразование органических соединений с кадмием и цинком в растительных тканях играет важную роль в детоксчкации и выведении этих тяжелых металлов из растений, а также лежит в основе металлоустойчивости различных видов растений.
Апробация работы. Материалы исследований докладывались на IV Конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока - 2000», (Новосибирск, 2000), XIX Всероссийской школе-симпозиуме молодых ученых по химической кинетике, (Клязьма, 2001), на Международной конференции «Экология Сибири, Дальнего Востока и Арктики (ESFEA — 2001), (Томск, 2001), на II Школе-семинаре молодых ученых «Проблемы устойчивого развития региона», (Улан-Удэ, 2001), на Международной конференции по экологической ботанике, (Сыктывкар, 2002), на Первой международной научно-практической конференции «Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии», (Барнаул, 2002), на IX Рабочей группе «Аэрозоли Сибири», (Томск, 2002), на XI съезде Русского ботанического общества (Новосибирск-Барнаул, 2003), на Европейской аэрозольной конференции (Мадрид, Испания, 2003), на II Международной конференции «Окружающая среда и экология Сибири, Дальнего Востока и Арктики (EES-FEA — 2003) (Томск - 2003), а также на объединенных физико-химических семинарах ИХКиГ СО РАН и на семинарах лаборатории фитохимии ЦСБС СО РАН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов и списка литературы. Основной текст изложен на 91 странице. В работу включено 14 рисунков и 11 таблиц. Список литературы содержит 70 наименований, в том числе 20 иностранных.
Личный вклад соискателя в получении научных результатов заключается в постановке целей и задач, выборе методов исследования, сборе материала
и его анализе. Автор принимал участие в подготовке печатных работ и докладов.
Автор благодарит за всестороннюю помощь и ценные замечания к.х.н. Дуб-цова С.Н., к.ф.-м.н. Королева В.В., к.ф.-м.н. Глебова Е. М., к.ф.-м.н. Ковальскую Г.А., сотрудника ОИГГМ Палесского СВ.
Особую признательность автор выражает руководителям к.х.н Скубпевскои Г.И. и к.х.н. Дульцевой Г.Г.
Токсическое действие Cd и Zn иа растительные и животные организмы
Кадмий и в меньшей степени цинк являются одними из наиболее опасных для растений экотоксикантов. Повышенные концентрации тяжелых металлов могут приводить к общим, мало специфическим физиологическим и биохимическим изменениям. В каче стве наиболее общих проявлений стресса, обусловленного избытком тяжелых металлов, выделяют повреждение мембран, изменение активности ферментов, ингибирование роста корней. Эти нарушения ведут к целому ряду вторичных эффектов, таких, как гормональный дисбаланс, дефицит необходимых элемен тов, ингибирование фотосинтеза, нарушение передвижения фотоассимилятов, изменение водного режима и другие, которые, в свою очередь, усугубляют Щ торможение роста и развития растений (Устойчивость..., 1991). Наибольшие количества цинка поступают в живые организмы из водных объектов и с пищей. Избыток цинка вызывает у животных снижение содержания в печени меди, которая играет важную роль в метаболизме железа (Исидоров, 2001). Высокая токсичность кадмия выявлена на примере многих микроорга низмов, растений и животных. Для некоторых видов пресноводных водорослей ингибирование ассимиляции углерода на 70 - 80 % наблюдалось уже при кон центрации кадмия в воде 20 мкг/л. Самая низкая величина полулетальной кон центрации (при 96 - часовой экспозиции ) составила 16 мкг/л для одного из ви дов креветки (Mysidopsis bahia). Для дафний (Daphnia magna) токсические эф фекты проявлялись уже при концентрациях выше 0.5 мкг/л (Исидоров, 2001). Хроническое воздействие малых, порядка 10 мкг Cd /л, концентраций ин гибирует системы ионного транспорта у водных беспозвоночных и рыб. При этом снижается содержание ионов кальция в плазме крови, что объясняется ин-гибиругощим действием кадмия на фермент Са - АТФ-азу. При длительном (70 суток) нахождении гольяна (Phoxinus phoxinus) в воде с содержанием Cd 4.8-7.5 мг/л из 180 экземпляров выжил 101, причем у 31 из них были отмечены переломы задних отделов позвоночника.
Аналогичные эффекты наблюдаются и в случае воздействия кадмия на другие виды позвоночных животных. В этом отношении показательна история возникновения болезни итаи-итаи. Первые случаи заболевания были зарегистрированы в Японии в 1947 г., а к 1965 г. от нее погибло 100 человек, и еще большее число людей стали инвалидами. Болезнь начиналась с болей в спине и ногах, приводила к деформации скелета и множественным переломам костей. Возникала она у жителей, длительное время потреблявших рис с содержанием кадмия 1 мг/кг, выращиваемый на полях, в оросительные воды которых попадали загрязненные кадмием стоки промышленного предприятия. В условиях дефицита кальция при этом происходило его замещение на кадмий в белке кальмодулине, нарушение обмена кальция и фосфора в почках и последующее вымывание их из костей (Исидоров, 2001).
Токсичность небольших концентраций кадмия выявлена как для животных, так и для человека (Сидоренко, Ицкова, 1980; Гигиена...,1985; Гончарук, Сидоренко, 1986; Габович, Прилучина, 1987; Бандман и др., 1988; Elghany et al., 1990). Ряд исследователей (Садовникова, Зырин, 1985; Ягодин и др., 1989) указывают на то, что кадмий в 2 - 20 раз токсичнее для растений, животных и человека, чем другие металлы. Кадмий очень мобилен в органах растений, он способен концентрироваться не только в корнях и листьях, но, что наиболее опасно, в зерне (Holstead et al,, 1969; Welch, Сагу, 1975; Ильин, Степанова, 1980; Гармаш, 1985; Сингх, Ракипов, 1987; Юдинцева и др„ 1988; Калашникова, 1991). Так как через растениеводческую продукцию открывается пищевая цепь, то серьезную опасность представляют микроэлементозы животных и человека, а именно канцерогенез, кадмиевая кардиомиопатия, нарушение репродуктивной функции, работы почек, кишечного тракта и других систем (Михалева, Черняев, 1990; Авцын и др., 1991) (Барсукова, 1997).
Поступление тяжелых металлов в растительный организм представляют собой сложную проблему и являются дискуссионными (Smeyers-Verbeke et al., 1978; Ягодин и др., 1988; Глазовская, 1989). Попыткой их решения можно считать создание комплексных математических моделей (Pinsky et al., 1989; Пинский, Пачепский, 1991). Между содержанием подвижных форм кадмия и цинка в почве и их концентрацией в тканях растений не наблюдается прямой зависимости (Soil Testing...,1973; Puckett, Burton, 1981; Farago, Cole, 1988), что существенно осложняет экологическую экспертизу (Гуминовые вещества..., 1993). Реакция биологических свойств почвы на тяжелые металлы не всегда совпадает с их накоплением в растениях, поэтому использовать показатели биологических свойств почв как диагностический признак на получение безопасной продукции можно только при использовании данных, полученных в системе: почва - тяжелые металлы в почве - тяжелые металлы в растениях (Тяжелые металлы..., 1994).
Определение кадмия и цинка методами химического анализа
Комплексные соединения металлов анализируют чаще всего следующими химическими методами: гравиметрического анализа, объемного анализа, фотометрического анализа, флуоресцентного анализа. Наиболее полно данные методики охарактеризованы в монографии Ф.Умланд, А. Янсен, Д.Тириг, Г.Вюнш Комплексные соединения в аналитической химии. - М.: Мир, 1975. Гравиметрический анализ соединений кадмия и цинка.
Реагенты для гравиметрического анализа должны удовлетворять следующим требованиям: 1) в условиях осаждения давать осадок только с определенным элементом; 2) осадок необходимо перевести в соединение стехиомет-рического состава, которое может быть взвешено; 3) избыток реагента должен легко удаляться из осадка при промывании или высушивании; 4) избыток реагента не должен мешать определению других элементов в фильтрате или легко удаляться. Реагенты для гравиметрического анализа должны обладать высокой селективностью или селективность должна достигаться условиями осаждения. Гравиметрическое определение кадмия долгое время представляло трудности из-за отсутствия специфичных реагентов на кадмий. Обычно определению мешают металлы, которые сопровождают кадмий при сульфидном осаждении из кислых растворов, или близкий по химическим свойствам цинк. В 1952г. Вальтер и Фрайзер предложили очень селективный реагент на кадмий, 2-(о-оксифенил)бензоксазол. Чувствительность метода составляет от 1 до 80 мг Cd в пробе; осаждение проводят при рН=11-12.Определению кадмия с этим реагентом мешают медь и более 20мг кобальта и никеля в пробе. Эти элементы можно отделить достаточно полно этим же реагентом из кислого раствора, чтобы они не мешали последующему определению кадмия.
Для гравиметрического определения цинка предложено большое число органических реагентов, однако не все они достаточно селективные. Поэтому требуется предварительное отделение цинка от сопутствующих элементов. Наиболее часто используется осаждение в виде сульфида из слабокислых растворов (рН = 3); в этом случае мешают все элементы, которые также как и цинк образуют в кислой среде труднорастворимые сульфиды. Лучше отделять цинк от сопутствующих элементов ионообменным методом.
Считается, что лучшим вариантом гравиметрического определения цинка является его осаждение в виде оксапата из раствора. Чувствительность метода составляет 0,5-50 мг Zn в пробе, область осаждения — 85%-ная уксусная кислота. Однако, использование оксалата для осаждения цинка приводит к небольшому завышению результатов, поскольку железо частично соосаждается с цинком. Кальций, кадмий, медь, магний, свинец и другие элементы, образующие труднорастворимые оксалаты, необходимо предварительно отделить. Для гравиметрического определения цинка используется хинальдиновая кислота, В этом случае удается маскировать Al, Be, Fe, Ті и U при помощи винной кислоты, a Ag, Си и Hg - при помощи тиомочевины. Чувствительность метода составляет то 30 до 100 мг Zn в пробе при рН=2,3-6,5.
Вместо хинальдиновой кислоты для осаждения цинка можно использовать антраниловую кислоту, однако, этот метод малоселективен.
Среди других реагентов, предложенных для гравиметрического определения цинка, следует отметить салицилальдоксим, который при комнатной температуре в растворах с рН — 7-8 образует с цинком хелат состава Zn(C7H602N)2. Этот хелат состава 1: 2 сравнительно хорошо растворим, однако при нагревании раствора до 100С он превращается в малорастворимый полимерный хелат состава 1:1 Zn(C7H502N)2, который более удобен для количественного осаждения и может быть высушен до постоянного веса при 285 С.
Объемный анализ соединений кадмия и цинка.
Объемный анализ основан на применении хелатообразующих реагентов для титрования.
Для определения кадмия используют эриохром черный Т. Данная методика позволяет определить до 25 мг Cd на 100 мл раствора (рН=10). Раствор титруют до изменения окраски с красной на голубую. Однако применение этой методики не позволяет отделить химически похожий на кадмий цинк — он титруется вместе с кадмием. Щелочноземельные металлы титан и алюминий можно маскировать добавлением фторидов.
Еще один реагент для титрования - ксиленоловый оранжевый. Чувствительность метода составляет до 100 мг кадмия на 100 мл раствора при рН=6. В конечной точке титрования окраска меняется с оранжевой на желтую. Положительным моментом данной методики является то, что щелочноземельные металлы и магний не мешают определению.
Для определения кадмия в присутствии цинка применяют методику фотометрического титрования с ДГТА (диаминоэтилгликольэфиртетрауксусной кислотой). При этом можно определить до 1 мг кадмия на 150 мл раствора, содержащего 500-кратный избыток цинка, рН определения 10. Поглощение измеряют на длине волны 700-750 нм. Если в растворе содержится небольшое количество железа и алюминия, их можно маскировать винной кислотой. Другие ионы, мешающие титрованию (Pb, Си, Ni) маскируются цианидом калия.
Цинк также как и кадмий можно определять с помощью эриохрома черного Т. Определяется до 25 мг Zn на 100 мл раствора при рН=10. Титрование проводят до изменения окраски с красной на голубую. Кадмий и щелочноземельные металлы титруются вместе с цинком и мешают его определению.
При титровании цинка с ксиленоловым оранжевым можно определить до 100 мг Zn на 100 мл раствора, рН определения составляет 5-6. Окраска при титровании меняется с фиолетовой на желтую. Катионы щелочноземельных металлов, кроме Са, если он присутствует в большом количестве, не мешают определению. Мешающее влияние Са и А1 можно устранить кипячением раствора пробы с NH4F. Медь можно маскировать тиомочевиной и NajSjO}.
Синтез комплексных соединений кадмия и цинка с модельными лиган-дами
Как правило, кадмий и цинк образуют комплексы с координационным числом 4, имеющие тетраэдрическую конфигурацию. Устойчивость комплексов меняется в широких пределах: константы нестойкости различаются на 17 порядков - от 10 (прочные цианистые комплексы) до 10 (непрочные роданистые) (Sillen, Martell, 1964). Один из самых устойчивых комплексов кадмия - это его дитизонат. На образовании такого комплекса основан метод аналитического определения кадмия.
Для получения комплексных соединений использовали водные растворы кристаллогидратов - нитрата кадмия (Cd(NOj)2 4HiO) и нитрата цинка (Zn(NOj)2 6Н2О). Растворы лигандов готовили в дистиллированной воде или четыреххлористом углероде и спирте.
Несмотря на огромное разнообразие природных соединений, образующих комплексы с тяжелыми металлами, набор функциональных групп, образующих непосредственно координационные связи с кадмием и цинком в природных объектах, не очень велик. В первую очередь это гидроксильные группы, входящие в состав разнообразных углеводов, а также полифенолов (например, флавоноидов); азот- и серусодержащие группы. Связи S - металл характерны для металлотиопеинов, которые осуществляют связывание тяжелых металлов. Для целей настоящего исследования были выбраны модельные органические соединения, содержащие некоторые наиболее распространенные в биологических объектах функциональные группы: гидроксильные (пирокатехин, гидрохинон, рутин, фенол), серусодержащие (дитизон, тиоэтиленгликоль), карбоксильные (тартрат-ион, лимонная кислота и ее соли, аскорбиновая кислота), азотсодержащие (нитрозорезорцин).
При смешивании растворов лигандов с растворами солей кадмия и цинка только в случае пирокатехина и дитизона наблюдались видимые изменения окраски растворов. Дитизонат кадмия имеет ярко-розовую окраску. В случае пирокатехина его комплекс с кадмием, обработанный 0,5N раствором NaOH (рН=8,5), имеет розовую окраску. Комплекс Zn с пирокатехином, обработанный 0,5N раствором NaOH, имеет зеленоватую окраску. Во всех остальных случаях сливание растворов солей и растворов лигандов не приводило к видимому изменению окраски.
Спектрофотометрическое исследование полученных растворов комплексов Cd2+ и Zn2 с модельными лигандами проводили на спектрофотометре Specord UV Vis 720. Результаты исследований приведены в таблице 1.
Из таблицы видно, что при образовании комплексов с кадмием у некоторых из выбранных соединений заметно изменяется электронный спектр поглощения. Так, в случае дитизона, пирокатехина, гидрохинона происходит заметное смещение максимума полосы поглощения.
В случае тартрат-иона, рутина, нитрозорезорцина меняются некоторые особенности спектров при сохранении положения максимумов полос. В случае тартрат-иона исчезает пик (плечо) на 290 нм по сравнению со спектром поглощения свободного лиганда, при комплексообразовании с рутином максимум в спектре поглощения смещается от 264 нм до 270 нм. Образование комплекса с кадмием для нитрозорезорцина приводит к возрастанию интенсивности уже существовавшего пика на 335 нм. Комплексообразование с лимонной кислотой и ее солями, аскорбиновой кислотой, фенолом не приводит к заметным изменениям в спектре поглощения, по сравнению со спектром свободного лиганда.
Комплексообразование Zn с пирокатехином приводит к изменению спектра поглощения в видимой области (516 нм) по сравнению со спектром свободного лиганда (490 нм). В случаях гидрохинона и фенола изменений спектров поглощения комплексов по сравнению со спектрами свободных лигандов не наблюдается.
