Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Структура, свойства, способы получения и эффективность использования хитина и его производных 7
1.1 Сырьевые источники хитина 7
1.2 Структура, свойства и нахождение хитина и хитозана 10
1.3 Способы получения хитина и хитозана 14
1.4 Производные хитина и хитозана 25
Глава 2. Объекты, условия и методики исследования 39
2.1 Методы выделения хитина, хитозана, хитодекстринов и их структурных аналогов: D-глюкозамина хлоргидрата, фосфата и сульфата целлюлозы 39
2.2 Методы исследования образцов 41
2.2.1 Определение степени дезацетилирования хитозана 41
2.2.2 Определение средней молекулярной массы хитозана 42
2.2.3 Исследование ИК-спектров полученных образцов 44
2.2.4 Электронная микроскопия 45
2.3 Условия проведения лабораторных и полевых опытов 45
Глава 3 Получение и определение состава хитозансодержащих препаратов из цист Artemia salina и рачка-бокоплава Gammarus lacustris 51
3.1 Получение хитозансодержащих препаратов из цист Artemia salina и рачка-бокоплава Gammarus lacustris 51
3.2 Электронно-микроскопическое исследование хитозана, хитодекстринов и их структурных аналогов: D-глюкозамина хлоргидрата, фосфата и сульфата целлюлозы и хитозансодержащих препаратов, полученных модифицированным способом 56
2 3.3 Исследование образцов хитина, хитозана и их структурного аналога: D-глюкозамина хлоргидрата методом ИК-спектроскопирования 65
Глава 4. Оценка биологической активности хитозансодержащих препаратов 71
4.1 Стимулирующие свойства хитозана и его водорастворимых форм - хитодекстринов, полученных в «жестких» условиях дезацетилирования из Gammarus lacustris 72
4.2 Стимулирующие свойства сульфата и фосфата целлюлозы 85
4.3 Стимулирующие свойства структурной единицы хитозана — D-глюкозамина хлоргидрата 89
4.4 Стимулирующие свойства хитозановых препаратов, полученные путем модифицированного («холодного») способа дезацетилирования 95
4.5 Влияние хитозанового препарата Sx на энергию прорастания и всхожесть семян по методу песчаных культур (пшеницы Tnticum aestivum и гречихи Fagopirum esculentum) 97
4.6 Влияние хитозановых препаратов на количественные и качественные показатели льна-долгунца 108
Выводы 112
Библиографический список 113
Приложение 134
- Сырьевые источники хитина
- Исследование ИК-спектров полученных образцов
- Получение хитозансодержащих препаратов из цист Artemia salina и рачка-бокоплава Gammarus lacustris
Введение к работе
Актуальность темы. Для выращивания экологически чистой сельскохозяйственной продукции необходим комплекс благоприятных воздействий. Все изменения, происходящие при этом, в том числе и в почве, отражаются в конечном итоге на человеке. Растения поглощают любые вещества, будь это удобрения, пестициды или другие препараты. Поэтому необходимо, чтобы вещества, вносимые в почву, не были вредными или перерабатывались растениями в приемлемую для человека форму (Фелленберг, 1997).
Роль агрономических препаратов могут выполнять хитин и хитозан, являющиеся биосовместимыми и биоразлагаемыми полимерами, которые широко применяются более чем в 70-ти направлениях в сельском хозяйстве, пищевой, косметической и медицинской промышленности (Быков, 1977).Основным источником хитина и хитозана до сих пор являются Arthro-pode - панцири креветок, крабов, омаров, лангустов и раков (Николаева, 1968; Sen, Mathew, 1975; Austin, Brine at al., 1981; Быков, Фурман, 1999). Считается (Варламов, 2001), что биологическая активность хитозана обратно пропорциональна его молекулярной массе. В настоящее время разработано более 15 методов получения хитозана из хитина, из которых наиболее часто используют методы с агрессивными условиями: концентрированной щелочью и высокой температурой (Куприна, 2002), что делает эти методы экологически опасными.
Вместе с тем, панцири ракообразных - это дорогостоящее сырье, цена которого зависит от вида, возраста и сезонного вылова. Аквабиоресурсы Алтайского края богаты рачком Gammarus lacustris и яйцом Artemia s alina, которые ежегодно добываются в объемах 50... 100 тыс. т в год. Благодаря высокой производительности Artemia salina (рачок размножается, давая четыре приплода за сезон), при соблюдении всех правил отлова можно, без ущерба для природы, обеспечить производство хитина и хитозана, используя некондиционное сырье. Применение яйца Artemia salina в производстве стартовых кормов для скармливания молоди рыб предусматривает использование только полноценного сырья, а поврежденные оболочки цист Artemia salina с н изкой проклевываемостью в настоящее время не имеют промышленного применения.
В связи с изложенным выше представляется очевидной необходимость разработки безотходной технологии производства хитиновых производных из отходов цист Artemia salina с целью получения из них низкомолекулярных производных хитина для выращивания сельскохозяйственных культур.
Цели и задачи исследования. Цель исследования - разработать методику получения хитина и хитозана и препаратов на их основе из отходов яиц Artemia salina, а также изучить возможность использования полученных препаратов в ростостимулирующей активности растений наравне с хитином и хитозаном, полученными по традиционной технологии.
В задачи исследований входило:
-
Разработать методику получения хитозансодержащих препаратов из отходов цист Artemia salina.
-
Исследовать свойства и инфракрасные спектры поглощения хитозана из цист Artemia salina.
-
Исследовать превращения, происходящие на поверхности частиц
И.. 5
хитина в процессе дезацетилирования методом сканирующей электронной микроскопии.
-
Сравнить биологическую активность хитозана, полученного в «жестких» условиях дезацетилирования, с хитозансодержащими препаратами, полученными в «холодных» условиях дезацетилирования, низкомолекулярными хитиновыми препаратами (хитодекстрины и глкжозамин) и с препаратами на основе целлюлозы.
-
Изучить влияние синтезированных препаратов хитинового ряда на урожайность и качество овощей, картофеля, пшеницы и гречихи.
Научная новизна. Впервые разработана экологически безопасная безотходная технологическая схема получения хитозансодержащих препаратов из цист Artemia salina. Исследована надмолекулярная структура, характеристические свойства, биологическая и фунгицидная активность хитина и хи-тозана, полученных в «жестких» условиях дезацетилирования, и хитозансодержащих препаратов, полученных «холодным» способом дезацетилирования. Установлены эффективные дозы и сроки внесения препаратов в целях повышения урожайности и улучшения основных показателей качества картофеля и овощных культур.
Практическая значимость. Разработанный способ получения хитозана и хитозансодержащих препаратов может быть положен в основу промышленного производства стимуляторов роста растений. Предложенный способ получения препаратов не требует значительных затрат на их производство, характеризуется высокой биологической активностью по отношению к сельскохозяйственным культурам.
Положения, выносимые на защиту.
-
Метод получения хитозановых препаратов из цист Artemia salina.
-
Факторы, обуславливающие биологическую активность хитозановых препаратов из цист Artemia salina.
-
Способ применения хитозановых препаратов из цист Artemia salina при выращивании сельскохозяйственных культур.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на Всероссийской научно-технической конференции «Лекарственные средства и пищевые добавки на основе растительного сырья» (Бийск, 2001); 2-ой Международной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2001); 2-ой Международной научно-практической конференции «Гуминовые удобрения и стимуляторы роста в сельском хозяйстве» (Бийск, 2002); Всероссийском семинаре «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2002); Региональной научно-практической конференции «Повышение устойчивости и эффективности агропромышленного производства в Сибири: наука, техника, практика» (Кемерово, 2002); Седьмой международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана (Санкт-Петербург-Репино, 2003); XVII-ом Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003); Международной научно-практической конференции «Стратегия качества, безопасность и конкурентоспособность товаров и услуг на потребительском рынке» (Орел, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных
работ, заявка на патент РФ Регистрационный № 2003137322 от 24.12.2003. Способ получения жидкого органо-минерального удобрения из хитозансо-держащего сырья».
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов, условий и методик исследования, трех глав результатов собственных исследований, выводов и библиографического списка литературы (200 ссылок), содержит 24 таблицы и 40 рисунков.
Сырьевые источники хитина
Широкое распространение хитина в природе делает его доступным для промышленной переработки и последующего применения. Источниками хитина являются панцири ракообразных (Николаева, 1968; Sen, Mathew, 1975; Austin, Brine at al,, 1981; Быков, Фурман, 1999; Седельников, 1993), скелетные пластинки кальмаров (Фомичев, Шайдуллина и др., 2001), насекомые (Kramer, Koga, 1986) и биомасса мицелиальных и высших грибов (Muzzarelli 1977) (таблица 1.1). тивным источником сырья считаются панцирьсодержащие гидробионты.
Ежегодное мировое производство хитина и его модификаций характеризуется следующими цифрами:
- вылов панцирьсодержащих - 5,8 млн т;
объем панцирьсодержащих отходов - 350 тыс. т;
- производство хитина - 3,7 тыс. т;
- производство хитозана - 2 тыс. т;
- производство глюкозамина - 4 тыс. т;
- производство олигосахаридов - 500 т.
Массовые источники панцирьсодержащего сырья имеются во многих странах. Самым распространенным источником хитина является антарктический криль (Euphausia superba Dana), ежегодный вылов которого составляет от 1,5 до 4,0 млн т (Верходанов, Полякова и др., 1999; Красавцев, 1999).
В России основными источниками хитинсодержащего сырья являются камчатский краб (Paralithodes camtschaticus), краб-стригун опилио (Chionoe-cetes opilio) (годовой вылов 80000 т), а также углохвостая креветка в Баренцевом море (Быков, Немцев, 2002).
Потенциальным источником хитина и хитозана в азиатской части РФ являются запасы рачка-бокоплава гаммаруса в озерах Южного Урала и Западной Сибири (ежегодный объем вылова 100 тыс. т) и рачки-бокоплавы семейства Tilitroidea, обитающие в прибрежной зоне Южных и Дальневосточных морей (Мезенова, Лысова и др., 2003).
Другими сырьевыми источниками, поддающимися разведению, являются насекомые (тутовый шелкопряд, медоносные пчелы и комнатные мухи). (Быков, Немцев, 2001). Как считают Е.П. Феофилова, В.М. Терешина (1999), особенно перспективными являются рыжие и черные тараканы, которых можно получить в экологически чистых условиях. Подмор пчел, как ежегодная сырьевая база, составляющая от 6 до 10 тыс. т, также может стать перспективным источником сырья (Немцев, Зуева и др., 2001; Хисматуллин, 2001). Среди новых источников сырья СВ. Немцевым, О.Ю. Зуевой, ЕЯ. Ис 9 маиловым и др., (2003) были предложены жуки - вредители (колорадский жук, жуки-щелкуны, жуки-типографы и др.), где для борьбы с ними использовали феромонные ловушки. Суточный улов одной феромонной ловушки жуков-щелкунов в Краснодарском крае составил в среднем 3600 шт. или 45 г сухих жуков. Такой способ улова позволяет собирать биомассу жуков в значительных количествах и является перспективным с точки зрения получения хитина и хитозана.
Первенство в промышленном производстве хитина и хитозана принадлежит Японии, где выпускается до 25000 т хитина и хитозана в год, сырьем для получения служат отходы от переработки крабов и креветок. В США из панцирьсодержащего сырья (крабов и омаров) выпускают около 1000 т в год хитина и его модификаций. Европейские страны (Италия, Норвегия, Польша) выпускают до 100 т хитозана в год. В отечественной промышленности к настоящему времени ежегодный объем выпуска достигает 80 т (Красавцев 1999; Красавцев, Дегтярева, 2003; Быков, Немцев, 2002).
Аквабиоресурсы Алтая богаты значительными ресурсами, служащими для производства не только корма для рыб, белковых добавок к кормам животных, но и являются основным местным сырьем для производства хитина и хитозана.
Перспективным сырьем для производства является пресноводный рачок Gammarus и яйца Artemia. Воспроизводство их составляет около 1000 т в год для гаммаруса и 50 т в год для артемии (Овчаренко, Антонова, 1999).
Artemia salina - маленький рачок, размер которого не более 5 мм. Он обитает в водоемах, где уровень соли достигает 300 г на литр воды. Artemia относится к типу Членистоногие (Arthropoda), классу Ракообразные (Crustacea), подклассу Жаброногие ракообразные (Branchiopoda), отряду Жаброноги (Anostraca), семейству Artermiidae, роду Artemia.
Род Artemia состоит из пяти четко идентифицированных раздельнополых видов. Три из них обитают на американском континенте (A. monica, А. frariciscana, A, persimilis), один - в странах Средиземноморья (A. tunisiana) и один в Иране (A. urmiana). В СНГ артемия населяет водоемы от одесских лиманов до забайкальских соленых озер. Популяции локализованы в изолированных биотопах, для них характерны свои биологические и химические особенности. Яйца рачка используются в парфюмерии, на птицефабриках для корма цыплят, рыболовстве при выкармливании молоди рыб.
Artemia salina размножается, давая четыре приплода за сезон. Отлов артемии должен производиться лишь в последней стадии, когда рачки ложатся на зиму, иначе можно подорвать популяцию.
Циста Artemia salina имеет следующий химический состав: золы 9,3...3,2%», аминокислоты 57...60%, жирной кислоты 12... 14%, углеводов 6,5...5,6%, хитина 10%. Зола характеризуется следующими показателями минерального состава: макроэлементы-Са-1%; Р-0,45...0,б%; К-0,7...0,85%; Mg-0,04...0,06%; Na-0,6%, Са-2%; микроэлементы - Cu-3...5%; Fe-30... 150%; Mn-2,4...13%; Zn-20.,.30%.
Исследование ИК-спектров полученных образцов
В работе изучались спектры выделенных образцов по интенсивности всех полос поглощения, связанные с валентными и деформационными колебаниями групп, входящих в молекулу хитина и хитозана
ИК-спектры полученных образцов регистрировали на ИК-спектрофотометре Perkin-Inet Meg 684. Образцы спрессовались в таблетки, содержащие 2 мг образца и 200 мг бромида калия.
В узком интервале частот некоторые группы атомов, поглощающие ИК-излучение, почти не зависят от структуры остальной части молекулы. Такие частоты поглощения или полосы в ИК-спектре называют характеристическими. На основании табличных характеристических частот поглощения по полученному ИК-спектру определялись группировки атомов в молекуле и тем самым устанавливалось строение молекулы. В области 3700-2900 см 1 - проявляются валентные колебания связей атома водорода с атомами кислорода, азота, серы и углерода; Область 2500-1900 см"1 - область тройных связей; Область 1900-1300 см - область двойных связей; Область менее 1300 см" - особенно богата полосами, большая часть которых трудно поддается расшифровке, так как обусловлена колебаниями углеродного скелета всей молекулы. Спектр поглощения в этой области является индивидуальной характеристикой соединения (областью «отпечатков пальцев») (Беллами, 1971; Наканиси, 1965).
Дифференциально-сканирующая калориметрия. Термический анализ проводился на термоанализаторе 1090 фирмы «Du Pont» с модулем ДСК модели 912 в атмосфере воздуха до температуры 873 К со скоростью нагревания 10 град/мин.
Электронно-микроскопические исследования высокого разрешения проводили на сканирующем электронном микроскопе JSM-840 фирмы JEOL с получением электронно-микроскопических снимков на просвет в диапазоне увеличений 500-1500000 крат.
Биологическая активность образцов хитозана и хитине од ержащих препаратов оценивалась в лабораторных условиях по относительной энергии прорастания семян (ГОСТ 12038-84) и динамики роста растений методом песчаных культур (ГОСТ 5055-56; Ягодин, 2002). Всего было проведено 257 лабораторных опытов: с яровой пшеницей сорта «Алтайская - 50» - 45, гречихой сорта «Нива» - 45, томатами сорта «Белый налив» - 24, огурцами сорта «Феникс» - 26, морковью сорта «Шантенэ - 2460» - 47, свеклой сорта «Бордо» - 47 и льна сорта «Томский — 14» - 23. Схема опытов показана на рисунках 4.1-4.25 и таблицах 4.1-4.20.
Проверка биологической активности по относительной энергии прорастания. Определение относительной энергии прорастания семян проводили согласно ГОСТ 12038-84. Семена проращивали в условиях, предусмотренных в таблице 2.1. В термостате поддерживали установочную температуру ± 2С.
День закладки семян на проращивание и день подсчета энергии прорастания семян считали за одни сутки.
Проверка биологической активности методов песчаных культур. Метод песчаных культур относится к вегетационному методу исследования, заключающемуся в выращивании растений в различных сосудах, в искусственных условиях. Этот метод позволяет детально изучить роль отдельных элементов, их концентраций и соотношений в питании растений, взаимодействий между элементами и других разнообразных факторов в жизни растений в зависимости от целей и задач исследований (Ягодин, 2002)
Для повышения точности и достоверности результатов были испытаны трехкратные повторности каждого варианта опыта.
В каждый сосуд помещали одинаковую массу чистого песка (ГОСТ 5055-56) и высеивали сухие семена культур на глубину 0,5 см, покрывали бумагой и ежедневно увлажняли верхний слой песка; при появлении всходов бумагу убирали.
Полив растений в сосудах проводили (по заранее установленной норме) препаратами, полученными в лабораторных условиях.
В течение вегетации вели наблюдения энергии прорастания, всхожести семян, учета роста и развития растений, результаты записывали в журнал. Растения убирали на 12... 15 день периода вегетации, когда растения развивались за счет питательных веществ эндосперма семени. Именно в это время растения проявляют наиболее выраженное реагирование на внешние условия и биологическую особенность отдельных видов. В опытах подсчитывали число растений, проводили замеры высоты (длины) растений и корневой системы, определяли вес каждой части и высушивали до постоянной массы. Все результаты записывали в журнал, а образцы сохраняли для анализов.
Все полученные результаты учета подвергали статистической обработке для установления степени достоверности и точности (ошибки) опыта.
Изучение эффективности исследуемых образцов и хитиновых препаратов в полевых условиях. Показавшие наилучшую эффективность в лабораторных условиях массовые доли препаратов проверялись в полевых опытах. В качестве объектов исследований были взяты районированные сорта: картофель Solanum tuberosum сорта «Любимец», столовая свекла Beta vulgaris сорта «Бордо», морковь Daucus sativus сорта «Шантенэ - 2460», пшеница Triticum aestivum сорта «Алтайская - 50» и гречиха Fagopirum esculentum сорта «Нива», лен Linum usitatissimum сорта «Томский - 14».
Почва опытных участков - выщелоченная черноземная, обладающая сравнительно высоким потенциалом плодородия. Полевые опыты закладывались в трёхкратной повторности с рендомизированным размещением делянок. Исследуемые препараты вносились при замачивании семян и опрыскивании по основным фазам развития растений. В контрольных вариантах ис 48 пользовались растения без обработки.
Морковь, свекла. Посадка моркови и свеклы была проведена 16 мая.
Площадь опытной делянки моркови составляла 5 м . Глубина заделки семян - 1,5-2,0 см, расстояние в рядке - 5-6 см, междурядье - 15-20 см. Гус-тота посадки - 3000 растений в пересчёте на 100 м .
Площадь опытной делянки свеклы — 6м. Глубина заделки семян — 3-4 см, расстояние в рядке - 10-14 см, междурядье - 25-30 см. Густота посадки в пересчёте на 100 м2 - 1500 растений. Опыт проводился в двух вариантах: I вариант - замачивание и трёхкратное опрыскивание препаратами с массовой долей 0,001%; II вариант - замачивание и трёхкратное опрыскивание препаратами с массовой долей 0,01%. Опрыскивания проводились с учетом основных фаз развития растений: в фазу «вилочки», фазу активного нарастания надземной массы, фазу смыкания рядков. Уборка урожая корнеплодов была проведена 12 сентября. В момент уборки определяли массу корнеплодов и биологический урожай.
Получение хитозансодержащих препаратов из цист Artemia salina и рачка-бокоплава Gammarus lacustris
Среди известных способов получения хитозана выделяется способ с применением высоких температур и концентраций щелочи, которые положительно влияют на скорость протекания реакции. О.Р. Pemston и E.L. Johson (1980) было доказано, что с увеличением температуры скорость реакции отщепления ацетильных групп от молекулы хитина увеличивается линейно. При этом известно (Пинече-Ковас, Нието и др., 1984), что одновременно при этом происходит деструкция полимерной цепи хитозана, приводящая к снижению его молекулярной массы. В.М. Быковой, Л.И. Кривошеиной и др., (1999) представлен «холодный» способ получения хитозана из хитина краба и гаммаруса, заключающийся в выдерживании основного продукта в растворе щелочи при комнатной температуре (не ниже 20...22С) и периодическом перемешивании в течение 7...25 суток. Е.А. Ежовой (2003) был модифицирован данный способ за счет предварительного нагревания смеси хитина и 40%-ного едкого натра в течение 2...3 ч при температуре 50...60С с последующим выдерживанием при температуре окружающей среды 17„.20С . Такой способ получения обеспечивает сохранение высоких значений молекулярной массы, вязкости и степени дезацетилирования.
Разработанный нами способ является модификацией способа В.М. Быковой, Л.И. Кривошеиной, (1999), отличие заключается в использовании в качестве хитинсодержащего сырья Gammarus lacustris и Artemia salina.
В стакане из нержавеющей стали марки Х18Н10Т объемом 1 дм3 готовили раствор щелочи с массовой долей 40% и при постоянном перемешивании помещали предварительно измельченное сырье (рачок Gammarus lacus 52 tris или цист Artemia salina) при модуле: раствор щелочи 1:10....1:15. Полученную суспензию выдерживали при комнатной температуре в течение 30 суток.
Для определения основных показателей качества из приготовленной суспензии через определенный промежуток времени отбирались пробы и гравиметрическим методом выделяли образцы и определяли молекулярные массы и степень дезацетилироваиия хитозана.
Способ приготовления образца хитозана для определения молекулярной массы и степени дезацетилироваиия. Основываясь на свойстве хитозана растворяться в кислой среде при рН 6,3 и не растворяться в щелочной, отобранные образцы реакционной смеси предварительно промывали дистиллированной водой и отфильтровывали, освобождая осадок от белка и других растворенных в щелочной среде примесей. Полученный осадок помещали в воду и доводили раствором соляной кислоты до рН=3, при этом хитозан переходил в коллоидное состояние, полученную смесь отфильтровывали от остатка, а маточный раствор разбавляли двойным объемом воды и использовали для анализа. Далее раствор нагревали и добавляли по каплям при перемешивании раствор гидроксида натрия с массовой долей 6%. Выделившийся осадок оставляли стоять в течение 24 ч (старение осадка). При этом происходили процессы, приводящие к укрупнению, совершенствованию кристаллов и получению их практически свободными от примесей. По истечении времени осадок отфильтровывали и высушивали на воздухе в одинаковых условиях.
Образцы, полученные по традиционной схеме (с использованием высокой температуры и концентрации щелочи) и по предложенному нами методу, соответствовали стандарту по органолептическим показателям (Ленинджер, 1976): представляли собой порошок белого («жесткие» условия дезацетили-рования) или светло-кремового цвета («мягкие» условия дезацетилироваиия), без запаха, растворяющийся в 2% уксусной кислоте.
Для всех образцов были определены характеристическая вязкость, молярная масса (таблица 3.1) и степени дезацетилирования (рис. 3.1).
Результаты, приведенные в таблице 3.1, свидетельствуют о том, что мягкие условия дезацетилирования обеспечивают высокий уровень вязкостных характеристик полимеров, отобранных в процессе дезацетилирования суспензии. Это свидетельствуют и литературные данные (Быкова, Криво-шеина и др., 1999; Ежова, 2003).
При этом можно отметить, что после 15-20 дней дезацетилирования характеристическая вязкость и молярная масса полимеров изменяются незначительно. Образцы, полученные из рачка Gammarus lacustris, аналогичны образцам из цист Artemia salina, но с более низкими значениями исследованных характеристик.
Похожие диссертации на Исследование биологической активности хитозановых препаратов из цист Artemia Salina
