Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Характеристика некоторых факторов среды, оказывающих негативное влияние на организмы человека и Caenorhabditis elegans (Обзор литературы) 10
1.1 Действие температуры на организмы пойкилотермных животных 10
1.2 Регуляция численности популяции свободноживущей почвенной нематоды Caenorhabditis elegans 25
1.3 Роль холинергической системы в функциях организмов человека и
животных 27
1.4 Нейротоксичность ионов марганца 32
1.5 Токсическое действие ацетальдегида на организмы животных и человека 36
ГЛАВА 2 Объекты и методы исследования 40
2.1 Объект исследования 40
2.2 Методы исследования 47
2.3 Обработка результатов 50
ГЛАВА 3 Результаты и их обсуждение 51
3.1 Адаптация Caenorhabditis elegans к умеренному тепловому стрессу 51
3.2 Устойчивость поведения Caenorhabditis elegans к действию экстремально высокой температуры окружающей среды 64
3.3 Действие экстремальной высокой температуры, этанола и ацетальдегида на поведение почвенных нематод Caenorhabditis elegans линий N2 и IPE 1 68
3.4 Роль холинергической системы в теплоустойчивости организма Caenorhabditis elegans 77
3.5 Действие левамизола и пирантела на поведение почвенных нематод Caenorhabditis elegans и Caenorhabditis briggsae 91
3.6 О возможной роли серотонина и дофамина в регуляции теплоустойчивости поведения Caenorhabditis elegans 96
Выводы 108
Заключение 109
Литература
- Регуляция численности популяции свободноживущей почвенной нематоды Caenorhabditis elegans
- Токсическое действие ацетальдегида на организмы животных и человека
- Методы исследования
- Действие экстремальной высокой температуры, этанола и ацетальдегида на поведение почвенных нематод Caenorhabditis elegans линий N2 и IPE 1
Регуляция численности популяции свободноживущей почвенной нематоды Caenorhabditis elegans
Температура является одним из важнейших переменных факторов среды, которые определяют распространение и численность многих видов животных [10-12]. Для каждого вида беспозвоночных характерно наличие температурной ниши, характеризующейся определенным оптимумом и диапазоном температур, переносимых организмами [10]. Пороговые температуры, как правило, ограничивают размножение и развитие большинства видов, обитающих в тропиках и умеренных широтах при постоянных температурах [10-12]. При экстремально высокой температуре происходит гибель клеток и тканей [15]. При гораздо более низких температурах у беспозвоночных, подвергнутых гипертермии, нарушается работа нервной системы, что, в свою очередь, вызывает нарушения поведения [13, 14]. Известно, что многие беспозвоночные способны сохранять нормальное поведение при температуре среды, намного превышающей оптимальную для вида [11,13,14].
Все физиологические механизмы приспособления организма животного к действию абиотических факторов окружающей среды появились в процессе эволюции животных, который рассматривается как приспособление к последовательному ряду сред [20]. Температура окружающей среды на протяжении всей эволюции являлась и является физическим фактором среды, лимитирующим как численность, так и географическое распространение большинства видов как Protozoa, так и Metazoa [21]. Этим определяется сохраняющаяся актуальность исследования физиологических механизмов адаптации животных к изменению температуры среды. Эти механизмы функционируют на трех уровнях организации биологических систем: 1) механизмы адаптации одноклеточных организмов Protozoa или клеток, составляющих организм Metazoa, которые делают возможными сохранение структуры и функции на клеточном уровне при сильном увеличении или снижении температуры клетки [19];
2) физиологические механизмы интеграции центральной нервной системой составляющих организм животного органов и клеток в условиях действия на организмы животных высокой или низкой температуры среды для сохранения способности организма животного осуществлять различные формы поведения и формировать собственную внутреннюю среду при сильном изменении температуры тела [19, 22];
3) механизмы сохранения популяции животных при экстремальном изменении температуры окружающей среды, которые функционируют на надорганизменном уровне, такие как естественный отбор фенотипов с высокой устойчивостью к сильному изменению температуры окружающей среды и другие.
Тепловое повреждение клеток как возможный механизм теплового угнетения функций многоклеточного организма пойкилотермного животного и его тепловой смерти
Из-за отсутствия у пойкилотермных животных системы терморегуляции температура тела этих животных увеличивается вслед за увеличением температуры окружающей среды и оказывает прямое действие на все без исключения клетки, составляющие организм. Поэтому обязательным условием сохранения функций организма пойкилотермного Metazoa и его выживания в условиях увеличения температуры является быстрая и эффективная адаптация составляющих организм клеток к увеличению температуры тела, позволяющая сохранение этих клеток и их специальных функций, необходимых организму, в условиях превышения физиологического оптимума температуры. Тепловое повреждение и тепловая смерть одноклеточных организмов являются феноменами, известными уже в XIX веке. Известно также, что тепловое повреждение такой многоклеточной формы жизни как высшие растения обусловлено прямым повреждающим действием высокой температуры на составляющие организм клетки (некротические повреждения листьев высокой температурой) [23].
На протяжении всего периода интенсивного исследования причин негативного влияния высокой температуры на многоклеточные организмы пойкилотермных животных, завершившегося к началу 80-х годов XX века, тепловые повреждения составляющих организм клеток и тепловая смерть этих клеток рассматривались как наиболее вероятная причина теплового угнетения функций организмов пойкилотермных Metazoa и тепловой смерти этих животных [19, 23, 24]. Варианты этой гипотезы [19, 24] различались объяснением механизма прямого повреждающего действия высокой температуры на клетки, составляющие организм: 1. Тепловая денатурация белков или термическая инактивация ферментов, идущая со скоростью, превышающей скорость их синтеза. 2. Тепловые нарушения избирательной проницаемости биологических мембран, следствием которых являются повреждения клеток и их гибель. 3. Различия температурных коэффициентов (Q10) для взаимосвязанных метаболических реакций, нарушающие регуляцию клеточного метаболизма при превышении физиологического оптимума температуры.
Привлекательность гипотезы теплового повреждения специализированных клеток, составляющих многоклеточный организм пойкилотермного животного, для широкого круга исследователей определялась в основном двумя причинами.
Во-первых, эта гипотеза позволяла заменить изучение термотолерантности сложного многоклеточного организма животного исследованием термотолерантности выделенных из этого организма клеток с использованием методов цитологии, клеточной физиологии и молекулярной физиологии.
Во-вторых, сравнительные исследования теплоустойчивости клеток и белков, выделенных из организмов многих видов пойкилотермных Metazoa, показали наличие корреляции между температурными условиями существования вида и термотолерантностью клеток и белков в экспериментах in vitro [23, 25-28]. Как правило, теплоустойчивость клеток и ферментов выше у "теплолюбивых" видов Metazoa, чем у "холодолюбивых " видов [19, 23 - 28]. Тем не менее, гипотеза теплового повреждения клеток как механизма теплового угнетения функций многоклеточного организма животного не нашла экспериментального подтверждения в многочисленных исследованиях, в которых сравнивалась термотолерантность организмов различных видов пойкилотермных Metazoa и выделенных из этих организмов клеток и органов [19, 23, 29, 30]. Оказалось, что диапазоны температур, переносимых многоклеточным организмом, всегда значительно уже диапазона температур, переносимых составляющими этот организм клетками. Еще уже диапазоны температур, в пределах которых сохраняются репродуктивные функции организма Metazoa и сложные формы его поведения [10, 11, 19, 30, 31]. Следовательно, тепловое угнетение функций многоклеточных организмов пойкилотермных животных и их тепловая смерть вызываются превышениями физиологического оптимума температуры, которые переносимы составляющими эти организмы клетками. Это особенно очевидно для организмов "холодолюбивых" антарктических и арктических морских Metazoa. Например, тепловая смерть антарктических рыб рода Trematomus наступает уже при +6С, температуре, при которой не происходит тепловая денатурация белков или тепловое повреждение клеток, выделенных из организмов этих рыб [32]. Высокая термотолерантность клеток, изолированных из организмов Metazoa, объясняется эффективностью механизмов, защищающих клетку от повреждающего действия высокой температуры и репарирующих тепловые повреждения на молекулярном уровне, таких как восстановление структуры белков после их денатурации, адаптивные изменения фосфолипидов клеточных мембран и другие [12, 33 - 37]. Эти механизмы появились в процессе эволюции у одноклеточных организмов и сохранились у клеток, составляющих многоклеточные организмы животных и растений [12, 33 - 38]. Быстрая самоадаптация клеток к увеличению температуры является составной частью приспособления многоклеточного организма Metazoa, и компенсаторный резерв этой адаптации на клеточном уровне всегда выше эффективности адаптации целостного организма. Поэтому тепловое повреждение составляющих организм клеток не может быть причиной, как тепловой смерти многоклеточных организмов пойкилотермных животных, так и обратимого угнетения поведения, развития и размножения этих животных умеренными тепловыми воздействиями на организм, которые не оказывают на него повреждающего действия. Несоответствие гипотезы теплового повреждения клеток, составляющих организм пойкилотермных животных, экспериментальным данным о высокой теплоустойчивости этих клеток стало очевидным уже в 60—80-е годы XX века и явилось причиной прекращения исследований теплоустойчивости клеток, выделенных из организмов пойкилотермных Metazoa.
Токсическое действие ацетальдегида на организмы животных и человека
В сравнительном исследовании действия пирантела и левамизола на поведение С. elegans и С. briggsae эти нематоциды растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) при конечной концентрации ДМСО в среде, равной 0,5 %. В контрольные пробирки добавляли соответствующее количество ДМСО.
Действие этанола на термотолерантность поведения С. elegans линий N2 и IPE-1 было исследовано добавлением в жидкую среду (1 мл NG буфера) этанола в концентрациях 25-400 ммоль и оценивали: 1) - среднее время сохранения способности к плаванию у нематод при постоянной высокой температуре +36С; 2) - Среднее время наступления паралича у нематод при постоянной высокой температуре +36С. В контрольных экспериментах, проведенных при температуре +23С, экспозиция червей к этанолу проходила в течение 30-90 минут.
Эксперименты по исследованию влияния ацетальдегида на поведение С. elegans линий N2 и IPE-1 проводились с организмами, инкубированными индивидуально в 1 мл NG буфера при температуре +23С. Концентрация ацетальдегида варьировала от 80 до 320 мкг в 1 мл среды. Оценку изменения поведения нематод проводили через 30 минут инкубации в среде с ацетальдегидом, каждая особь оценивалась в течение десяти секунд. Показателями нарушений поведения этанолом, ацетальдегидом и высокой температурой среды являлись нарушения координации локомоторных мышц, необходимой для синусоидальных движений тела необходимых при плавании, индуцированном механическим стимулом (встряхиванием пробирки с червем), и полная потеря способности червей к плаванию.
Обработку С. elegans 6-гидроксидофамином (6-OHDA) проводили следующим образом. Червей инкубировали в течение двух часов при 25С в среде, содержащей 15 ммоль 6-OHDA и 3 ммоль аскорбиновой кислоты, предотвращающей инактивацию 6-OHDA. В контрольных экспериментах червей инкубировали два часа при +25С в среде, содержащей 3 ммоль аскорбиновой кислоты. После этого контрольных и опытных червей переносили в чашки Петри с агаром и E.coli ОР50 и инкубировали их в течение 18 часов при 22 С.
Высокие концентрации никотина, серотонина и дофамина использованные в работе те же, что и в работах других авторов [76, 173 - 176] и объясняются чрезвычайно низкой проницаемостью кутикулы нематод для многих органических веществ и соединений.
В каждом из вариантов описанных выше экспериментов использовали по 30 исследуемых организмов, эксперименты проводились в 3-5 повторностях. В экспериментах использовали реактивы фирмы Sigma. В работе использовали современные методы фармакологического и генетического анализа, а также методы лабораторного моделирования с применением стереоскопического микроскопа марки SMZ-05 и вспомогательного оборудования для термостатирования (термостат марки TW-2.02) с точностью до 0,1 С. Среднее время осмотра и оценки состояния одного организма составляло около 10 с.
Популяция свободноживущей почвенной нематоды С. elegans обитает в верхних слоях почвы, подверженных сильным изменениям температуры и влажности при сезонных и климатических колебаниях температуры воздушной среды. Поэтому С. elegans является удобным модельным организмом для изучения механизмов адаптации пойкилотермных животных как к умеренному, переносимому организмом превышению физиологического оптимума температуры, так и к экстремальному увеличению температуры среды, вызывающему нарушения функций и тепловую гибель животных [177, 178].
Известно, что холинергическая система, приобретенная организмами Metazoa на ранней стадии эволюции, играет ключевую роль во всех основных функциях организмов, как человека, так и всех животных, включая С. elegans [91].
Поэтому одной из задач работы явилась проверка гипотезы, предполагающей, что адаптивная реакция организма С. elegans на умеренное, но неблагоприятное повышение температуры среды включает в себя изменения функций холинергической системы. Для проверки этой гипотезы был использован методический подход, который успешно применяется последние двадцать лет для изучения молекулярных механизмов функций холинергической системы С. elegans [92], но не использовался ранее для изучения возможной роли этой системы в адаптации С. elegans к негативным изменениям факторов окружающей среды. Этот подход, специфичный для С. elegans заключается в том, что изменения состояния холинергической системы в интактном организме С. elegans выявляются фармакологическим (токсикологическим) анализом локомоции, который включает в себя регистрацию изменений чувствительности локомоции к ингибитору ацетилхолинэстеразы - алдикарбу и агонистам никотиновых рецепторов ацетилхолина - левамизолу и никотину [18, 97, 99]. В нашей работе мы использовали данный методический поход в качестве удобного инструмента в лабораторном экологическом моделировании.
Как показано на рисунке 3.1, в экспериментах с С. elegans линии N2, выращенными в оптимальных условиях среды [16], повышение температуры с +23С до +30С, вызывает небольшое увеличение чувствительности плавания, индуцированного механическим стимулом к действию алдикарба. Последний, ингибируя ацетилхолинэстеразу, увеличивает концентрацию ацетилхолина в организме и, как следствие, нарушает поведение нематод гиперактивацией н-холинорецепторов. В то же время повышение температуры с +30С до +33С, вызывает сильное увеличение чувствительности у С. elegans к алдикарбу (рис. 3.1).
Известно, что повышение чувствительности локомоции С. elegans к алдикарбу свидетельствует об активации холинергических синапсов, принимающих участие в регуляции локомоции, которая может быть следствием стимуляции секреции ацетилхолина нейронами или повышения чувствительности к ацетилхолину н-холинорецепторов в нейронах и мышцах [86]. Поэтому были проведены эксперименты, в которых исследовано влияние кратковременного (15 минут) умеренного теплового стресса на чувствительность поведения С. elegans к действию агонистов никотиновых рецепторов ацетилхолина нематод левамизола и никотина.
Как показано на рисунках 3.2 и 3.3, чувствительность поведения С. elegans к действию левамизола и никотина, которая проявляется в нарушениях поведения гиперактивацией никотиновых рецепторов ацетилхолина [86], умеренно увеличивается повышением температуры с +23С до +30С, и очень сильно повышением температуры с +30С до +33С. Следовательно, переносимый организмом С. elegans тепловой стресс вызывает быстрое увеличение чувствительности н-холинорецепторов.
Методы исследования
Во-первых, повышение теплоустойчивости поведения С. elegans вызывается введением в среду пилокарпина, который является агонистом всех пяти подтипов м-холинорецепторов позвоночных [101]. Во-вторых, атропин, антагонист м-холинорецепторов позвоночных [101], ослабляет терапевтическое действие неостигмина (рис. 3.19) и полностью блокирует действие пилокарпина на поведение С. elegans в условиях гипертермии (рис. 3.20). В геноме С. elegans идентифицированы три гена (gar-/, gar-2 и gar-З), сходные с генами м-холинорецепторов позвоночных [90, 106, 107]. Эктопическая экспрессия этих генов в клетках млекопитающих показала, что продукты генов gar-l, gar-2 и gar-3 являются рецепторами ацегилхолина, сопряженными с G-белками, но только один их них (GAR-3) обладает чувствительностью к агонистам и антагонистам холинорецепторов позвоночных [90, 101, 106, 107]. Поэтому пилокарпин и атропин, являющиеся соответственно неспецифическим агонистом и несиецифическим антагонистом м-холинорецепторов позвоночных [101], у С. elegans являются селективным агонистом и селективным антагонистом м-холинорецептора GAR-3 [90].
Активация м-холинорецептора GAR-3 происходи! и при действии неспецифического агониста холинорецепторов позвоночных карбахола [90]. Поэтому повышение теплоустойчивости поведения С. elegans пилокарпином и карбахолом, которое предотвращается введением атропина в среду (рис. 3.20). свидетельствует о том, что агонисты холинорецепторов защищаюг функции нервной системы червей от теплового стресса активацией метаботропного м-холинорецептора GAR-3. Для идентификации м-холинорецептора С. elegans, определяющего чувствительность теплоустойчивости функций нервной системы к протекторным эффектам пилокарпина и неостигмина, кроме фармакологического анализа, результаты которого приведены выше, были проведены эксперименты, в которых сравнивалась чувствительность к неости гмину и пилокарпину у червей дикой линии N2 и трех линий червей с мутациями по одному из грех генов (gar-1, gar-2 и gar-3), продуктами которых являются м-холинорецепторы GAR-1. GAR-2 и GAR-3.
Как показано на рисунке 3.21, у червей мутантных линий RB896 и RB756, у которых отсутствуют функции генов соответственно gar-I и gctr-2, чувствительность к протекторному эффекту пилокарпина, проявляющемуся в повышении теплоустойчивости поведения, мало отличается от чувствительности к пилокарпину червей С. elegans дикой линии N2. Напротив, в экспериментах с мутантной линией С. elegans JD217, у которой отсутствует экспрессия гена gar-3, пилокарпин не оказывает влияния на теплоустойчивость поведения С. elegans (рис. 3.21). Следовательно, м-холинорецептор GAR-3 необходим для повышения теплоустойчивости поведения С. elegans пилокарпином, которое сохраняется при отсутствии у червей м-холинорецепторов GAR-1 или GAR-2.
Как показано на рисунке 3.22, у червей мутантной линии JD217 отсутствует и чувствительность теплоустойчивости поведения к ингибитору ацетилхолинэстеразы неостигмину, в то время как у червей мутантных линий RB896 и RB756 эта чувствительность выявляется. Следовательно, м-холинорецептор GAR-3 необходим для повышения теплоустойчивости поведения С. elegans не только действием агониста м-холинорецепторов пилокарпина (рис. 3.21), но и ингибированием ацетилхолинэстеразы неостигмином.
В целом результаты как фармакологического, так и генетического анализа изменений теплоустойчивости поведения С. elegans, индуцированных ингибированием ацетилхолинэстеразы, агонистами рецепторов ацетилхолина и атропином, представлены на схеме (рис. 3.23).
Пилокарпин и Атропин карбахол АХЭ Модуляция синаптической передачи между нейронами Повышение теплоустойчивостифункций нервной системы С.elegans Повышение термостабильности поведения Рис. 3.23 Общая схема действия ингибитора ацетилхолиностеразы, агонистов м-холинорецепторов и атропина на поведение С. elegans. Примечание. АХ-ацетихолин, АХЭ-ацетилхолинэстераза.
Экспрессия gar-З происходит во многих нейронах С. elegans, но в оптимальных температурных условиях среды у червей с мутациями, селективно нарушающими или прекращающими экспрессию gar-3 [87], изменения локомоции не выявляются.
Нервная система С. elegans быстро адаптируется к действию экстремальной температуры в условиях умеренного повышения температуры до 30С (рис. 3.24) [193]. Как показано на рисунке 3.19, в результате этой адаптации не только сохраняется, но и усиливается протекторный эффект пилокарпина в условиях экстремального увеличения температуры среды. Поэтому возможно, что адаптация С. elegans к повышению температуры среды изменяет чувствительность м-холинорецепторов в нервной системе.
Результаты работы свидетельствуют о том, что теплоустойчивость функций простой нервной системы С. elegans регулируется активацией м-холинорецепторов. В нервной системе млекопитающих мускариновые рецепторы ацетилхолина играют важную роль в обучении, памяти, регуляции локомоции и терморегуляции [101, 194, 195]. В связи с тем, что активация мускариновых рецепторов ацетилхолина в терморегуляторном центре гипоталамуса млекопитающих вызывает гипотермию [195], очевидно, что в условиях гипертермии, индуцированной экстремальной высокой температурой среды, агонисты м-холинорецепторов могут оказывать терапевтическое действие на организмы млекопитающих снижением температуры тела и в отсутствие повышения устойчивости функций нервной системы к гипертермии.
В то же время в связи с большим сходством структуры и функций метаботропных мускариновых рецепторов ацетилхолина у млекопитающих и у С elegam результаты этой работы позволяют предположить большую вероятность того, что активация этих рецепторов может повышать теплоустойчивость функции нервной системы не только у С. elegam, но и у млекопитающих.
Таким образом, результаты данного раздела свидетельствуют о важной роли ацетилхолина в реакции организма С. elegam на гипертермию.
Впервые показано, что ингибирование ацетилхолинэстеразы, повышающее концентрацию ацетилхолина в организме, может защищать поведение С. elegam от которые вызываются экстремальной высокой температурой среды. Этот протекторный эффект повышения концентрации ацетилхолина в организме не может быть следствием активации никотиновых рецепторов ацетилхолина в нейронах или мышцах, так как агонисты этих рецепторов левамизол и никотин вызывают не повышение, а, напротив, снижение устойчивости поведения С. elegam к тепловому стрессу. В то же время агонист мускариновых рецепторов ацетилхолина пилокарпин оказывает сходное с ингибированием ацетилхолинэстеразы терапевтическое действие на теплоустойчивость поведения С. elegam при наличии противоположно направленного действия ингибитора этих рецепторов атропина. Это позволяет сделать вывод о том, что ацетилхолин защищает поведение С. elegam от теплового стресса в результате активации метаботропных мускариновых рецепторов.
Результаты экспериментов, в которых сравнивалась чувствительность теплоустойчивости поведения к пилокарпину и ингибитору ацетилхолинэстеразы неостигмину у червей контрольной линии N2 и червей трех линий с нуль-мутациями генов мускариновых рецепторов С. elegam, показали, что мишенью протекторных эффектов ацетилхолина и агониста мускариновых рецепторов пилокарпина является рецептор GAR-3, являющийся гомологом м-холинорецепторов млекопитающих.
Действие экстремальной высокой температуры, этанола и ацетальдегида на поведение почвенных нематод Caenorhabditis elegans линий N2 и IPE 1
Поэтому эффективные концентрации большинства токсикантов для С. elegans на многие порядки выше, чем для таких беспозвоночных, как Daphnia magna и другие. В то же время, после поступления в организм С. elegans концентрации токсикантов во внутренней среде, эффективные для проявления нейротоксичности, те же, что и у позвоночных. Так, после 30-минутной экспозиции С. elegans к 50 ммоль МпС12 концентрация ионов марганца в тканях нематоды всего 7 мкмоль [129].
Таким образом, результаты, полученные в экспериментах по исследованию участия дофаминергической системы в регуляции теплоустойчивости поведения С. elegans сводятся к следующему: аккуратно
Снижение теплоустойчивости плавания С. elegans, индуцированного механическим стимулом, происходит не только после экспозиции к 6-OHDA, но и вследствие предварительной экспозиции червей к ионам марганца, которые являются селективными нейротоксинами дофаминергических нейронов, как у позвоночных, так и у С elegans [217];
Введение в среду дофамина вызывает небольшое, но достоверное повышение теплоустойчивости плавания контрольных нематод и значительное повышение теплоустойчивости нематод, которые предварительно были подвергнуты экспозиции к ионам марганца или 6-OHDA, и поэтому введение в среду дофамина полностью нивелирует различия теплоустойчивости поведения нематод, индуцированные ионами марганца или 6-OHDA.
В целом результаты наших экспериментов позволяют сделать вывод о том, что снижение теплоустойчивости поведения С. elegans предварительной экспозицией к ионам марганца является следствием их нейротоксического действия на дофаминергические нейроны. Ранее неиротоксическое действие ионов марганца на С. elegans в основном исследовалось методами молекулярной биологии и молекулярной генетики [129, 217]. Основное отличие условий экспериментов в этих работах и в нашей заключается в том, что в наших экспериментах кратковременной экспозиции к ионам марганца подвергались не личинки I возраста, а взрослые нематоды. Соответственно, идентичная экспозиция к ионам марганца через 24 часа восстановления в среде без ионов марганца вызывает 50% летальность при обработке личинок I возраста [129] и почти не оказывает влияния на выживаемость, если экспозиции к ионам марганца подвергаются взрослые нематоды (менее 5% летальности в наших экспериментах). В то же время известно, что полное прекращение синтеза дофамина в мутантных линиях С. elegans не оказывает влияния на выживаемость, и это согласуется с отсутствием летальности при действии 6-OHDA на С. elegans в наших экспериментах [218]. Поэтому наиболее вероятным объяснением высокой летальности при действии ионов марганца на личинок I возраста [129] является наличие двух механизмов токсичности ионов марганца, одним из которых является дегенерация дофаминергических нейронов, не влияющая на выживаемость, и необратимые повреждения организма неизвестной природы, вызывающие гибель нематод. В наших экспериментах экспозиция взрослых нематод к ионам марганца оказывает нейротоксическое действие на дофаминергическую систему С. elegans в отсутствие летальности червей. Поэтому эксперименты с взрослыми нематодами являются более удобной моделью изучения механизмов индукции ионами марганца болезни Паркинсона, чем эксперименты с личинками I возраста.
Результаты этого раздела работы позволяют сделать следующие выводы: Показано, что серотонин и дофамин влияют на диапазон термотолерантности С. elegans в противоположных направлениях; Идентифицированы два гена принимающие участие в регуляции термоустойчивости поведения С. elegans: это ген переносчика серотонина и ген рецептора серотонина; Показано, что нейротоксическое действие ионов марганца проявляется в снижении термотолерантности поведения С. elegans из-за нурушения функций дофаминергической системы.
1. Показано, что адаптивная реакция С. elegans и С. briggsae на неблагоприятное, но переносимое организмом повышение температуры среды (от +28 до +33С) включает в себя быстрое (минуты) увеличение чувствительности никотиновых рецепторов в холинергических синапсах, принимающих участие в регуляции локомоции, и относительно медленное (часы) увеличение толерантности организма к действию экстремальной высокой температуры среды (36С).
2. Увеличение чувствительности никотиновых рецепторов ацетилхолина умеренным тепловым стрессом и высокой плотностью особей в популяции С. elegans, адаптивно при действии природных факторов среды, так как является механизмом увеличения скорости избегания нематодами локальных сред с высокой температурой, но вызывает сильное снижение толерантности организма к токсическому действию пестицидов вызывающих гиперактивацию холинергических систем нематод и насекомых (алдикарб, левамизол и никотин).
3. Качественные различия чувствительности поведения С. elegans и С. briggsae к нематоцидам - агонистам никотиновых рецепторов ацетилхолина левамизолу и пирантелу показали, что эволюция нематод даже в пределах одного рода изменяет никотиновые рецепторы ацетилхолина.
4. Показано, что у простых организмов нематод так же, как у высших беспозвоночных нервная система является мишенью нарушения функций целого многоклеточного организма высокой температурой.
5. С использованием фармакологического и мутантного анализа показано, что одной из причин теплового нарушения поведения С. elegans является ингибирование секреции ацетилхолина нейронами, вызывающее состояние с дефицитом ацетилхолина, которое компенсируется частичным ингибированием ацетилхолинэстеразы и действием агонистов мускариновых рецепторов ацетилхолина.
