Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Зоны физиологического действия неблагоприятных факторов... 8
2.2. Белки теплового шока (шапероны) как факторы защиты полипептидов 10
2.2.1. Изменения, происходящие с полипептидами в стрессовых условиях 10
2.2.2. Высокомолекулярные бтш и их защитная роль 16
2.2.3.Низкомолекулярные стрессовые белки - факторы защиты полипептидов от теплового шока и водного дефицита 17
2.2.3.1. Классификация и структурные особенности низкомолекулярных бтш растений 17
2.2.3.2. Регуляция экспрессии генов низкомолекулярных БТШ растений. 24
2.2.3.3. Функции и механизм действия низкомолекулярных бтш растений 26
2.2.3.4. Синтез низкомолекулярных бтш в ответ на тепловой стресс 33
2.2.3.4. Синтез низкомолекулярных бтш в ответ на водный дефицит 36
2.3. Краткая характеристика митохондрий растений 40
2.3.1. Дыхательная система растительных митохондрий и окислительное фосфорилирование 42
2.4. Влияние теплового шока и водного дефицита на дыхание растений 46
2.4.1. Влияние температуры на дыхание растений 46
2.4.2. Особенности дыхания растений в условиях водного дефицита 51
2.4.2.1. Функции и формы воды в растении 51
2.4.2.2. Экологические группы растений по отношению к водному режиму 54
2.4.2.3. Влияние водного дефицита на дыхание 56
2.5. Основные выводы из обзора литературы 63
2.6. Цель и задачи исследования 65
4. Материалы и методы 66
4.1. Подготовка растительного материала 66
4.2. Температурная обработка 66
4.3. Создание условий водного дефицита 67
4.5. Определение выживаемости проростков 68
4.6. Оценка оводыенности тканей проростков 68
4.7. Выделение суммарного клеточного белка 68
4.8. Определение концентрации белка 69
4.9. Выделение митохондрий 70
4.10. Очистка митохондрий 71
4.11. Обработка митохондрий проназой 72
4.12. Обработка митохондрий детергентами 72
4.13. Экстракция митохондриального белка 73
4.14. Определение энергетической активности митохондрий 73
4.15. Электрофорез 74
4.16. Иммуноблоттинг и иммунодетекция 75
4.17. Использованные антитела 76
4.18. Определение молекулярных масс полипептидов 77
4.19. Статистическая обработка 77
5. Результаты и обсуждение 78
5.1. Влияние термической обработки проростков кукурузы, пшеницы И ржи на дыхательную активность изолированных митохондрий 78
5.2. Влияние температуры проращивания на дыхательную активность изолированных митохондрий из проростков кукурузы 81
5.3. Накопление низкомолекулярных бтш во фракции суммарного Клеточного белка из проростков кукурузы, пшеницы и ржи под Действием теплового шока 83
5.4. Накопление низкомолекулярных бтш в митохондриях кукурузы, пшеницы и ржи из проростков, обработанных высокой температурой 86
5.5. Локализация низкомолекулярных бтш на поверхности или Внутри митохондрий 89
5.6.Определение прочности связывания митохондриальных Низкомолекулярных бтш с мембранами 91
5.7. Присутствие низкомолекулярных бтш в различных клеточных фракциях 93
5.8. Действие водного дефицита и обработки осмотиком на накопление низкомолекулярных бтш в проростках кукурузы 97
5.9. Действие водного дефицита и обработки осмотиком на оводненность проростков кукурузы 102
5.10. Действие водного дефицита на выживаемость проростков кукурузы 105
5.11. Дыхательная активность митохондрий, выделенных из проростков, подвергнутых водному дефициту. 107
6. Заключение 121
7. Выводы 125
8. Список использованной литературы
- Высокомолекулярные бтш и их защитная роль
- Дыхательная система растительных митохондрий и окислительное фосфорилирование
- Создание условий водного дефицита
- Влияние температуры проращивания на дыхательную активность изолированных митохондрий из проростков кукурузы
Введение к работе
Понятие "стресс" впервые было применено в медицине канадским эндокринологом Гансом Селье в 30-х годах 20 века. Селье дает следующее определение стрессу: "Стресс есть неспецифический ответ организма на любое предъявляемое ему требование" (Селье, 1972). Комплекс изменений, вызываемых в организме стрессом, Селье назвал "общим адаптационным синдромом".
При действии стрессора происходящие с растением на клеточном уровне изменения можно разделить на специфические и неспецифические. Первые уникальны для каждого вида стресса, их появление продиктовано теми характерными особенностями, которые отличают именно этот вид воздействия. Вторые являются общими для большинства воздействий. Стрессовый ответ направлен на защиту внутриклеточных структур и устранение неблагоприятных изменений в клетках. Активация и синтез стрессовых белков также является частью неспецифического стрессового ответа и характерно для действия любых стрессоров.
Существует несколько биохимических структур и функций, которые абсолютно необходимы для всех живых систем и в то же время весьма чувствительны к изменениям физических или химических особенностей среды. Эти структуры и функции особенно нуждаются в неких адаптивных механизмах, поскольку ухудшение деятельности этих структур и функций или их полное устранение или остановка несовместимы с жизнью клетки. К таким "узким местам" относятся следующие системы, процессы или функции:
поддержание структурной целостности макромолекул (ферментов, сократительных белков, нуклеиновых кислот и др.);
достаточное снабжение клетки а) «энергетической валютой»— аденозинтрифосфатом (АТФ); б) восстановительными эквивалентами, необходимыми для протекания процессов биосинтеза; в) предшественниками,
используемыми при синтезе запасных веществ (гликогена, жиров и т. п.), нуклеиновых кислот и белков;
3) поддержание систем, регулирующих скорости и направления метаболических процессов в соответствии с потребностями организма и их изменениями при изменении условий среды (Хочачка, Сомеро, 1988).
Эти фундаментальные функции необходимы всем живым системам, в каких бы условиях они ни находились. Адаптации на биохимическом уровне производятся с помощью небольшого числа фундаментальных механизмов. Среди способов биохимической адаптации существуют следующие три типа адаптивных механизмов или "стратегий":
1. Приспособление макромолекулярных компонентов клеток или
жидкостей организма. При этом либо изменяются количества (концентрации)
уже имеющихся типов макромолекул, например ферментов ("количественная"
стратегия), либо образуются макромолекулы новых типов (изозимы или
аллозимы), которыми замещаются макромолекулы, ставшие не вполне
пригодными для работы в изменившихся условиях ("качественная" стратегия).
2. Приспособление микросреды, в которой функционируют
макромолекулы. Адаптивное изменение структурных и функциональных
свойств макромолекул достигается путем видоизменения качественного или
количественного состава окружающей их среды (например, ее осмотической
концентрации или состава растворенных веществ).
3. Приспособление на функциональном уровне. Адаптацию в этом случае
обеспечивает изменение в использовании уже существующих
макромолекулярных систем — в соответствии с текущими локальными
потребностями в той или иной метаболической активности. Таким образом, из
этих адаптации складывается важное явление метаболической регуляции—
надлежащее увеличение или уменьшение активности ферментов в связи с
воздействием стресса, такими процессами, как локомоция, рост, переход к
анаэробиозу и др. (Хочачка, Сомеро, 1988).
Деятельность низкомолекулярных стрессовых белков или белков теплового шока (сокращенно БТШ) является важной частью метаболической регуляции клетки. В условиях стресса высокомолекулярные БТШ, к которым относятся БТШ 100, БТШ70, БТШ60 и БТШ40 придают полипептидам устойчивость и восстанавливают уже поврежденные белки. Однако эта функция высокомолекулярных БТШ осуществляется, как правило, только при участии низкомолекулярных БТШ (нмБТШ). В отличие от высокомолекулярных, нмБТШ за редким исключением появляются в клетке только с наступлением стрессовых условий.
В настоящей работе рассматриваются индукция и накопление низкомолекулярных БТШ в ответ на действие двух стрессов: повышенной температуры или обезвоживания. Описывается действие этих стрессоров на процессы окислительного фосфорилирования, протекающие в митохондриях, и на накопление в этих органеллах нмБТШ.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Высокомолекулярные бтш и их защитная роль
Большинство БТШ является шаперонами. Молекулярные шапероны - это важные компоненты протеома клетки, действующие как в оптимальных, так и в неблагоприятных условиях. Они отвечают за формирование третьичной конформации полипептидов (фолдинг), формирование четвертичных белковых комплексов, транспорт и перенос белков через мембраны, а так же за их утилизацию (Lindquist, Craig, 1988). Молекулярные шапероны нековалентно связываются с субстратами и структурами, утратившими нативную конформацию, и не являются частью конечного продукта после ее восстановления (Wang et al., 2004). Все эти процессы являются частью многих клеточных явлений, т.е. функции шаперонов не ограничиваются стрессовым ответом. Шапероны способствуют стабилизации белков и мембран и восстановлению структуры поврежденных белков в условиях стресса (Lindquist, Craig, 1988). Накопление или синтез шаперонов de novo описаны в условиях теплового шока, водного дефицита, засоления, окислительного стресса (Waters et al., 1996; Boston et al., 1996; Vierling, 1991). Молекулярные шапероны участвуют в формировании приобретенной устойчивости к стрессам (Bukau, Horwich, 1998; Hartl, 1996; Frydman, 2001; Buchner, 1999).
Описано пять основных семейств молекулярных шаперонов/БТШ растений: семейство БТШ70, шаперонин (БТШ60), семейство БТШ90, семейство БТШ 100 (С1р) и низкомолекулярные БТШ (нмБТШ) (Boston et al., 1996; Vierling, 1991). БТШ были обнаружены в цитоплазме и многих органеллах (ядро, митохондрии, хлоропласты, ЭПР) (Waters et al., 1996; Boston et al, 1996; Vierling, 1991).
Защитный эффект БТШ/шаперонов объясняется системной, согласованной работой всех представителей этого класса стрессовых белков. Согласно одному из системных механизмов действия молекулярных шаперонов агрегаты частично денатурировавших белков разбиваются шаперонами семейства БТШ100/С1р и затем восстанавливаются при помощи системы БТШ70 (Glover, Lindquist, 1998; Goloubinoff et al, 1999; Zietkiewicz et al, 2004); окончательную форму белкам придают шапероны семейства БТШ60 (GroEL-GroES) (Peres Ben-Zvi, Goloubinoff, 2001). Другой механизм состоит в том, что низкомолекулярные БТШ связываются с частично поврежденными белками, предотвращая их агрегацию и формируя пул субстратов для последующего восстановления шаперонами семейств БТШ70/БТШ100, как было показано на Е. coli (Veinger et al., 1998; Mogk et al., 2003a; Mogk et al., 20036), Synechocystis sp. PCC6803 (Mogk et al., 2003a), растительных белках (Smykal et al, 2000; Lee, Vierling, 2000; Mogk et al., 2003a).
Суть совместной работы БТШ100/С1р с нмБТШ заключается в том, что нмБТШ вместе с частично денатурировавшими белками формируют крупные агрегаты. В этих агрегатах субстратные белки упорядочены, что облегчает работу для БТШЮО/Clp по разъединению этих агрегатов. Затем субстратные белки восстанавливаются шаперонами БТШ70 (Mogk et al., 2003b). Кооперативность в работе БТШЮО/Clp и класса I нмБТШ была показана у бактерий (E.coli) (Giese, Vierling, 2002; Mogk et al., 2003a) и растений (горох) (Mogk etal., 2003b).
Итак, каждое семейство БТШ функционирует на каком-то отдельном участке жизни клетки, однако основным принципом деятельности этой системы защитных белков, по-видимому, является совместная работа всех представителей молекулярных шаперонов. Судьба частично денатурировавших белков определяется всей совокупностью шапероновой системы клетки.
Стрессовые белки с молекулярными массами от 15 до 45 кД относятся к классу низкомолекулярных БТШ. Они количественно преобладают среди других полипептидов, которые растительная клетка синтезирует в стрессовых условиях (Waters et al., 1996; deRocher et al., 1991; Hsieh et al., 1992). Все нмБТШ растений кодируются ядерным геномом (Nieto-Sotelo, Но, 1987). нмБТШ принято классифицировать по признаку их локализации в клетке (Vierling, 1991). В настоящее время все изученные нмБТШ делят на шесть классов. нмБТШ I и II классов локализуются в цитозоле (Vierling, 1991), III класс в ядре (Siddique et al., 2003), нмБТШ одного класса локализуются в эндоплазматическом ретикулуме (Helm et al., 1993; Helm et al., 1995). К оставшимся двум классам относятся нмБТШ митохондрий (Lenne, Douce, 1994; Lenne et al, 1995; LaFayette et al, 1996) и пластид (Vierling, 1991). Формы нмБТШ органелл встречаются только у растений, за исключением митохондриальной нмБТШ22, обнаруженной также у дрозофилы (Morrow et al., 2000). Классы I и II цитозольных (ядерных) нмБТШ кодируются мультигенными семействами (Vierling, 1991). Внутри каждого класса нмБТШ сохраняется высокая гомология аминокислотных последовательностей отдельных белков. Такая же высокая гомология на аминокислотном уровне наблюдается внутри классов нмБТШ из разных растений. Однако нмБТШ разных классов значительно отличаются друг от друга последовательностью аминокислот (Waters et al., 1996; Scharf et al., 2001; Waters, 1995; Vierling, 1991).
Дыхательная система растительных митохондрий и окислительное фосфорилирование
Суть процесса окислительного фосфорилирования состоит в сопряжении потока электронов, направленного от субстратов (например, НАДН или сукцината) к кислороду, с перемещением протонов из матрикса митохондрий через мембрану в межмембранное пространство. Перенос протонов через мембрану осуществляется дыхательной цепью, представляющей собой электронтранспортный мультиферментный ансамбль. При этом на внутренней мембране генерируется градиент электрохимического потенциала протонов (протондвижущая сила), используемый для синтеза АТФ (Douce, 1985).
Дыхательная цепь митохондрий растений и животных имеет сходную организацию, основные отличия касаются цианид (СК)-резистентного пути переноса электронов и строения НАДН-дегидрогеназного сегмента дыхательной цепи (Robertrs et al., 1995; Soole, Menz, 1995). Растительные митохондрии способны окислять как эндогенный, так и экзогенный НАДН. Все переносчики электронов в митохондриях сгруппированы в четыре комплекса.
Комплекс I осуществляет перенос электронов от НАДН к убихинону. Он содержит ротенончувствительную НАДН-убихинон-оксидоредуктазу. В его состав входят ФМН и железосерные центры. Согласно современным данным на поверхности внутренней мембраны локализована НАДН-дегидрогеназа, резистентная к ротенону (М0І1ег, 2001). Благодаря деятельности «внешней» НАДН-дегидрогеназы окисляются цитозольные НАД(Ф)Н. Митохондрии животных используют для этой цели челночные механизмы, работающие с затратой энергии.
Комплекс 11 (сукцинат-убихинон-оксидоредуктаза) осуществляет транспорт электронов от сукцината к убихинону. В его состав входят ФАД и три железосерных центра. Перенос электронов на данном этапе ингибируется малонатом и оксалоацетатом; активируется сукцинатом, АТФ, АДФ, НАДН и др. агентами. Имеются сведения, что торможение активности сукцинат-дегидрогеназы оксалоацетатом, появляющееся после 2-6-ти часового охлаждения, выступает в качестве одного из механизмов, позволяющих растениям адаптироваться к действию низких температур (Войников, 1987).
Комплекс III (убихинон-цитохром с оксидоредуктаза) переносит электроны от восстановленного убихинона к цитохрому с. Его структурная организация в митохондриях растений изучена пока слабо. Известно, что в его состав входят цитохромы 5бо и 566, цитохром С] и железосерный белок Риске. Этот комплекс чувствителен к антимицину А (Шугаев, 1991).
Комплекс IV (цитохром с-оксидаза) осуществляет одну из терминальных реакций дыхательной цепи растений (другую обеспечивает альтернативная оксидаза). Цитохром с-оксидаза катализирует окисление цитохрома с, локализованного в межмембранном пространстве митохондрий, и восстановление кислорода до воды. Фермент содержит две простетические группы гема (а и а3), а также два атома меди. Цитохром с-оксидаза блокируется цианидом, азидом, СО. Это очень консервативный фермент, мало изменившийся в процессе эволюции (Геннис, 1997). В переносе электронов участвуют еще два переносчика, определяющих полную электронтранспортную последовательность: убихинон (CoQ) и цитохром с. Убихинон функционирует как переносчик электронов между НАДН - и сукцинатдегидрогеназами и цитохромной системой. В литературе также обсуждается его участие в антиокислительной защите клетки (Побежимова, Войников, 1999).
Перенос электронов через комплекс I, III и IV сопровождается транслокацией протонов через мембрану из матрикса в межмембранное пространство. По теории П. Митчелла электрохимический градиент протонов А цн+, является источником энергии для синтеза АТФ за счет обратного тока протонов через канал митохондриальной АТФ-синтазы (Скулачев, 1989). Механизм переноса протонов к АТФ-синтазе до сих пор неясен. Растительная АТФ-синтаза относится к АТФазам FoFj-типа и состоит из двух частей: гидрофильного Fi-комплекса, содержащего места связывания нуклеотидов и функционирующего в качестве АТФазы, и мембраносвязанного Fy-комплекса, который функционирует как протон-проводящий канал (Войников, 1989).
Еще одной отличительной чертой растительных митохондрий является наличие альтернативного пути переноса электронов, устойчивого к действию цианида. Он обусловливается активностью цианидрезистентной оксидазы (альтернативной оксидазы). Местом ответвления альтернативного от основного пути переноса электронов является убихинон. Альтернативная оксидаза катализирует перенос электронов от восстановленного убихинона на кислород с образованием воды (Moore, Siedow, 1991). При функционировании альтернативной оксидазы происходит заметное снижение эффективности синтеза АТФ, так как процесс окислительного фосфорилирования может осуществляться в данном случае только при окислении субстратов в первом пункте сопряжения (комплекс І) (Меденцев и др., 1999). С функционированием альтернативной оксидазы митохондрий связывают механизм защиты клетки от накопления активных форм кислорода, т.е. от окислительного стресса (Moller, 2001), и механизм термогенеза (Головко, 1999).
Создание условий водного дефицита
Суммарный клеточный белок выделяли стандартным способом из термически обработанных, подсушенных или контрольных проростков и изолированных митохондрий. Надосадочную жидкость после осаждения ядер, компонентов клеточной стенки и митохондрий, полученную в ходе процесса изоляции митохондрий, тоже использовали для выделения водорастворимого белка по описанному методу. Эту фракцию белка далее будем называть "цитоплазматической". 3-5 проростков, замороженных в жидком азоте, быстро растирали в ступке до состояния порошка и экстрагировали белки в 2 мл 0,1 М Tris-HCl-буфера (рН 7,6), содержащего 12 мМ меркаптоэтанола, 0,1 % ДДС, 1 мМ фенилметилсулфонил флюорида ("Sigma") и 10 мМ ЭДТА. Полученный гомогенат центрифугировали 10 мин при 17000 g в угловом роторе на центрифуге К-24 (Германия) для осаждения грубых клеточных компонентов. Осадок отбрасывали, а из супернатанта осаждали суммарный белок 10%-й ТХУ. После центрифугирования (7000 об\мин, 10 мин) его дважды промывали охлажденным ацетоном. Полученный белковый осадок затем растворяли 3 мин при кипячении на водяной бане в буфере для образца, содержащем 0,5 М Tris-НС1 (рН 6,8), 12 мМ меркаптоэтанола, 10 % ДДС-Na, 20% глицерина ("Sigma"), 1 мМ ЭДТА и краситель бромфеноловый синий (0,001%) (Laemmli, 1970). Нерастворившийся осадок отбрасывали после центрифугирования (5000 g, 15 мин.), а полученный образец использовали для электрофореза.
В работе использовали метод A. Esen (1978), основанный на определении концентрации белка по степени развития окраски с Кумасси R-250. На хроматографическую бумагу Ватман N 541, предварительно разлинованную на квадраты размером 1,5x1,5 см, наносили по 5 мкл образца в каждую ячейку. Бумажные полоски с высохшими образцами фиксировали в течение 1 часа в водном растворе, содержащем 25% изопропанола и 10% уксусной кислоты. По окончании фиксации пробы окрашивали в течение 5 минут в водном растворе 0,1%о Кумасси R-250 ("Sigma", США). Образцы, хорошо промытые в дистиллированной воде, отмывали в течение 40 минут в водном растворе, содержащем 12,5%о изопропанола и 7% уксусной кислоты. Высохшие пятна с белковыми образцами мелко нарезали и инкубировали в течение часа при постоянном встряхивании в водном растворе, содержащем 30%о изопропанола и 15% уксусной кислоты. В один образец заливали 3 мл элютора. Поглощение определяли при длине волны 600 нм против 3 мл элютора на спектрофотометре Спекол-20 (ГДР). Калибровку проводили по бычьему сывороточному альбумину (БСА) в разведениях от 0,1 до 1 мг на 1 мл раствора. Повторность калибровки и определения белков - трехкратная.
Митохондрии выделяли методом дифференциального центрифугирования. Операции по выделению митохондрий проводили по стандартной методике (Войников и др., 1991; стр. 9) в специально оборудованном криостате. Разрушение растительной ткани проводили с помощью пресса. Соотношение навески растительного материала (г) и объема среды выделения (мл) составляло 1:3. для выделения митохондрий использовали среду, содержащую 0,3 М сахарозу, 50 мМ MOPS, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ MgCl2, 0.5% цистеина, 0,2% БСА, рН 7,4. Гомогенат, полученный после разрушения растительного материала, отжимали через капроновую ткань и для осаждения ядер и крупных клеточных фрагментов центрифугировали 3 мин при 7000 об\мин. Осадок отбрасывали, а митохондрии из супернатанта осаждали при 15000 об\мин в течение 3 мин. Полученный осадок промывали средой выделения, из которой был исключен цистеин. Повторное осаждение митохондрий после промывания проводили при 15000 об\мин в течение 3 мин. Полученную грубую фракцию митохондрий ресуспендировали в среде, содержащей 0,3 М сахарозы и 0,04 м MOPS и использовали для дальнейшей очистки. Для определения энергетической активности митохондрий использовали неочищенную фракцию органелл, ресуспендированную в среде, содержащей 40 мМ MOPS-КОН (рН 7.4), сахарозу (0.3 М), KCI (10 мМ), ЭДТА (2 мМ), MgCI2 (1 мМ), АТФ (4 мМ), АДФ (6 мМ) и субстрат окисления (10 мМ малата, 10 мМ глутамата) (среда ресуспендирования). Все операции по выделению митохондрий проводили при низких температурах (0-2 С). Все центрифугирования осуществляли с помощью углового ротора в охлажденной центрифуге К-24 (ГДР).
Очистку митохондрий проводили в градиенте перколла (Douce, 1985; Guillot-Salomon et al, 1997). В работе использовали ступенчатый градиент перколла, приготовленный на среде, содержащей, 0,3 М сахарозу, 0,01 М MOPS и 0,1% БСА (рН 7,4). Прерывистый градиент состоял из 3, 14 и 8 мл 18, 23 и 35% перколла, соответственно.
Суспензию митохондрий, выделенных из контрольных и "стрессированных" проростков, наслаивали на градиент перколла ("Sigma", США) и центрифугировали при 13500 об\мин в течение 40 минут. При фракционировании митохондрий получали четыре фракции клеточных компонентов. Фракция интактных митохондрий находилась на границе 23\35% перколла. Эту фракцию отбирали и промывали от перколла разбавлением отобранной митохондриальной суспензии средой ресуспендирования в 20 раз (объем\объем). Осаждение митохондрий из разбавленной суспензии проводили при 14000 об\мин в течение 10 мин. Осадок очищенных митохондрий повторно промывали 10 объемами среды ресуспендирования, переосаждали при 14000 об\мин в течение 5 мин и поднимали в 100-150 мкл среды, содержащей 0,3 М сахарозу и 0,04 М MOPS (рН 7.4). Очищенные митохондрии небольшими порциями хранили в жидком азоте и затем использовали в экспериментах. Центирфугирования осуществляли в центрифуге GR20.22 (Франция) (ротор AG100/14).
Влияние температуры проращивания на дыхательную активность изолированных митохондрий из проростков кукурузы
Из контрольных и подвернутых тепловому стрессу (42С, 3 ч.) проростков кукурузы, пшеницы и ржи выделяли суммарный клеточный белок, разделяли его с помощью электрофореза в ПААГ с ДДС-Na и после переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану проводили реакцию с антителами против нмБТШ. Иммуноблоттинг с суммарным клеточным белком показал, что нмБТШ, гомологичные а-кристаллину, присутствовали в клетках проростков уже в контроле, т.е. при 23С (пшеница и рожь) и 27С (кукуруза) (рис. 1).
Небольшое количество стрессовых белков в период прорастания накапливалось в тканях кукурузы, несколько больше - у пшеницы и ржи. После действия на проростки высокой температуры содержание нмБТШ в тканях увеличилось.
Общепринятый факт, что экспрессия нмБТШ начинается, как правило, только в неблагоприятных условиях (Sun et al., 2002). Однако, в некоторых случаях нмБТШ экспрессируются и в оптимальных условиях жизни растения. В литературе имеются сведения о появлении нмБТШ, родственных а -кристаллину, и при оптимальных температурных условиях в созревающих и зрелых зародышах, но при этом отмечается корреляция между появлением нмБТШ и приобретением зародышами термоустойчивости (Wehmeyer, Vierling, 2000). Это позволяет предполагать участие нмБТШ в механизме защиты растительной клетки от какого-то повреждающего действия. Видимо, в случае зародышей этим повреждающим воздействием является обезвоживание (Leprince et al., 1994; Wehmeyer, Vierling, 2000). Однако в приведенном опыте причиной появления нмБТШ в "контрольных" условиях могла явиться температура проращивания побегов, которая оказалась достаточной для индукции синтеза нмБТШ (рис. 2). пшеница рожь к ТШ к ТШ Рисунок 1. Накопление низкомолекулярных белков теплового шока (нмБТШ) в проростках кукурузы, пшеницы и ржи в контроле и под действием теплового шока.
Суммарный белок выделяли из контрольных (к) и стрессировапиых (42 С, 3 ч., ш) проростков и фракционировали в 14%-ном ПААГ с ДДС-Na. Мембрану инкубировали с антителами против а-кристаллинового домена {разведение 1:500). Контроль - проростка, обработанные температурами 27 С (кукуруза) и 23 С (пшеница и рожь). Напротив стрелок обозначены молекулярные массы нмБТШ.
Для того чтобы убедиться, что именно повышенная температура выращивания стала индуктором экспрессии имБТШ, проростки пшеницы и ржи были выращены при температуре 20 С Затем также была проведена реакция с антителами с суммарным белком, выделенным из 3-4-суточных проростков. На иммунограмме видно, что при более низких температурах проращивания семян пшеницы и ржи (20, а не 23С) нмБТШ в спектре суммарного клеточного белка отсутствовали (рис. 2). Вероятно, температура 23 С не совпадает с температурным оптимумом роста пшеницы и ржи. В этой температурной зоне начинаются адаптивные изменения. Одним из адаптивных изменений может быть экспрессия стрессовых белков уже при 23 С. Это совпадает с представлением о низком температурном оптимуме прорастания у пшеницы и ржи. Действительно, у яровой пшеницы оптимальная температура появления жизнеспособных всхолов - 10-12 (Коровин, 1984). Для большинства сортов ржи, возделываемых в Сибири, оптимальная температура прорастания находится в интервале 2-8пС (Реймерс, Илли, 1978). Реймерс и Илли наблюдали а б пшеница рожь пшеница рожь к ТШ к ТШ к ТШ к ТШ Рисунок 2. Накопление низкомолекулярных БТШ под действием теплового шока (42 С, 3 ч.) в проростках пшеницы и ржи при разной температуре проращивания.
Суммарный белок выделяли из контрольных (к) и стрессированпых проростков (ТШ). а - проращивание при 20 С; б - проращивание при 23 С. Условия иммуноблоттинга как в подписи к рисунку 1. Контроль- проростки, обработанные температурами 20 С и 23 С. Слева обозначена молекулярная масса низкомолекулярного БТШ. прорастание семян озимой ржи даже при температуре ниже 0С (Реймерс, Илли, 1978). Кроме того, градации в экспрессии стрессовых белков у пшеницы и ржи в диапазоне температур 20-22 С могут быть обусловлены особенностями взятых сортов.
Итак, конститутивный синтез нмБТШ в проростках пшеницы и ржи зависит от температуры проращивания семян. Но скорость дыхания изолированных митохондрий проростков не зависит от выбранных нами температур проращивания. Возникает вопрос, не связана ли такая разница в температурной зависимости скорости дыхания и накопления конститутивных нмБТШ в суммарной фракции с разницей в накоплении нмБТШ в митохондриях; происходит ли ассоциация нмБТШ с митохондриями при температурах проращивания 27С (для кукурузы) и 23С (для пшеницы и ржи), и какие из обнаруженных стрессовых белков накапливаются в митохондриях в условиях теплового шока.
