Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ВЛИЯНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА ЦИАНОБАКТЕРИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 7
1.1. Общая характеристика цианобактерий 7
1.2. Систематическая принадлежность цианобактерий 11
1.3. Азотфиксирующая способность цианобактерий 15
1.4. Вопросы биологии и экологии представителей рода Cylindrospermum 22
1.5. Диагноз вида Cylindrospermum michailovskoense Elenk 34
1.6. Особенности распространения представителей рода Cylindrospermum в почвах 35
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ. 42
2.1. Выделение и культивирование С. michailovskoense в лабораторных условиях 42
2.2. Методика изучения влияния экологических факторов на С. michailovskoense 44
ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ CYLINDROSPERMUM MICHAILOVSKOENSE 48
Динамика развития С. michailovskoense на твёрдых и жидких питательных средах 48
3.1. Температура 50
3.2. Реакция среды. 57
3.3. Засоление 64
3.4. Тяжёлые металлы 71
3.5. Гербициды. 89
3.6. Удобрения 95
ГЛАВА 4. ГРАНИЦЫ УСТОЙЧИВОСТИ CYLINDROSPERMUM MICHAILOVSKOENSE К ЭКОЛОГИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ 105
ВЫВОДЫ 112
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 114
ПРИЛОЖЕНИЕ 150
- Систематическая принадлежность цианобактерий
- Выделение и культивирование С. michailovskoense в лабораторных условиях
- Температура
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из основных задач современной экологии является разработка подходов к сохранению и рациональному использованию биологического разнообразия в условиях усиления антропогенного пресса. Избыточное содержание различных поллютантов (тяжёлых металлов, удобрений, гербицидов и др.), помимо непосредственного токсического эффекта и уничтожения существенной части флоры, приводит к загрязнению почвы, что нарушает внутриценотические связи и обуславливает сдвиг экологического равновесия в биосфере.
Цианобактерий составляют активную автотрофную часть микробиоты, связанную со сложными взаимодействиями, как со всеми ее гетеротрофными компонентами, так и собственно с почвой и высшими растениями, и принимают разнообразное участие в биологической жизни почв. Цианобактерий относительно просто культивируются, служат удобными объектами для исследования и могут быть использованы для биоиндикации (Кабиров, 1993, 1995; Штина и др., 1998; Патова и др., 2000; Киреева и др., 2003). В отличие от других представителей цианобактерий, гетероцистные формы способны к азотфиксации и играют важную роль в создании органического вещества (Штина, Голлербах, 1976; Halperin et al., 1992; Evans, 1994; Liengen, Olsen, 1997; Zaady et al., 1998). Цианобактерий реагируют на широкий спектр антропогенных воздействий и могут использоваться в качестве модельного объекта при изучении механизмов повреждающего действия экологических факторов на почвенные экосистемы.
Цель и задачи исследования. Целью исследований явилось изучение биологии и экологии почвенной цианобактерий Cylindrospermum michailovskoense Elenk.(Cyanoprokaryota)
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
Провести морфометрический анализ вегетативных клеток, гетероцист и спор С. michailovskoense в лабораторных условиях
Изучить влияние экологических факторов среды (температура, рН среды, засоление, тяжёлые металлы, гербициды, удобрения) на морфометрические показатели С. michailovskoense
Выделить границы устойчивости С. michailovskoense к экологическим факторам
Научная новизна. Впервые в лабораторных экспериментах изучена биология и экология цианобактерии С. michailovskoense. Установлена степень устойчивости С. michailovskoense к ряду экологических факторов природного и антропогенного происхождения. Выявлен характер вариабельности морфологических признаков вегетативных клеток, гетероцист и спор как при длительном культивировании в лабораторных условиях, так и под действием исследованных экологических факторов. Установлены экологические границы сохранности морфологического статуса данного вида.
Практическая значимость работы. Полученные данные дополняют знания по биологии и экологии вида С. michailovskoense. Сведения о границах устойчивости к экологическим факторам природного и антропогенного происхождения позволят использовать С. michailovskoense в биоиндикационных исследованиях. Результаты работы могут быть включены в лекционные и специальные курсы экологии, почвенной альгологии и систематики растений в высших учебных заведениях, а также в разработку методических рекомендаций по реализации экологического образования школьников в рамках предмета «Биология и экология».
Апробация. Материалы исследований докладывались на I Всероссийской научно-практической конференции «Альгологические исследования: современное состояние и перспективы на будущее» (Уфа, 2006), VIII Всероссийской научно-практической конференции «Наука и
молодёжь» (Нижний Новгород, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Экологическое образование в целях устойчивого развития — 2» (Самара, 2007), VI Международной научной конференции «Экология и биология почв» (Ростов-на-Дону, 2007), VII Международной научно-практической конференции «Состояние биосферы и здоровье людей» (Пенза, 2007), Международной научно-технической конференции «Наука и Образование» (Мурманск, 2008), Международной конференции «Экологические проблемы бассейнов крупных рек - 4» (Тольятти, 2008), Всероссийской школе-семинаре «Проблемы современной альгологии» (Уфа, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, из которых 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы (405 наименований, в том числе 244 на русском, 161 на иностранных языках) и 22 приложения. Общий объём работы составил 194 страниц, в том числе 150 страниц основного текста, 10 таблиц, 27 рисунков.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность и благодарность научному руководителю доктору биологических наук, профессору P.P. Кабирову за помощь, оказанную при выполнении данной работы. Искренне признательна, доцентам, к.б.н. Л.А. Гайсиной, Н.В. Сухановой, А.И. Фазлутдиновой, Е.В. Сугачковой, всем сотрудникам, аспирантам кафедры ботаники, биоэкологии и ландшафтного проектирования за оказанную помощь в работе.
Систематическая принадлежность цианобактерий
Цианобактерии - древнейшая группа среди живых организмов. Остатки организмов, близких современным цианобактериям, найдены среди строматолитов - слоистых меловых отложений, возраст которых составляет около трёх миллиардов лет (Костяев, 2001; Орлеанский, 2002; Castenholz, 1992; Schopf, 1996). Некогда именно их фотосинтез стал основой «кислородной революции», в корне изменившей атмосферу Земли. Протерозой иногда называют «эрой цианобактерии», потому, что именно в этот период в отложениях различных геологических пород наблюдалось наибольшее разнообразие их ископаемых остатков (Сергеев и др., 2002). Благодаря своей долгой эволюционной истории цианобактерии смогли накопить тот запас адаптационных свойств, который помог им освоить практически все типы местообитаний, существующих на нашей планете и стать важным компонентом автотрофного блока биосферы (The Ecology.., 2000).
Систематика цианобактерий была обсуждена и пересмотрена много раз (Anagnostidis, Komarek 1985, 1988). Исторически сложилось так, что на протяжении почти всего XX века в систематике цианобактерий царила «морфологическая» концепция вида, в которой основной таксономический вес имели морфологические и размерные признаки. В последние десятилетия концепция вида у цианобактерий претерпела значительные изменения, связанные с активным развитием молекулярно-биологических исследований и применением полифазного подхода, который цианологи переняли от бактериологов. Полифазный подход при определении вида требует учитывать генетические, морфологические, цитологические, физиологические и экологические особенности идентифицируемого штамма (Виноградова, 2007).
Традиционно цианобактерий принадлежали к объектам альгологии (фикологии), и поскольку все водоросли, в том числе и цианобактерий относили к царству растений, то их номенклатура регулировалась правилами «Международного кодекса ботанической номенклатуры» (1980).
В конце 70-х годов XX века Р. Станье (Stanier, 1977; Stanier et al., 1978) с группой бактериологов, учитывая прокариотическую природу цианобактерий, предложил переподчинить их номенклатуру правилам «Международного кодекса номенклатуры бактерий» (1978). В то время термины «бактерии» и «прокариоты» для бактериологов звучали как синонимы (Stanier, Van Niel, 1962). Это предложение вызвало негативную реакцию у многих исследователей (Кондратьева, 1981), которые обращали внимание на фундаментальные отличия в подходах к систематике бактерий и растений, первая из которых основывалась на свойствах культуральных штаммов, а вторая имела дело исключительно с материалом, взятым непосредственно из природы. В то время, согласно Ботаническому кодексу, типовые экземпляры, на которых базировались описания новых таксонов, не могли быть живыми растениями или культурами, а должны были сохраняться в виде эксиккат либо гербария, а Бактериологический кодекс, наоборот, требовал наличия аксенической культуры типового штамма, который должен был быть депонирован в коллекции. Н. В. Кондратьева в своих трудах (Кондратьева, 1981) дала детальное обоснование недопустимости подчинения цианобактерий кодексу бактерий: новые виды описываются по выделенным из природы чистым культурам, и в качестве номенклатурных типов обозначаются отдельные живые штаммы (т.е. совокупности особей).
В классических трудах зарубежных исследователей (Gomont, 1892; Til-den, 1928) выдвигались различные подходы к систематике цианобактерий, в основе которых лежали преимущественно морфологические и цитологические признаки, при этом экофизилогические особенности не рассматривались. В 1875 году М. Тюре (Thuret, 1875) поделил класс Cyanophyceae на два порядка: Chroococcaceae (Coccogoneae) и Nostochineae. К первому он отнёс одноклеточные и колониальные цианобактерий, размножающиеся вегетативным делением, а ко второму - только многоклеточные формы, размножающиеся гормогониями, реже спорами. Это разделение в целом сохранилось во всех последующих системах цианобактерий, отличаясь лишь рангом таксонов, которые выделяют по указанным признакам (от семейств до отделов).
Наиболее разработанными и обоснованными системами цианобактерий, базирующимися на морфолого-онтогенетическом подходе были системы Л. Гейтлера (Geitler, 1932) и А.А. Еленкина (1934; 1938, 1949). Именно они использовались при написании всех определителей и флор цианобактерий, выходивших на протяжении почти всего XX века.
В конце 80-х годов XX века И. Комарек и К. Анагностидис (Komarek, Anagnostidis, 1986; 1989, 1995, 1998) предложили свой вариант системы цианобактерий, в котором наряду с морфологическими признаками использовали цитологические, физиолого-биохимические и молекулярно-биологические данные. Авторы предложили назвать отдел цианобактерий Cyanoprokaryota Komarek et Anagnostidis (1995) и поделили его на 4 порядка: Chroococcales (все одноклеточные формы), Oscillatoriales (нитчатые гомоцитные формы), Nostocales (однорядные гетероцитные формы) и Stigonematales (многорядные гетероцитные формы). В системе И. Комарека и К. Анагностидиса (1995) удачно соединяется классический морфологический метод при определении видов и родов с полифазным подходом при установлении таксонов более высокого ранга (Виноградова, 2007).
В настоящее время цианобактерии рассматриваются как самостоятельный отдел и делится на 5 групп (Rippka et al., 1979; Rippka, 1988; Castenholz, Waterbury, 1989; Rowell, Kerby, 1991; Castenholz, 1992; Rippka, Herdman, 1992; Wilmotte, 1994; Castenholz, Phylum, 2001; Tamagnini et al, 2002). В 1-ю и 2-ю группы входят «одноклеточные формы, клетки одиночные или образуют колониальные агрегации, которые удерживаются вместе за счет дополнительных внешних слоев клеточной оболочки», а представители 3-5-й групп характеризуются как «нитчатые формы, трихомы растут за счёт интер-калярного деления клеток». Данная система цианобактерии учитывает морфологические, ультраструктурные, физиолого-биохимические, молекулярно-биологические и культуральные признаки, а также экологические характеристики изученных штаммов.
Выделение и культивирование С. michailovskoense в лабораторных условиях
Для выделения С. michailovskoense в культуру использовали классический почвенно-альгологический метод по типу чашечных культур со «стёклами обрастания» (Lund, 1945; Голлербах, Штина, 1969; Кузяхметов, Дубовик, 2001). Анализируемую почву помещали в чашки Петри и на её поверхности размещали по 4 стерильных покровных стекла. Почву периодически увлажняли дистиллированной водой до 80 - 100% от полной влагоёмкости. С пробы ставили по 2 чашки Петри с 4 стёклами. Просмотр проводили на 7 - 10 дни. Культуру выращивали на осветительной установке (лампы ЛБ-40, чередование световой и темновой фаз 12:12 ч, освещённость 1700 - 2500 лк).
Обычно в почвенной альгологии просматривают не всю поверхность стекла, а только 5 полос (трансект): четыре - по краям покровного стекла, одну - через центр. Такая методика оправдывает себя при анализе видового состава водорослей или цианобактерий. Однако для изучения их морфологических свойств необходимо исследовать большое количество особей (исчисляемое несколькими десятками). Поэтому для анализа морфологии клеток цианобактерий С. michailovskoense подсчитывали все особи вида на стекле, которые исследовали по 6 морфологическим параметрам: длина и ширина вегетативных клеток, гетероцист и спор. Линейные размеры клеток измеряли в микрометрах (мкм). Для изучения биологии и морфологии вида получали альгологически чистые культуры цианобактерий. Для этого с поверхности покровных стёкол и с поверхности стенок чашки Петри, на которых наблюдалось массовое развитие вида С. michailovskoense, делали мазок на агаризованную среду в чашке Петри при помощи микробиологической петли. Через 1—2 недели чашку просматривали под микроскопом и препаровальной иглой отделяли чистые колонии цианобактерий или одиночные нити, которые пересаживали на агаризованную среду. Аналогичный пересев на агар-агар производили несколько раз до получения чистых культур цианобактерий. После получения чистой культуры на агаре производили ее пересев в жидкую питательную среду. Этот способ получения альгологически чистых культур значительно эффективнее метода пересева с использованием жидкой накопительной культуры (Сиренко и др., 1975), так как позволяет получить чистую культуру в более короткие сроки. Полученные штаммы хранили в коллекции микроводорослей и цианобактерий Башгоспедуниверситета им. М. Акмуллы с соблюдением правил хранения культур (Сиренко и др., 1975) на жидкой питательной среде Чу - 10 (Chu, 1942), состав солей (г/л дистиллированной воды): Ca(N03)2 - 0,01; КН2Р04 - 0,025; MgS04 7Н20 -0,02; Na2C03 - 0,025; Na2Si03 9 Н20 - 0,025; FeCl3 6 Н20 - 0,0008 и на агаризованной питательной среде Чу - 10 (на косяках и на чашках Петри). При приготовлении агаризованной питательной среды использовали хлопьевидный агар.
Выбор среды обосновывался тем, что на ней успешно культивировались цианобактерий Nostoc muscorum, Anabaena variabilis, и др. После выделения чистой культуры цианобактерий С. michailovskoense проводили 3 просмотра: первый - через 7 дней после пересадки, второй и третий - через 14 и 20 дней соответственно. При каждом просмотре измеряли по 150 вегетативных клеток, гетероцист, спор (всего 450 измерений). Пересев образцов культуры в жидкой среде производили через 1 месяц, на агаризованной среде - через 2 месяца.
С целью детального изучения биологии и морфологии данного штамма проводили наблюдение в жидкой питательной среде с момента пересева на свежую питательную среду до появления признаков старения культуры.
Измерения проводили с помощью светового микроскопа серии ЛОМО МИКМЕД-1 (объектив 40, апертура 0,65) при помощи окуляр-микрометра 510. Микрофотографии выполнялись с использованием фотоаппарата Canon А95 с фотонасадкой при увеличении 40 (апертура 0,65).
Температура
Температура - один из важнейших экологических факторов, влияющих на жизнедеятельность организмов и определяющий их распространение (Одум, 1986; Бигон и др., 1989; Шилов, 1998; Миркин, Наумова, 2005).
Известно, что температура окружающей среды оказывает влияние на функциональную активность клеток цианобактерии, ускоряя или ингибируя процессы метаболизма (Курейшевич и др., 2003). Цианобактерии, также как и водоросли, относятся к организмам, которым свойственен широкий диапазон температурной устойчивости. В литературе имеются многочисленные данные, характеризующие их термоустойчивость (Голлербах, Штина, 1969; Голлербах, Штина, 1976; Костяев, 1986; Сущик и др., 2003; Fogg, Thanun, 1960; Tarar, Jamal, 1980; Seki et al., 1981; Collins, Boylen, 1982; Robarts, Zo-hary, 1987; Reay et al., 1999; Rodney, 2002).
Широко известна теплоустойчивость многих цианобактерии, живущих в горячих источниках. Для термофильных цианобактерии максимальный температурный предел жизни составляет -85,2С (Библь, 1965, Штина, Голлербах 1976). Наиболее термостойкими оказались тонкие нитевидные формы из пор. Oscillatoriales (Штина, Голлербах 1976). Специальные опыты С. Ребеля (Rebel, 1959) показали высокую устойчивость почвенных водорослей и цианобактерии. Пробы почвы нагревались до разной температуры 1 и 4 часа при влажности 18 - 20% и в водной суспензии. Теплоустойчивость оказалась зависимой от продолжительности действия температуры, от влажности и от природы организма. Среди цианобактерии наиболее устойчивым оказался вид из представителей рода Cylindrospermum Cylindrospermum muscicola, который выдерживал нагревание в сухом состоянии в течение 4 часов при +98С. В исследованиях Ф. Р. Трайнора (Trainor, 1962) обнаружено переживание цианобактерии Anabaena в сухой почве после нагревания ее до +100С в течение часа. В ряде опытов с азотфиксирующими цианобактериями отме 51 чена способность их спор переносить 5 - 10-минутное нагревание в кипящей водяной бане (Перминова, 1964). Изучив термоустойчивость 40 видов почвенных цианобактерий Индии Р. Тэрер и Ф. Ямал (Tarar, Jamal, 1980) показали, что они способны выдерживать температуру до +50С. Наибольшую термоустойчивость проявляли Anabaena variabilis, A. fertilissima, N. piscinale, N. hatel. При темпрературе +90С рост этих видов прекращался. Температура +100С оказалась летальной для всех видов цианобактерий.
Некоторые пустынные почвенные водоросли и цианобактерий выдерживали автоклавирование при +115С в течение 20 минут в жидкой среде и дали последующий нормальный рост (Cameron, Blank, 1966).
В.В. Мельникова (1960) определяла максимальные температуры для жизни почвенных цианобактерий методом флуоресцентной микроскопии по движению нитей: у Osillatoria движение нитей прекращалось после 5-минутного нагревания при +48С, но через некоторое время оно возобновлялось, а при +50С окончательно прекращалось.
Многочисленными исследованиями (Александров 1963; Проссер, 1964; Гецен, 1985 и др.) установлено, что терморезистентность почвенных водорослей и цианобактерий обладает значительной пластичностью и сдвиг температурной устойчивости, как в лабораторных, так и в естественных условиях происходит при изменении температуры в пределах всей температурной шкалы.
Цианобактерий обычны среди криобионтов, но не все они одинаково морозостойки (Штина, Голлербах, 1976). В опытах Р. Гладе (Glade, 1914) споры некоторых видов Cylindrospermum и Nostoc выдерживали температуру до -80С, хотя вегетативные клетки их погибали через 4 дня при температуре -2-8С.
Температурный интервал, в котором возможно временное сохранение жизнеспособности спор цианобактерий, по своему диапазону значительно шире тех условий, которые пригодны для вегетативных форм этих организ 52 мов. Но и для последних необходимо различать выживаемость и жизнедеятельность при тех или других температурах.
Устойчивость к экстремальным температурам зависит и от почвенных условий, в которых обитают цианобактерии: виды из аридных районов выдерживают более высокие температуры, чем виды из почв умеренных районов. Как указывает Г. Фогг (Fogg, 1969), последние имеют температурную толерантность, не превышающую 30-35С.
Влияя на жизнеспособность цианобактерии, температура играет немаловажную роль в их азотфиксирующей способности.
Минимальная температура азотфиксации у цианобактерии в почвах умеренного климата лежит около нуля. Цианобактерии быстро восстанавливают активность после холодового шока. Даже после выпадения снега разрастания их остаются изумрудно-зелеными, и если потом опять наступают благоприятные условия, они сразу начинают азотфиксацию, хотя с небольшой скоростью. Следует заключить, что большинство азотфиксирующих цианобактерии подходит под понятие не стенотермных, а эвритермных организмов, границы, распространения которых часто определяются не средними, а крайними температурами. Это дает основание для оспаривания бытующего представления о том, что могут в массе развиваться на поверхности почв только в достаточно теплых географических широтах (Панкратова, 1981).
