Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Современные представления о структурно-функциональной реорганизации надпочечников в процессе онтогенеза и при действии экстремальных факторов 16
1.1. Структурная организация коры надпочечников в процессе онтогенеза и при адаптации организма 16
1.2. Физиологические и структурные реакции надпочечников при экстремальных воздействиях 25
1.3. Регенерация надпочечников при действии экстремальных факторов 34
1.4. Резюме 41
Глава II. Материал и методы исследования 43
2.1. Общая характеристика экспериментального материала 43
2.2. Методы светооптического и электронно- микроскопического исследования 45
2.3. Методики количественного морфологического анализа 46
2.4. Методика электрофизиологического исследования 48
2.5. Резюме 49
Глава III. Тканевые и ультраструктурные изменения надпочечников крыс при различных режимах гипоксических воздействий 50
3.1. Морфометрический анализ коры надпочечников при разных режимах гипоксии 50
3.2. Тканевая реорганизация коры надпочечников крыс при различных режимах гипоксического воздействия 53
3.3. Внутриклеточная реорганизация адренокортикоцитов при различных режимах гипоксического воздействия 82
3.4. Резюме 102
Глава IV. Тканевые и ультраструктурные изменения надпочечников мышей линии сва при общем перегревании 106
4.1. Морфометрический анализ коры надпочечников при общем перегревании организма 106
4.2. Тканевая реорганизация надпочечников мышей СВА при общем перегревании организма 108
4.3. Внутриклеточная реорганизация адренокортикоцитов мышей СВА при общем перегревании организма 124
4.4. Резюме 140
Глава V. Тканевые и ультраструктурные изменения надпочечников крыс Вистар и OXYS в разные периоды онтогенеза 144
5.1. Морфометрический анализ надпочечников крыс Вистар и OXYS ы процессе старения 144
5.2. Тканевая реорганизация надпочечников разновозрастных крыс линий Вистар и OXYS 147
5.3. Внутриклеточная реорганизация адренокортикоцитов разновозрастных крыс линий Вистар и OXYS 163
5.4. Резюме 174
Глава VI. Адаптивно-компенсаторная реорганизация коры надпочечников при экстремальных воздействиях, в процессе естественного и преждевременного старения (обсуждение результатов исследования) 181
Выводы 199
Список литературы 203
- Физиологические и структурные реакции надпочечников при экстремальных воздействиях
- Методы светооптического и электронно- микроскопического исследования
- Тканевая реорганизация коры надпочечников крыс при различных режимах гипоксического воздействия
- Тканевая реорганизация надпочечников мышей СВА при общем перегревании организма
Введение к работе
Актуальность проблемы. Надпочечники занимают одно из центральных мест в регуляции и реализации таких жизненно важных процессов, как рост, развитие (включая все этапы онтогенеза), репродуктивное поведение и адаптация организма к изменяющимся условиям существования, особенно при развитии общего адаптационного синдрома (стресс-реакции). Важность адаптивных перестроек структурно-функциональных систем организма, а именно его адекватное функционирование и выживание при кратковременном или хроническом действии стрессирующих факторов, определило на многие десятилетия приоритетное направление в изучении функциональной активности надпочечников – выяснение закономерностей их синтетической активности в динамике стресс-реакции с расшифровкой физиологической роли синтезируемых ими гормонов (Селье Г., 1967; Озернюк Н.Д., 1992; Кириллов О.И., 1994; Aguilera G. et al., 1996). Это направление исследований доминирует до сих пор, несмотря на то, что в последнее время все большее внимание уделяется изучению роли синтезируемых надпочечниками гормонов в регуляции и пространственно-временной организации физиологических (прежде всего, обменных) процессов, иммунного ответа и репродуктивного поведения, в том числе в различные периоды онтогенеза (Розен В.Б., 1984; Анциферова Н.Д., 1993, 1997; Parker C.R. et al., 1997; Nussdorfer G.G., Mazzocchi G., 1998; Yen S.C., Laughlin G.A., 1998; Rainey W.E. et al., 2001, 2002; Chen C.C., Parker C.R., 2004).
В основе регуляторного воздействия гормонов надпочечников на тканевые и внутриклеточные структуры лежит регуляция активности соответствующих генов, способных индуцировать и подавлять биосинтез белков, углеводов, липидов и влиять на энергетический и пластический обмен в органах-мишенях (Панин Л.Е., 1983; Розен В.Б., 1984; Чернышева М.П., 1995; Панин Л.Е. и др., 2001; Обут Т.А., 2004). Реализация общего адаптационного синдрома осуществляется через активацию гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси (системы) и сопряжена с усилением синтеза и секреции надпочечниками кортикостероидов и катехоламинов, служащих мощными регуляторами обмена веществ в органах и тканях. При этом интенсивное и длительное напряжение адреналовых желез, вызванное стрессирующими факторами, может вызывать истощение их пластических и энергетических ресурсов и обусловливать развитие адреналовой недостаточности, которая проявляется в резком снижении синтеза кортикостероидов (Laureti S. et al., 1998), что ведет к нарушению многих жизненно важных функций. Адреналовая недостаточность может развиваться и вследствие других причин, среди которых наиболее значимыми являются аутоиммунные заболевания, инфекционные процессы (например, туберкулез), массивные геморрагические повреждения, рак и генетически детерминированные заболевания (Shah B. et al., 1986; Werbel S.S., Ober K.P., 1993; Muscatelli F. et al., 1994; Oelkers W., 1996; Korenke G.C. et al., 1997).
Существенное влияние на функциональную активность надпочечников, их способность регулировать жизненно важные процессы и индуцировать адекватный адаптивный ответ оказывает процесс старения (Yen S.C., Laughlin G.A., 1998). Старение и хронический стресс реализуются посредством сходных физиологических и молекулярно-биологических механизмов, взаимно потенцируя друг друга. По мнению некоторых исследователей, хронический стресс ускоряет процесс старения организма, при этом стареющий организм теряет способность завершать стрессовый ответ, и это отражается на его возможностях по поддержанию гомеостаза (Дильман В.М., 1981, 1983; Pare W., 1965; Sapolsky R.M. et al., 1983). Старение, как и стрессовая реакция, сопровождается увеличением секреции глюкокортикоидов и снижением синтеза и секреции андрогенов надпочечниками (Lehmann J.M. et al., 1995; Kern W. et al., 1996; Yen S.C., Laughlin G.A., 1998). Постулируется положение, согласно которому гиперсекреция кортизола в позднем онтогенезе возникает в результате дегенеративных изменений головного мозга и нарушения ингибирования их синтеза из-за утраты чувствительности глюкокортикоид-опосредованного механизма обратной связи. Показано, что в гиппокампе мелких грызунов с возрастом исчезает примерно 50% сайтов связывания I типа (минералокортикоидных рецепторов) и примерно такое же количество сайтов II типа (глюкокортикоидных рецепторов) (Sapolsky R.M., 1993). Увеличение стрессорной нагрузки на протяжении жизни или введение глюкокортикоидов в фармакологических дозах способствуют гибели нейронов гиппокампа и снижению его ингибирующего влияния на гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ось.
Нарушения функциональной активности надпочечников при хроническом стрессе и в процессе геронтогенеза могут развиваться не только в результате изменения секреторной активности клеток гипоталамуса и гипофиза, но также из-за изменений микроокружения адренокортикоцитов в разных структурно-функциональных отделах железы. Физиологический рост, регенерация и функциональная активность надпочечников регулируются адренокортикотропным гормоном, нейротрансмиттерами, нейропептидами, цитокинами и разветвленной сетью ростовых факторов (Bornstein S.R., Chrousos G.P., 1999; Hammer G.D. et al., 2005; Karpac J. et al., 2005). В коре надпочечников выявлена дифференциальная экспрессия ряда цитокинов (интерлейкина-6, интерлейкина-1, фактора некроза опухоли , фактора, ингибирующего миграцию макрофагов, фактора, индуцирующего -интерферон, трансформирующего фактора роста 1) (Judd A.M., 1998). Эти цитокины синтезируются как адренокортикоцитами, так и постоянно присутствующими в коре надпочечников макрофагами и лейкоцитами. Адренокортикоциты и хромаффинные клетки имеют на своей поверхности рецепторы к интерлейкинам 1, 2 и 6, которые могут влиять на их пролиферативную и биосинтетическую активность (Nussdorfer G.G., Mazzocchi G., 1998).
Несмотря на то, что в последнее время вопросам регенерации надпочечников, особенно их коры, стало уделяться больше внимания, следует отметить, что эта проблема еще далека от разрешения. В исследованиях, посвященных регенераторным возможностям коры надпочечников, в большей степени освещены эмбриональные и онтогенетические (до периода геронтогенеза) аспекты зональной регенерации адренокортикоцитов (Mitani F. et al., 1999; Ennen W.B. et al., 2005). Представлены некоторые морфологические критерии изменения структурно-функционального состояния адренокортикоцитов в условиях общего охлаждения организма (Алябьев Ф.В. и др., 2007). Резервные возможности органа, особенно с точки зрения его регенераторных возможностей и компенсаторно-приспособительных реакций при воздействии на организм экстремальных экзогенных факторов и старении, изучены недостаточно. Большое значение для разработки прогностических критериев состояния надпочечников имеет выяснение закономерностей и особенностей внутриклеточной реорганизации адренокортикоцитов, в том числе и органелл, вовлеченных в процессы стероидогенеза, при действии экстремальных факторов и в процессе геронтогенеза.
Цель исследования – изучить общие закономерности и особенности тканевой и внутриклеточной реорганизации коры надпочечников экспериментальных животных при действии экстремальных экологических факторов (гипоксии, гипертермии) и при генетически детерминированных метаболических нарушениях, обусловливающих преждевременное старение.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.
1. На основе сравнительного гисто-стереологического анализа изучить закономерности пространственной тканевой реорганизации коры надпочечников при экстремальных экологических воздействиях (гипоксии и гипертермии).
2. Выяснить закономерности внутриклеточной реорганизации адренокортикоцитов крыс и мышей при экстремальных экологических воздействиях.
3. Изучить регенераторные возможности адренокортикоцитов на основе количественной оценки их общей численности в коре надпочечников в период посттепловой реституции.
4. Изучить особенности возрастной реорганизации коры надпочечников крыс линии OXYS, подверженных преждевременному старению.
5. Изучить особенности внутриклеточной реорганизации адренокортикоцитов в процессе естественного (крысы Вистар) и преждевременного (крысы OXYS) старения, обусловленного нарушениями метаболизма.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное морфологическое исследование структурной реорганизации коры надпочечников мелких грызунов при действии экстремальных экологических факторов (гипобарической гипоксии и общего перегревания организма) и в процессе естественного и преждевременного старения. Показано, что при острых стрессирующих воздействиях и в позднем онтогенезе развивается атрофия коры надпочечников, при многократных стрессирующих воздействиях – гипертрофия. Атрофические изменения коры надпочечников при действии острых стрессирующих факторов носят транзиторный характер, в процессе геронтогенеза атрофия коры является отражением необратимого инволютивного процесса и наиболее выражена при генетически детерминированных нарушениях метаболизма, обусловливающих преждевременное старение.
Впервые установлено, что общей закономерностью структурной реорганизации коры надпочечников при действии стрессирующих факторов и в процессе геронтогенеза является диспропорциональный характер изменений размерных характеристик образующих кору структурно-функциональных зон. При острых стрессирующих воздействиях уменьшение ширины клубочковой и пучковой зон сопровождается увеличением ширины сетчатой зоны. При многократных воздействиях стрессирующего фактора происходит более значительное увеличение ширины пучковой зоны по сравнению с сетчатой при уменьшении ширины клубочковой зоны.
Впервые показано, что в процессе естественного старения (крысы Вистар) происходит такое же ремоделирование коры надпочечника, как и при многократных стрессирующих воздействиях, заключающееся в непропорциональном увеличении ширины пучковой зоны. У преждевременно стареющих крыс OXYS стрессогенный фенотип коры надпочечника развивается уже в молодом возрасте (5 мес), и в позднем онтогенезе происходит его реверсия. Установлено, что закономерностью возрастной структурно-функциональной реорганизации коры надпочечников является уменьшение ширины сетчатой зоны.
Установлено, что при действии на организм однократных и многократных стрессирующих факторов в коре надпочечников развиваются стереотипные морфофункциональные изменения: делипидизация адренокортикоцитов, нарастание гетерогенности адренокортикоцитов и полнокровие капилляров, особенно в сетчатой зоне. Показано, что морфофункциональные перестройки в надпочечниках сопровождаются изменениями показателей электропроводности – увеличением коэффициента поляризации и низкочастотного сопротивления.
Впервые показано, что общей закономерностью пространственной реорганизации коры надпочечников у мелких грызунов при действии экстремальных экологических факторов (гипобарической гипоксии и общем перегревании) и в процессе геронтогенеза является увеличение объемной плотности, объемного и поверхностно-объемного отношения капилляров к адренокортикоцитам. Увеличение объемного отношения капилляров вносит основной вклад в увеличение стромально-паренхиматозных отношений при действии экстремальных факторов и старении. Показано, что введение нероболила снижает, но не устраняет диспропорциональный характер изменений структурных плотностей капилляров и адренокортикоцитов.
Впервые показано, что при остром и хроническом действии экстремальных экологических факторов сохраняется регенераторный потенциал адренокортикоцитов, что у крыс проявляется в значительном увеличении ширины камбиального слоя, а у мышей – в увеличении концентрации адренокортикоцитов в 1 мг ткани в период посттепловой реституции.
Впервые установлены особенности внутриклеточной реорганизации адренокортикоцитов при действии экстремальных экологических факторов и в процессе геронтогенеза. Показано, что стрессогенная внутриклеточная реорганизация адренокортикоцитов определяется тремя основными событиями – развитием общего адаптационного синдрома (истощение липидных капель, уменьшение объемного отношения липосом к митохондриям), нарастанием регенераторно-пластической недостаточности клеток (сегрегация нуклеолонемы, деструкция митохондрий, усиление процессов аутофагоцитоза) и развитием процессов внутриклеточной регенерации. Впервые показано, что отличием возрастного ремоделирования адренокортикоцитов от стрессогенного является увеличение объемного отношения липосом к митохондриям и накопление в клетках липофусцина.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные представляют собой новые знания о закономерностях структурной реорганизации коры надпочечников при действии экстремальных экологических факторов и в процессе старения. Полученные результаты раскрывают особенности тканевых, клеточных и внутриклеточных перестроек коры надпочечников при острых и хронических стрессирующих воздействиях и в процессе естественного и преждевременного старения, обусловленного генетически детерминированными нарушениями обмена веществ. Данные о выраженности регенераторных реакций адренокортикоцитов имеют большое значение для выяснения резервных возможностей надпочечников при развитии адаптивно-компенсаторных реакций и старении организма.
Результаты исследования имеют фундаментальное значение, поскольку показывают наличие общих биологических детерминант в формировании стрессогенного и возрастного вариантов ремоделирования коры надпочечников. Полученные данные могут быть использованы для разработки морфофункциональных диагностических и прогностических критериев состояния как адреналовой железы, так и организма в целом при экстремальных воздействиях (гипоксия и гипертермия), а также в процессе старения.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Закономерностью адаптивно-компенсаторного и возрастного ремоделирования коры надпочечников является диспропорциональный характер изменений размерных характеристик ее структурно-функциональных зон. Стрессогенный вариант ремоделирования коры характеризуется непропорциональным увеличением ширины пучковой зоны и уменьшением ширины клубочковой зоны. Для возрастного ремоделирования характерно стойкое уменьшение ширины сетчатой зоны.
2. К закономерностям пространственной реорганизации коры надпочечника при экстремальных экологических воздействиях, при естественном и преждевременном старении относится увеличение объемной плотности, объемного и поверхностно-объемного отношения капилляров к адренокортикоцитам, которое определяет увеличение объемного отношения стромы к паренхиме.
3. При острых и хронических стрессирующих воздействиях сохраняется регенераторный потенциал адренокортикоцитов, что проявляется в выраженном увеличении камбиального слоя, особенно в условиях многократного действия стрессирующего фактора. Гиперпластические реакции адренокортикоцитов в постстрессовый период проявляются в значительном увеличении концентрации клеток в 1 мг ткани.
4. Внутриклеточная реорганизация адренокортикоцитов после экстремальных воздействий (гипоксия и гипертермия) определяется тремя основными событиями – развитием общего адаптационного синдрома, нарастанием регенераторно-пластической недостаточности клеток и развитием процессов внутриклеточной регенерации. Возрастное ремоделирование адренокортикоцитов в отличие от стрессогенного проявляется в увеличении объемного отношения липосом к митохондриям и накоплении в клетках липофусцина.
Объем и структура диссертации. Содержание диссертации изложено на 250 стр. компьютерного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 глава), характеристики материала и методов исследования (1 глава), собственных исследований (3 главы), обсуждения полученных результатов (1 глава), выводов и списка литературы (400 источников). Диссертация иллюстрирована 35 таблицами и 90 рисунками (микрофотографиями и электронограммами).
Физиологические и структурные реакции надпочечников при экстремальных воздействиях
Современная теория адаптации складывается из описания нескольких феноменов - «постоянство внутренней среды организма» Бернара, «гомео-стазиса» Кеннона, «общего адаптационного синдрома» Селье, «теории функциональных систем» Анохина, «системного структурного следа адаптации и феномена адаптивной стабильности» Меерсона (Селятицкая В.Г., Обухова Л.А., 2001).
Нервная система является центральным звеном регуляции, контролирующим интенсивность и направленность обменных и пролиферативных процессов, их скорость соответственно меняющимся условиям среды. Следующим звеном системы жизнеобеспечения выступает гормональная регуляция, осуществляемая эндокринным аппаратом. В основе реагирования ги-пофизарно-адреналовой системы на любое воздействие лежит нервный импульс, возникающий в соответствующих рецепторах, который поступает в промежуточный мозг, активизирует кортиколиберинпродуцирующие нейроны гипоталамуса. В этих нейросекреторных клетках происходит преобразование нервного сигнала в гормональный. Попадающий в гипофиз корти-колиберин стимулирует синтез и секрецию АКТГ, что в свою очередь усиливает секрецию в корковом веществе надпочечников (Филаретов А.А., 1987; Murakami К. et al., 1989; Tsigos С, Chrousos G.R., 1994).
Активация адреналовых желез, приводящая к резкому увеличению синтеза гормонов и их секреции, является элементом неспецифической реакции живой системы на стресс (Журавлева Т.Б. и др., 1976; Мельник Б.Е. и др., 1985; Фурдуй Ф.И., 1986; Филаретов А.А. и др., 1994). Убедительным доказательством роли глюкокортикоидов в осуществлении адаптивных реакций являются эксперименты с удалением железы и экзогенным введением АКТГ и/или кортикостероидов. Удаление надпочечников резко понижало устойчивость животных, в частности к гипоксии, особенно при условии мышечной деятельности, в то время как введение АКТГ приводило к час 26
тичной нормализации, иногда даже повышению устойчивости к воздействию. Предварительное введение глюкокортикоидов резко увеличивало продолжительность жизни животных и сокращало восстановительный период после воздействия. Удаление надпочечников полностью предотвращало развитие гипергликемии, которую можно отнести к категории адаптивных механизмов, выработавшихся в процессе эволюции (Колпаков М.Г., 1980).
Вырабатываемые надпочечниками вещества не только необходимы для обменно-метаболических процессов, но могут служить маркерами состояния железы и организма в целом. Показано, что дегидроэпиандростерон и его сульфат (DHTA, DHTA-S) активируют пероксисомный рецептор ос (PPAR а), относящийся к суперсемейству внутриклеточных стероидных рецепторов, что способствует стимуляции пролиферативных процессов в печени. В свою очередь, DHTA-S влияет на метаболизм жирных кислот в печени и экспрессию пероксисом, внося, таким образом, свой вклад в антиканцерогенное и детоксикационное действие эндогенных стероидов (Мико-ша А.С., 2001; Микоша А.С., Тролько Н.Д., 2004).
Участие андрогенов в популяционной и видовой адаптации не вызывает сомнений. Предполагается (Обут Т.А., 2004), что андрогены, как гоно-дальные, так и надпочечниковые (в том числе, экзогенно вводимые синтетические аналоги) снижают степень выраженности стресс-реакции, что названо автором «андроген-зависимой адаптационной реакцией». Это связывается с соответствующими изменениями реактивности центральных р-адрен-ергических механизмов.
Следует отметить, что гормоны сетчатой зоны коры надпочечников все чаще в последнее время называют нейростероидами, предполагая их участие в регуляции памяти, внимания, анксиолитическом эффекте и др (Чукаев С.А., Карачинцев А.Н., 1997). При этом нередко не учитывается анаболический эффект дегидроэпиандростерона и его растворимой (сульфа-тированной) формы, который эти гормоны оказывают на периферические ткани (Розен В.Б., 1984; Akwa Y. et al., 1991; Labrie F. et al., 2005).
Функциональные изменения, происходящие в надпочечниках при стрессовых ситуациях, определяются силой и продолжительностью воздействия (Данилова М.И., Стельникова И.Г., 1990; Панков В.Г., 1991; Кириллов О.И., 1994; Цибель Б.Н. и др., 1994; Гончаров Н.П., 1996; Axelrod J., Reisine T.D., 1984; Hiremagalur В. et al., 1994). На основании экспериментальных исследований выявлены основные типы реакции железы (Sayers С, 1950). 1. При кратковременном напряжении и стимуляции коры надпочечников их реакция быстро приходит к норме, при этом гиперплазия и гипертрофия не развиваются. 2. При постепенном увеличении напряжения развивается функциональная гипертрофия железы, в таком состоянии надпочечники успешно справляются с возрастающими потребностями организма. 3. При длительном и сильном воздействии стрессора изменения в железе прогрессируют с развитием более или менее выраженной гиперплазии, приводя организм к гибели. 4. Внезапно прекратившееся действие сильного раздражителя, вызвавшего сильное состояние напряжения, может вызвать очаговые или диффузные некрозы в коре надпочечников с кровоизлияниями и временным повышением содержания в клетках холестерина и липидов. 5. Сильное действие патогенного фактора, не приведшее к гибели организма, может привести к функциональной адаптации органа. С морфологической точки зрения, в зависимости от продолжительности и силы стресса выделяют три типа изменений в коре надпочечника (Symington Т. et al., 1958; Symington Т., 1961). 1. Фокальное липидное истощение, являющееся наиболее общим изменением в железе. При этом регистрируются очаговые исчезновения липидов и холестерина из клеток пучковой зоны, не резко выраженные дегенеративные изменения в области пучковой и сетчатой зон. В цитоплазме адрено-кортикоцитов уменьшается содержание РНК и ферментов или они совсем отсутствуют. 2. Диффузное липидное истощение встречается при резко выраженных состояниях стресса, при этом вся кора за исключением клубочковой зоны теряет липиды и холестерин, отмечаются выраженные и распространенные изменения с образованием ишемических очагов некроза, кровоизлияний, отслаивание клеточных колонн в виде рукавов, вплоть до полного разрушения железистой ткани. 3. Восстановление липидов в условиях несмертельного стресса, характерное для явления адаптации.
При остром стрессе увеличение содержания кортикоидов в крови происходит за счет их свободной фракции. Стимуляция стероидогенеза связана с понижением содержания жирных кислот, которые мобилизуются под влиянием АКТГ (Pignatelli D. et al., 1996; Bland M.K. et al., 2000). Различная трактовка динамики содержания липидов в адренокортицитах, как критерия функциональной активности коры надпочечников, связана с тем, что для оценки часто использовали один показатель, реже два, в этих случаях регистрировали уровень аскорбиновой кислоты, содержавшейся в цитоплазме кортикальных клеток. При хроническом воздействии наблюдается преимущественное увеличение количества гормонов, связанных с белком. Это имеет значение для уменьшения подавления секреции АКТГ (связанный корти-зол не участвует в механизме обратной связи) и обеспечения длительной гиперфункции коры надпочечников. Следует отметить, что усиленная функция железы приводит к заметному снижению содержания холестерина в клетках (Теппермен Д., Теппермен X., 1989).
Методы светооптического и электронно- микроскопического исследования
Из эксперимента животных выводили путем декапитации в первой половине дня.- Затем производили вскрытие грудной и брюшной полостей и макроскопическое обследование органов.
Надпочечники отделяли от жировой капсулы, взвешивали и проводили визуальную оценку их состояния. Кроме надпочечников, для гистологического исследования брали образцы сердца, легкого, печени, почек, селезенки. Правый надпочечник фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина. Левый надпочечник помещали в 4%-ный раствор параформаль-дегида. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином с постановкой реакции Перлса, Суданом черным В (Меркулов Г.А., 1961, Елисеев В.Г., 1967), ставили PAS-реакцию. Аскорбиновую кислоту выявляли с помощью кислого раствора азотнокислого серебра (Пирс Э., 1962). Светооптическое исследование и морфометрический анализ (измерение ширины коры надпочечника) проводили в универсальном микроскопе «Leica DM 4000В» (Германия). Микрофотографии получали с использованием цифровой фотокамеры «Leica DFC 320» (Германия) и компьютерной программы «Leica QWin V3».
Для электронно-микроскопического исследования образцы левого надпочечника размерами не более 1 мм , первоначально фиксированные в 4%-ном растворе параформальдегида, постфиксировали в 1%-ном растворе четырехокиси осмия в течение 2 ч. После стандартной обработки образцы ткани заливали в смесь эпона и аралдита. Полутонкие (1 мкм) и ультратонкие срезы получали на ультратомах Tesla и LKB-III. Полутонкие срезы окрашивали 1% раствором азура II и использовали для морфологического исследования, морфометрического и стереологического анализа. Ультратонкие срезы контрастировали в растворах уранилацетата и цитрата свинца, затем исследовали в электронном микроскопе JEM 1010 (фирмы «Jeol», Япония) при ускоряющем напряжении 40 кВ.
Морфометрический и стереологический анализ. Проведен тканевый стереологический анализ каждой зоны и морфометрическое измерение ширины коркового слоя надпочечников. Тканевый стереологический анализ проводили на полутонких срезах. Анализировали неперекрывающиеся поля зрения при увеличении в 1320 раз с использованием хорошо разработанных методик (Автандилов Г.Г. и др. 1981; Непомнящих Л.М. и др., 1984; Weibel E.R., 1969), основанных на подсчете числа точек тестовой системы, попавших на профиль исследуемой структуры (Р;), и числа пересечений тестовой линии с границами этой структуры (С;). Для подсчетов применяли многоцелевую тестовую систему — решетку, состоящую из коротких отрезков, в которой отрезок тестовой линии является стороной ромба (п = 36, Рт = 72, Lr = 282,0 мкм). Число наложений тестовой системы для каждой зоны надпочечника составляло 15 -25 для каждого животного.
В качестве основных количественных показателей, характеризующих структурные перестройки надпочечника, были выбраны объемная (Vv) и поверхностная (Sv) плотности адренокортикоцитов, их ядер, капилляров, клеток соединительной ткани без их дифференциации, основного вещества и волокон соединительной ткани. Объемную плотность стромы определяли путем сложения объемных плотностей капилляров, клеток, волокон и основного вещества соединительной ткани; объемную плотность паренхимы определяли путем сложения объемной плотности цитоплазмы и ядра адренокортикоцитов.
На основании первичных стереологических параметров рассчитывали вторичные, описывающие количественные взаимоотношения между различными компонентами стромы и паренхимы: поверхностно-объемное отношение структур (SVJ/VVJ), объемное отношение стромы к паренхиме (VvCTp/Vvnap), отношение объема капилляров к объему адренокортикоцитов (VvcH/Waap), поверхностно-объемное отношение капилляров к адренокор-тикоцитам (УУсн/УУадр) и ядерно-цитоплазматическое отношение (VvJ Vv ї
Ультраструктурный стереологический анализ адренокортикоцитов проводили на негативах при конечном увеличении в 36 000 раз (первоначальное увеличение 12000 раз). Оценивали объемную плотность митохондрий, липидных включений, цитоплазмы. Поверхностную плотность определяли для митохондрий, липидных включений. На основании первичных стереологических параметров рассчитывали вторичные - объемные и поверхностно-объемные отношения основных ультраструктур. Число наложений тестовой системы для каждой зоны надпочечника для каждого животного составляло 30 - 40.
Методика определения численности популяции адренокортикоцитов. Для учета колебаний численности популяции адренокортикоцитов использовали метод щелочной диссоциации фиксированных тканей (Бродский В.Я. и др., 1983; Непомнящих Л.М. и др., 2003). После взвешивания надпочечники мышей целиком погружали в 10% раствор нейтрального формалина не менее чем на 10 сут, надпочечник крыс разрезали на 4 части.
Оценку электропроводности ткани надпочечника осуществляли с помощью стандартных электроимпедансометра «Тонус-2» и датчиковых устройств на низкой (10 кГц) и высокой (1 МГц) частотах. Величина тестирующего тока не влияла на физиологические свойства тканей и составляла 10 мкА (Осенний А.С. и др., 1993). По результатам измерений рассчитывали коэффициент поляризации (Кп), равный отношению импедансов на низкой и высокой частотах. Активный электрод имел диаметр 60 мкм. Индиффе-рентный электрод представлял собой диск площадью 100 мм" и толщиной 12 мм (Торнуев Ю.В. и др., 1990; Хачатрян А.П. и др., 1991). Осуществляли три последовательных измерения электропроводности с их последующим усреднением (Бородин Ю.А. и др., 1993).
Тканевая реорганизация коры надпочечников крыс при различных режимах гипоксического воздействия
Тканевые изменения надпочечников крыс, подвергавшихся гипокси-ческим воздействиям, в том числе и с предварительным введением нероболила, сравнивали с одновозрастным контролем. Общий план строения надпочечников интактных крыс Вистар соответствовал таковому для всех млекопитающих (рис. 1). Под плотной соединительнотканной капсулой хорошо различались основные зоны коры надпочечников - клубочковая, пучковая и сетчатая. В центре железы располагалось мозговое вещество.
Адренокортикоциты клубочковой зоны имели, как правило, округлую форму и образовывали характерные скопления аркадного типа. В базофиль-ной цитоплазме различались везикулярные скопления, которые окрашивались Суданом черным В. Ядра кортикоцитов клубочковой зоны были, в основном, гиперхромными. Между клубочковой и пучковой зонами располагался суданофобный слой, состоявший из 2 - 3 рядов мелких адренокорти-коцитов. Пучковая зона была сформирована крупными адренокортикоцита-ми, которые центрипетально (по направлению к мозговому веществу), вдоль капилляров, образовывали продольные тяжи, формируя две субзоны: наружную и внутреннюю. Ширина наружной субзоны была примерно в два раза меньше, чем внутренней, а формирующие ее адренокортикоциты - более крупными, имели полигональную форму. Цитоплазма кортикоцитов пучковой зоны содержала большое количество липидных включений, значительно варьировавших по размеру. В цитоплазме адренокортикоцитов наружной части пучковой зоны преобладали суданофильные липидные включения, тогда как во внутренней субзоне вакуолеобразные скопления не окрашивались Суданом черным В.
Сетчатая зона была сформирована мелкими адренокортикоцитами, которые образовывали анастомозирующие тяжи. Цитоплазма клеток сетчатой зоны была более эозинофильной по сравнению с клетками пучковой зоны и содержала небольшое количество суданофильных и суданофобных липидных включений. В адренокортикоцитах всех зон коры выявлялась аскорбиновая кислота. Капилляры пучковой и сетчатой зон были умеренно полнокровны.
После однократного гипоксического воздействия общий план строения коры надпочечника был изменен в результате выраженного полнокровия капилляров пучковой и особенно сетчатой зон, что придавало им ячеистый вид. Адренокортикоциты клубочковой зоны были слабоэозинофиль-ными и имели типичное строение. Клетки камбиального слоя не содержали липидных включений и образовывали небольшие тяжи, которые чаще всего вдавались как в пучковую, так и клубочковую зоны (рис. 2, 3).
В пучковой зоне отчетливо различались наружная и внутренняя субзоны. Адренокортикоциты наружной субзоны содержали небольшое количество мелких липидных включений, окрашенных Суданом черным В (рис. 4). Во внутренней субзоне основная популяция адренокортикоцитов была представлена «светлыми» клетками, «темные» клетки были единичными. В ряде случаев происходило «жировое» перерождение клеток - формирование слоистых липидных масс, занимавших практически весь объем клеток .
Гетерогенность адренокортикоцитов сетчатой зоны была более выраженной, чем в пучковой зоне. В клетках практически не регистрировались липидные включения; размеры клеток значительно варьировали, возрастало количество мелких клеток, особенно вблизи мозгового вещества. Аскорби 58 новая кислота в адренокортикоцитах пучковой и сетчатой зон не выявлялась, что отражало усиление синтеза стероидных гормонов (Артишевский А.А., 1977). В сетчатой зоне капилляры были значительно расширены, заполнены, в основном, плазмой. В строме часто встречались многочисленные макрофаги, цитоплазма которых была заполнена большим количеством ос-миофильных липидных включений. Появление таких форм макрофагов свидетельствовало об усилении гибели и резорбции адренокортикоцитов в сетчатой зоне.
После многократных гипоксических воздействий архитектоника клу-бочковой зоны существенно не изменялась, часть липидных включений положительно окрашивалась Суданом черным В. Наблюдалось значительное расширение камбиального слоя, вызванное пролиферацией камбиальных клеток (рис. 6). В пучковой зоне различались две субзоны, которые дифференцировались по характеру липидных включений. В наружной субзоне ад-ренокортикоциты содержали суданофильные включения, число которых значительно уменьшалось по сравнению с интактными животными. В адренокортикоцитах внутренней субзоны липидные включения встречались крайне редко, но регистрировались оптически «пустые» везикулярные структуры. «Темные» клетки практически отсутствовали, аскорбиновая кислота не выявлялась. Следует отметить, что в пучковой зоне у животных этой группы встречались очаги некроза адренокортикоцитов. В адренокортикоцитах сетчатой зоны содержались единичные суданофильные включения, которые иногда сливались в огромные вакуоли. Капилляры пучковой и сетчатой зон были полнокровными, а в сетчатой зоне - заметно расширенными; некоторые были обтурированы липидными массами.
Введение нероболила не изменяло существенно общий план строения коры надпочечников. Отмечалось увеличение камбиального слоя, клетки которого иногда образовывали небольшие выросты в направлении пучковой зоны (рис. 7). В пучковой зоне хорошо различались две субзоны: адренокор-тикоциты наружной субзоны содержали большое количество преимущественно суданофильных, а внутренней - суданофобных липидных включений (рис. 8). Здесь же отмечено появление двуядерных адренокортикоцитов (рис. 9). Во внутренней субзоне регистрировались отдельные «темные»
Тканевая реорганизация надпочечников мышей СВА при общем перегревании организма
В общем строении коры надпочечников мышей в сравнении с таковым у крыс можно выделить две особенности: отсутствие четко выраженного камбиального слоя и наличие так называемой Х-зоны (на границе сетчатой зоны и мозгового вещества), которая у взрослых животных рудиментарна. При этом в клубочковой зоне адренокортикоциты формировали розеткооб-разные, а не аркадные, как у крыс, структуры.
Через 30 мин после теплового воздействия архитектоника клубочковой и пучковой зон коры надпочечников не претерпевала существенных изменений. Структурная реорганизация затрагивала преимущественно область на границе сетчатой зоны и мозгового вещества, где отмечались разрыхление и утолщение соединительнотканных тяжей, особенно в Х-зоне (рис. 45), умеренная элиминация адренокортикоцитов с образованием оптически пустых пространств (рис. 46), умеренное расширение и полнокровие капилляров.
Через 3 сут после перегревания наблюдалось разрыхление соединительнотканной капсулы надпочечников. Адренокортикоциты клубочковой зоны, содержащие значительное количество мелких липидных капель, формировали различные по форме и размерам клубочки. Межклубочковые соединительнотканные прослойки были утолщены и разрыхлены. Базофиль-ная цитоплазма адренокортикоцитов наружной пучковой субзоны содержала незначительное количество прозрачных везикулярных включений.
На 7-е сутки после теплового воздействия в надпочечниках наблюдалось более выраженное утолщение и разрыхление соединительнотканной капсулы органа. Непосредственно под капсулой формировались островки незрелых адренокортикальных клеток. Отмечалось обилие мелких гетерогенных липидных включений в адренокортикоцитах пучковой зоны (рис. 49). Усиливалась структурно-функциональная гетерогенность адренокорти-коцитов во всех зонах, особенно в сетчатой зоне. В адренокортикоцитах сетчатой зоны липидные включения практически не регистрировались. В сетчатой зоне на границе с мозговым веществом наблюдалась почти полная элиминация адренокортикоцитов, ширина сетчатой зоны была уменьшена (рис. 50). Отмечалось выраженное полнокровие капилляров и синусоидов во всех зонах коры надпочечников и в мозговом веществе. Наблюдались случаи диффузной моноцитарной инфильтрации стромы всех зон коры.
К 14-м суткам посттепловой реституции соединительнотканная капсула оставалась умеренно утолщенной и разрыхленной. Увеличивалось содержание гетерогенных липидных мелкокапельных включений в пучковой зоне (рис. 51). Наиболее существенные изменения происходили в сетчатой зоне: ширина ее оставалась уменьшенной, сохранялась элиминация адренокортикоцитов, хотя не столь выраженная, как в более ранние сроки после перегревания (рис. 52). Соединительнотканные прослойки оставались утолщенными, в них появлялись пучки коллагеновых волокон. Нарушения гемодинамики в виде полнокровия капилляров сохранялись.
Важное значение для оценки выраженности регенераторных реакций адренокортикоцитов при экстремальных воздействиях имеет оценка общей численности клеток в коре надпочечника. Количественный анализ популя
Затем происходило постепенное увеличение концентрации адренокортикоцитов в 1 мг ткани (соответственно на 135 и 190% через 7 и 14 сут). Это событие обусловило восстановление абсолютной численности адренокортикоцитов в коре надпочечников, и к 14-м суткам этот показатель не отличался от контрольных значений. Однако при этом сохранялись атрофические изменения клубочковой и пучковой зон, но отмечалось увеличение сетчатой зоны.
Полученные данные свидетельствуют о значительном пролонгированном действии экстремальных факторов на адренокортикоциты, что особенно ярко проявляется в гибели и элиминации более 30% клеток в коре надпочечников после однократного стрессирующего воздействия. В то же время следует отметить сохранение регенераторного потенциала адренокортикоцитов в данных условиях, что проявляется в восстановлении общей численности клеток через 14 сут после общего перегревания.
По данным стереологического анализа, общее перегревание организма мышей линии СВА вызывало выраженную структурную реорганизацию коры надпочечников. При этом направленность изменений структурной плотности основных тканевых компартментов в разных зонах была различной.
В клубочковой зоне коры надпочечников объемная плотность адренокортикоцитов снижалась в течение начального периода посттепловой реституции - к 3 сут на 18,6% (р 0,05), но уже к 7 сут происходило восстановление показателя до контрольных значений (табл. 16). Поверхностная плотность падала на протяжении всего периода посттепловой реституции, максимально снижаясь к 14 сут эксперимента (на 53%, р 0,01), в результате к 14 сут наблюдалось уменьшение поверхностно-объемного отношения адренокортикоцитов (на 56,1%, р 0,05) (табл. 17), что свидетельствовало о гипертрофии клеток. Гипертрофические изменения адренокортикоцитов клубочковой зоны были обусловлены, вероятно, уменьшением их численности, что вызвало уменьшение ширины этого компартмента.
На протяжении всего эксперимента отмечено стойкое снижение объемной и поверхностной плотностей ядер адренокортикоцитов клубочковой зоны, которые достигали минимальных значений уже к 7 (снижение на 25,5 и 10,3%, р 0,05) и сохранялись вплоть до 14 сут (снижение на 27,1 и 28,8%, р 0,05). Однонаправленное, но не пропорциональное изменение объемной и поверхностной плотностей ядер адренокортикоцитов привело к увеличению их поверхностно-объемного отношения к 7 сут (на 20%, р 0,05). Такие изменения свидетельствовали об уменьшении размеров ядер адренокортикоцитов клубочковой зоны в данные сроки посттепловой реституции. Ядерно-цитоплазматическое отношение адренокортикоцитов клубочковой зоны снижалось к 7 и 14 сут после перегревания (на 21,6 и 36,4%, р 0,05).
