Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 9
2.1. Печень и ее роль в организме млекопитающих 9
2.2. Глюкостатнческая функция печени и особенности ее регуляции...13
2.3. Гетерогенность гепатоцитов и ее роль в углеводном метаболизме печени 42
2.4. Структурно-функциональные изменения печени при циррозе 57
2.5. Хроническое повреждающее действие четыреххлористого углерода, как модель экспериментального цирроза печени 61
2.6. Метаболизм глюкозы и гликогена при циррозе печени 64
3. Материалы и методы 72
3.1. Объекты исследования 72
3.2 Методы приготовления препаратов 75
3.3 Методы количественной цитохимии 77
3.4. Метод определения сухого веса гепатоцитов 82
3.5 Гистологические исследования 82
3.6 Морфометрия митохондриального аппарата гепатоцитов крыс 83
3.7 Биохимические методы 84
3.8 Методы статистической обработки 89
4. Результаты 90
4.1 Морфо-функциональнос исследование печени и гепатоцитов крыс контрольной и опытной группы 90
4.1.1 Морфометрия паренхимы, уровни плоидности и сухая масса гепатоцитов 90
4.1.2. Морфометрия митохондриального аппарата гепатоцитов нормальной и циррозной печени крыс 93
4.1.3. Активность систем микросомалыюго и перекисного окисления нормальной и цирротически измененной печени крыс 95
4.2. Биохимические показатели крови крыс контрольной и опытной группы 95
4.2.1. Уровни глюкозы, активности ЛлАТ, АсАТ, общего белка и некоторых продуктов катаболизма в крови крыс контрольной и опытной группы 95
4.2.2. Концентрация глюкозы в крови крыс контрольной и опытной групп на разных этапах после введения глюкозы или фруктозы голодным животным 97
4.2.3. Активность про- и антиоксидантных систем в крови крыс контрольной и опытной группы 98
4.3. Концентрация гликогена и активность ферментов углеводного обмена в нормальной и цирротически измененной печени крыс на разных этапах после введения глюкозы или фруктозы голодным животным 98
4.3.1. Концентрация гликогена 98
4.3.2. Активность гликогенфосфорилазы и гликогеисинтазы 100
4.3.3. Активность глюкозо-6-фосфатазы и глюкокиназы 102
4.3.4. Активность фруктозо-1,6-дифосфатазы и фосфофруктокиназы 105
4.4 Исследование содержания гликогена в гепатоцитах, изолированных из нормальной и цирротической печени, через разные интервалы времени после введения голодным крысам
глюкозы или фруктозы 107
4.4.1. Цитофлуориметрия содержания гликогена в изолированных гепатоцитах крыс контрольной и опытной группы 107
4.4.2. Анализ распределения гепатоцитов по содержанию гликогена в нормальной и цирротически измененной печени на разных этапах рефидинга крыс глюкозой или фруктозой 109
4.5. Динамика накопления гликогена в гепатоцитах портальной и центральной зон дольки нормальной и цирротически измененной печени после введения глюкозы или фруктозы голодным крысам 120
4.6. Цитофотометричсскос определение содержания гликогена и активности глюкозо-6-фосфатазы в гепатоцитах портальной и центральной зонах дольки печени крыс контрольной и опытной группы 125
4.7. Некоторые показатели углеводного метаболизма в печени, мышцах и надпочечниках крыс контрольной и опытной группы в постабсорбтивном периоде 126
4.8. Сравнительная морфометрическая оценка печени больных хроническим гепатитом и циррозом печени 128
4.9. Биохимические показатели крови больных хроническим гепатитом и циррозом печени 129
4.9.1. Активность АлАТ, АсАТ, концентрация глюкозы, общего белка и некоторых продуктов катаболизма в крови больных хроническим гепатитом и циррозом печени 129
4.9.2. Активность про- и антиоксидантных систем в крови больных хроническим гепатитом и циррозом печени 129
4.10. Цитофлуориметрическое определение содержание гликогена в гепатоцитах больных хроническим гепатитом и циррозом печени ..132
4.11. Количественный анализ содержания гликогена в гепатоцитах разных зон дольки нормальной и цирротически измененной печени человека 134
4.12. Активность гликогенсинтазы, гликогенфосфорилазы и глюкозо-6-фосфатазы в печени больных хроническим гепатитом и циррозом печени 135
5. Обсуждение 138
6. Выводы 199
7. Список литературы 201
- Хроническое повреждающее действие четыреххлористого углерода, как модель экспериментального цирроза печени
- Морфометрия митохондриального аппарата гепатоцитов нормальной и циррозной печени крыс
- Анализ распределения гепатоцитов по содержанию гликогена в нормальной и цирротически измененной печени на разных этапах рефидинга крыс глюкозой или фруктозой
- Цитофлуориметрическое определение содержание гликогена в гепатоцитах больных хроническим гепатитом и циррозом печени
Введение к работе
Живые организмы - системы открытого типа, требующие постоянного притока энергии в виде питательных веществ. Углеводы, на долю которых приходится около 75% от пищи, поступающей в течение суток и более 50% от суточного количества калорий, требуемых для выполнения многочисленных функций в организме, представляют основной компонент пищи человека. При этом глюкоза и фруктоза являются наиболее распространенными углеводами, входящими в состав пищи как в свободном виде, так и в виде олигосахаридов, полисахаридов, гликозидов и других производных.
Печень млекопитающих играет ключевую роль в метаболизме глюкозы и фруктозы. Глюкоза является важнейшим источником энергии для многих тканей, а для некоторых из них (мозг, семенники, клетки крови и др.) она является единственным источником получения энергии. Способность печени синтезировать гликоген из глюкозы, поступающей с пищей, и расщеплять его после завершения пищеварения, а также синтезировать глюкозу из веществ неуглеводной природы позволяет поддерживать концентрацию глюкозы в крови в достаточно узких границах. Фруктоза в печени превращается в глюкозу, которая затем используется другими тканями, или метаболизируется в различные промежуточные продукты. Поступление фруктозы в клетки печени и регуляция се метаболизма значительно отличаются от таковых для глюкозы. Исходя из биологической важности глюкозы и фруктозы, можно ожидать, что любые поражения печени приведут к серьезным нарушениям метаболизма этих моносахаров.
Хронические гепатиты различной этиологии - наиболее распространенные заболевания печени человека. Постепенно развиваясь, хронический гепатит переходит в свою завершающую и наиболее опасную для жизни стадию - цирроз печени. Цирроз приводит к значительной
перестройке архитектоники органа, которая выражается, прежде всего, в потере дольковой структуры паренхимы, замещении части паренхимы соединительной тканью, перестройке сосудистого русла и ряде других нарушений. В результате этих изменений клетки печени вынуждены выполнять свои функции в условиях гипоксии и недостаточного снабжения различными субстратами (Подымова, 1999; Шерлок, Дули, 2002). Показано, что метаболизм глюкозы и гликогена при циррозе претерпевает значительные изменения. В целом, для больных циррозом характерен метаболизм, который наблюдается у здоровых людей при длительном голодании. Отличительными чертами такого метаболизма являются: образование энергии преимущественно за счет окисления липидов, а не углеводов, как у здоровых людей; продукция глюкозы после ночного голодания происходит, главным образом, за счет глюконеогенеза, а не гликогенолиза, как в нормальной печени; увеличенный кетогенез и т.д. (Schneeweiss et al., 1990; Greco et al., 1998; Kruszynska, Mclntyre, 1991; Kruszynska, 1999). Показано также, что углеводный обмен при циррозе приобретает ряд черт свойственных диабету, основным признаком которого является интолерантность ряда органов к глюкозе и инсулину (Shmucli et al., 1993; Petrides, 1994; Mion et al., 1996). Полагают, что одной из причин интолерантности больных циррозом к глюкозе может быть снижение способности печени синтезировать гликоген (Riggio et al., 1997; Kruszynska, 1999).
В отличие от глюкозы, абсорбция фруктозы печенью не зависит от инсулина. Поэтому считается, что инфузия фруктозы больным циррозом печени и диабетом, позволяет избежать ряда нежелательных эффектов, которые наблюдаются при использовании глюкозы (Daly et al., 1997; Dirlewanger et al., 2000; Elliot et al., 2002). Полагают также, что введение фруктозы по сравнению с глюкозой вызывает более быстрое и интенсивное накопление гликогена в печени. Однако имеющиеся на этот
счет данные противоречивы (Nilsson, Hultman, 1974; Niewoehner et al., 1984).
Углеводный метаболизм в печени осуществляется с помощью многих ферментов, активность которых регулируется различными гормональными, нервными, субстратными и другими механизмами (Matsuhisa et al., 2000; Roach, 2002; Алейникова, Воробьева, 2005). Помимо них, важную роль в регуляции углеводного обмена в печени играют различные тканевые и клеточные факторы. Показано, что активность ферментов углеводного обмена, содержание гликогена и направление основных субстратных потоков в гепатоцитах в значительной мере зависят от локализации клеток в дольке печени, степени их плоидности, а также фазы клеточного цикла, в которой они находятся (Кудрявцев и др., 1980; Майтесян, 1983; Jungermann, 1997). В отличие от нормальной печени, метаболизм гликогена и особенности его регуляции в цирротически измененной печени изучены крайне недостаточно, а имеющиеся данные довольно противоречивы. Противоречивость данных об углеводном обмене в цирротической печени связана главным образом с тем, что они получены на материале с разной степенью выраженности патологических изменений в органе и на разных стадиях пищеварительного цикла животных и человека.
Цель настоящей работы состояла в сравнительном исследовании метаболизма гликогена в нормальной и цирротической печени крыс на различных стадиях после перорального введения глюкозы или фруктозы голодным животным. Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:
Провести морфометрический анализ паренхимы нормальной и цирротической печени крыс.
Определить уровни плоидности и сухую массу гепатоцитов в норме и при циррозе печени.
Провести морфометрический анализ митохондрий в гепатоцитах нормальной и цирротической печени крыс.
Исследовать активность ключевых ферментов углеводного обмена и уровни гликогена в нормальной и цирротичсски измененной печени крыс при голодании и затем через разные инервалы времени после введения животным глюкозы или фруктозы.
Исследовать скорость накопления гликогена в гепатоцитах портальной и центральной зон дольки нормальной и цирротической печени крыс после введения голодным животным глюкозы или фруктозы.
Исследовать зависимость активности гликогенсинтазы и гликогенфосфорилазы от содержания гликогена в гепатоцитах нормальной и цирротической печени крыс.
Определить содержание гликогена и активность ключевых ферментов его метаболизма в печени больных хроническим гепатитом различной этиологии на стадии до цирроза печени и при циррозе печени.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Хроническое повреждающее действие четыреххлористого углерода, как модель экспериментального цирроза печени
Накопление в клетках большого количества свободной глюкозы невозможно из-за того, что ее высокие концентрации во внутриклеточной жидкости создают высоко гипертоническую среду, приводя к сильному обводнению клеток (Трифонов, 1997). Поэтому глюкоза, поступающая с пищей, превращается в клетках в свою резервную пригодную для хранения полимерную форму - гликоген. Поскольку гликоген осмотически почти неактивен, его высокие концентрации в клетках не вызывают нарушения водного баланса в органах.
Гликоген присутствует во многих тканях, но в наибольшем количестве он содержится в печени (2-8%) и скелетных мышцах (0.5-1.5%) (Розенфельд, Попона, 1989; Комов, Шведова, 2004). Несмотря на значительно меньшую концентрацию гликогена в мышцах, в них содержится около 2/3 от всего гликогена в организме (Розенфельд, Попова, 1989; Марри и др., 1993; Березов, Коровкин, 2004), что связано с большой массой мышечной ткани у млекопитающих. В отличие от гликогена мышц, который расходуется на производство энергии, необходимой для сокращений, гликоген печени используется, главным образом, для поддержания постоянной концентрации глюкозы в крови, которая требуется другим тканям.
Гликоген является гликопротеидом, состоящим из эквимолярных количеств белка и глюкозных остатков. Молекулярный вес гликогена достигает 89 х 106-161 х 106 (Devos et al., 1983; Rybicka, 1996; Roach, 2002). Молекула гликогена имеет сферическую форму и состоит из ветвящихся цепей, образованных D-глюкопиранозой. Линейные отрезки цепи состоят из 11-18 остатков D-глюкопиранозы, соединенных а-(1-»4)-гликозидными связями. Каждая цепь, в среднем с 13 глюкозными остатками, имеет две точки ветвления, в которых глюкозные остатки соединены а-(1— 6)-гликозидиыми связями (рис. 2). В молекуле гликогена различают наружные цепи из 6-9 глюкозных остатков (цепи А), которые присоединяются к внутренним цепям, состоящим из 3-4 глюкозных остатков (цепи В), или к единственной в молекуле цени С, имеющей свободную альдегидную группу (Geddes, 1985; Melendezetal., 1999).
Относительная молекулярная масса гликогена значительно варьирует у разных видов животных, в разных органах и при различных физиологических состояниях организма. В клетках гликоген находится в виде р-частиц, молекулярная масса которых составляет 10 Да, а диаметр - около 40 им, и частиц с диаметром до 200 нм, представляющих собой ковалентно связанные комплексы из 20-40 Р-частиц (Devos et al., 1983; Manners, 1991; Rybicka, 1996).
Установлено, что частицы гликогена содержат ферменты, катализирующие его синтез и распад, а также ряд ферментов, регулирующих эти процессы (Geddes, 1986). За исключением белка-затравки - гликогенина, все эти белки в р-частицах содержатся не в очень строгой пропорции (Roach, 2002). По имеющимся данным гликогенфосфорилаза связана преимущественно с гликогеном более низкой молекулярной массы, а гликогенсинтаза - с гликогеном, обладающим более высокой молекулярной массой (Geddes, 1986; Geddes, 1994). Киназа фосфорилазы Б, фосфатаза гликогепсинтазы и а-амилаза также в той или иной степени связаны в клетках с гликогеном. Показано, что частицы гликогена содержат 50-70% гликогенфосфорилазы, 70-90% гликогепсинтазы и 20-50% киназы фосфорилазы от общего количества этих ферментов в клетке. Протеинкиназы и протеинфосфатазы также связаны с частицами гликогена, но большая часть этих ферментов находится в цитозоле в свободном состоянии (Розснфельд, Попова, 1989).
Регуляция активности ферментов, участвующих в превращениях гликогена, напрямую зависит от характера их связи с субстратом. Поэтому при изучении регуляции активности этих ферментов приходится учитывать тот факт, что структура и свойства макромолекул гликогена играют далеко не пассивную роль в его превращениях. Показано, что молекулярная масса, число точек ветвления, длина наружных и внутренних цепей молекул гликогена являются важными факторами при его взаимодействии с гликогенсинтазой, гликогенфосфорилазой и другими ферментами (Geddes, 1985; Geddes, 1986).
В 1975 году было показано, что синтез молекул гликогена осуществляется на особом белке-затравке (Krisman, Barengo, 1975). Позднее из мышц кролика был выделен белок, ковалентно связанный с гликогеном, названный гликогенином, молекулярная масса которого составила около 60 кДа (Kennedy et al., 1985; Whelan, 1986). Последующие исследования показали, что гликогенин представляет собой самогликозилирующийся белок-затравку, осуществляющий полимеризацию глюкозы с помощью гликогснсинтазы и ветвящего фермента в присутствии ионов Mn2+ (Alonso et al., 1995; Lin et al., 1999; Henrissat, Davies, 2000). Полагают, что в одной молекуле гликогена (р-частица) содержится одна молекула гликогенина. Установлено также, что связь гликогенина с полисахаридной частью гликогена осуществляется с помощью тирозина в 194 положении (Smythe, Cohen, 1991; Alonso et al., 1995). Оказалось, что, помимо гликогена, гликогенин способен гликозилировать некоторые другие молекулы, а также осуществлять гидролиз УДФ-глюкозы (Alonso et al., 1995). Дальнейшие исследования позволили установить, что приматы имеют два типа гликогенина, каждому из которых соответствует свой ген. Гликогеиин-1 распространен наиболее широко и у человека он преобладает в мышцах. Вторая изоформа этого белка, гликогенин-2, присутствует в печени, сердце, в меньшей степени - в поджелудочной железе человека (Ми, 1997; Campbell et al., 1997; Henrissat, Davies, 2000). Все попытки идентифицировать гликогенин-2 в различных тканях крыс и мышей не увенчались успехом. Исходя из этого, был сделан вывод о том, что ген гликогснииа-2 (GYG2) присутствует только у приматов (Ми, 1997; Ми, Roach, 1998; Zhai et al., 2001).
Синтез и деградация гликогена отличаются необычайной сложностью. В этих процессах участвуют различные по механизму действия ферменты, активность которых регулируется с помощью фосфорилирования и дефосфорилирования, различных гормонов и аллостернческих эффекторов (рис. 4).
Морфометрия митохондриального аппарата гепатоцитов нормальной и циррозной печени крыс
Считается, что протеинфосфатаза 1 (PP1) вместе с PIG (glycogenargetin protein) вызывают не только дефосфоридирование гликогенфосфорилазы и киназы фосфорилазы, но также как и в случае гликогенсинтазы стимулируют перемещение гликогенфосфорилазы из растворимой фракции в «частичковую» (Green et al., 2004).
Недавние исследования первичной кристаллической структуры гликогенсинтазы в присутствии или отсутствии АТФ, позволили установить, что "фолдинг фермента" и строение его активного сайта имеют значительную гомологию с гликогенфосфорилазой. Эти данные указывают на общий каталитический механизм и сравнимые субстрат-связывающие свойства этих ферментов (Buschiazzo et al., 2004).
Гликогенфосфорилаза расщепляет только 1,4-гликозидные связи. Последовательное отщепление глюкозиых остатков прекращается, когда до точки ветвления остается 4 мономера. Такая особенность действия фермента обусловлена размером и строением его активного центра. Расщепление 1,6-гликозидных связей происходит с помощью деветвящего фермента (Taylor et al., 1975). Этот фермент обладает двумя различными каталитическими активностями — трансферазной и гликозидазной, связаными с разными доменами одной и той же полипептидной цепи (Bates et al., 1975). Действие деветвящего фермента осуществляется следующим образом: вначале, три оставшихся до точки ветвления глюкозиых остатка переносятся при участии олигосахаридтрансферазы на нередуцирующий конец соседней цепи (Liu et al., 1993; Campbell et al., 1997; Henrissat, Davies, 2000). Затем, оставшийся в точке ветвления глюкозный остаток, гидролитически отщепляется с помощью а-!,6-глюкозидазы с образованием свободной глюкозы (Bates et al., 1975; White, Nelson, 1975).
Многие авторы предполагают, что наряду с гормональными, нервными, субстратными, аллостеричсскими и другими факторами, существенное влияние на активность гликогенсинтазы и гликогенфосфорилазы оказывает концентрация гликогена в печени (De Wulf el al., 1970; Stalmans el al., 1971; Nutlall et al., 1983; Nultall, Gannon, 1989; Chen et al., 1992; Chen et al., 1993; Laurent et al., 2000; Shearer et al., 2001). Однако данные, которые подтвердили бы существование подобной зависимости, в настоящее время отсутствуют. Показано лишь, что в условиях in vitro активность гликогенсинтазы снижается, если концентрация гликогена в среде превышает 275-325 мкмоль/г сырого веса печени (Chen et al., 1993).
Печень играет центральную роль в абсорбции глюкозы, поступающей с пищей. Поскольку в норме уровень глюкозы в крови всегда гораздо ниже, чем глюкозы, поступающей в организм с пищей, полагали, что печень абсорбирует значительный объем глюкозы уже в течение первого цикла портальной циркуляции (Scow, Cornfield, 1954). Однако исследования с использованием радиоактивно меченой глюкозой показали, что при первом прохождении глюкозы через печень абсорбируется менее 15% ее количества, поступившего с пищей (Radziuk et al., 1978; Ferrannini et al., 1985; Kruszynska et al., 1993). Тем не менее, суммарное количество глюкозы, абсорбирующееся печенью, достаточно велико. Используя метод катетеризации печеночной вены было показано, что абсорбция глюкозы печенью составляет от 25 до 60% от ее введенного количества и эта доля может возрастать при увеличении «глюкозной нагрузки» (Felig et al., 1975; Katz et ah, 1983; Kelly et al., 1988; Mitrakou et al., 1990). Остальная часть глюкозы утилизируется периферическими тканями. Глюкоза, поступившая в печень, либо окисляется в ходе гликолиза, либо используется для синтеза триглицеридов и гликогена. Последний может синтезироваться двумя путями - прямым (глюкоза — гликоген) или опосредованным (глюкоза — лактат — гликоген), причем последний более выражен (Jungermann, Katz, 1989; Petersen et al, 1999).
В промежутках между приемами пищи гликоген печени используется главным образом для поддержания постоянной физиологической концентрации глюкозы в крови. В это время основное потребление глюкозы приходится на долю мозга и эритроцитов. Одни авторы считают, что у человека в постабсорбционном периоде около 70-75% глюкозы образуется в ходе гликогенолиза, а остальные 25-30% - за счет глюконеогенеза (Kruszynska, Mclntyrc, 1991; Kruszynska, 1999). Однако другие авторы полагают, что вклад глюконеогенеза в образование глюкозы выше, чем гликогенолиза, и достигает 40-70% (Magnusson et al., 1992; Тарру, 1995; Diraisonetal., 1998).
В течение длительного голодания запасы гликогена в печени истощаются и составляют всего несколько процентов от первоначального уровня (Calder, Geddes, 1986; Rothman et al., 1991; Kruszynska, 1999). В этих условиях снабжение различных тканей глюкозой осуществляется почти целиком за счет глюконеогенеза, который протекает в печени и частично в почках, коре надпочечников и тонком кишечнике (Rajas et al., 1999; Rajas et al., 2000; Croset ct al., 2001; Mithieux et al., 2004; Watford, 2005). Источниками глюкозы, синтезируемой de novo печенью в ходе глюконеогенеза, являются лактат, пируват, глицерол и некоторые аминокислоты. Лактат, образующийся путем гликолиза в различных тканях (в покое главным образом в эритроцитах, а при физической нагрузке в скелетных мышцах), является основным звеном цикла Кори (глюкоза — лактат — глюкоза). Аминокислоты, такие как аланин, глутамин и глицин, используемые в глюконсогенезе, освобождаются в ходе катаболизма белков в мышцах. Глицерол образуется в жировой ткани при гидролизе триглицеридов. В ходе длительного голодания, наряду с переходом печени на глюконеогенез, в организме происходят важные адаптивные изменения, направленные на снижение потребления глюкозы тканями (Kruszynska, Mclntyre, 1991). В результате, даже в том случае, когда пища не поступает, уровень глюкозы в крови падает незначительно.
Помимо глюкозы, печень осуществляет метаболизм ряда других моносахаров, в частности фруктозы (рис. 12). Обычно фруктоза поступает в организм в виде сахарозы, дисахарида содержащего эквимолярное количество глюкозы и фруктозы, обеспечивая при этом 7-15% энергетических потребностей организма (Basciano et al., 2005).
Анализ распределения гепатоцитов по содержанию гликогена в нормальной и цирротически измененной печени на разных этапах рефидинга крыс глюкозой или фруктозой
Различный уровень энергетического метаболизма в портальной и центральной зоне дольки печени приводит к тому, что в первой зоне преимущественно протекают процессы, связанные с высокими затратами энергии, а во второй - менее энергозатратные процессы. Соответственно гепатоциты, расположенные вокруг портальных и центральных сосудов, имеют разное соотношение одних и тех же ферментов и обладают различным метаболизмом. В перипортальных гепатоцитах наиболее интенсивно протекает р-окисление жирных кислот, цикл Крсбса, синтез мочевины, формирование желчи и т.д. В то время как в перивенозных гепатоцитах наблюдается высокая интенсивность липогеиеза, образования глютамина и кетоновых тел и метаболизма ксенобиотиков (Thurman et al., 1988; Jungcrmann, 1992; Ikezawa et al., 1998).
Градиент концентраций кислорода, субстратов и гормонов, наблюдающийся между различными зонами дольки печени, существенно отражается на обмене глюкозы и гликогена в гепатоцитах, локализованных в этих зонах. 1 Іеривенозньїс гепатоциты обладают более высокой способностью расщеплять глюкозу до пирувата. Они обладают более высокой активностью и содержат более высокие молярные количества глюкокиназы (Moorman et aL, 1991; Kirchner et al., 1993; Toyoda et al., 1995) и пируваткиназы (Miethke et al., 1985). Известно, что в ходе гликолиза часть абсорбировнной глюкозы превращается в жирные кислоты. Таким образом, гликолиз оказывается функционально связанным с липогенезом, активность которого также выше в перивенозных клетках. Перипортальные клетки обладают более высокой способностью к синтезу глюкозы из С3-соединений. Они обладают более высокой активностью Г-6-Фазы (Sokal et al., 1989; Teutsch et al., 1999) и фруктозо-1,6-дифосфатазы (Katz et al., 1977; Schmidt et al., 1978), а также имеют более высокую активность и молярное количество фосфоенолпируват карбоксикиназы (Wimmer et al, 1990). Показано также, что лактатдегидрогеназа и аланипаминотраисфераза, обеспечивающие глюконеогенсз субстратами, проявляют более высокую активность в перипортальной зоне (Wimmer, Pette, 1979).
Согласно модели «метаболической зонации», предложенной Юигерманном (Jungermann, 1987), гликоген в перипортальных геиатоцитах синтезируется в основном из триуглеродных субстратов, а не из глюкозы. Гепатоциты перивснозной зоны после абсорбции глюкозы, поступившей с пищей, включают часть ее через прямой путь в гликоген. Однако основная часть глюкозы расщепляется гепатоцитами до лактата, поступающего затем в циркулирующую кровь. Благодаря циркуляции этот лактат достигает гепатоцитов в перипортальной зоне, где используется для синтеза глюкозы и гликогена через непрямой глюконеогенный путь. Одновременная активность гликолиза и глюконеогенеза в печени предсказана моделью зонации метаболизма (Jungermann, Sasse, 1978; Jungermann, Kalz, 1982).
Преобладание глюконеогенеза и окислительного энергетического метаболизма в более «аэробной» перипортальной зоне, а гликолиза и липонеогенеза в менее «аэробной» перивенозной зоне хорошо соответствует термодинамическим представлениям (Jungermann, Sasse, 1978). Глюконеогенез является эндотермическим процессом (47.2 ккал/моль глюкозы) (Decker et al., 1970; Thauer et al., 1977), поэтому он должен быть сопряжен с окислительно-энергетическим метаболизмом. Так как гликолиз + липогенез являются экзотермическими процессами (- 71.1 ккал/моль глюкозы) (Decker et al., 1970; Thauer et al., 1977), то синтез жирных кислот из глюкозы в принципе может протекать независимо от окислительного энергетического метаболизма. Следовательно, более высокую способность к глюконеогенезу следует ожидать в более «аэробных» перипортальных гепатоцнтах, а способность к гликолизу - в менее «аэробных» перивенозных гепатоцитах.
Зональное разделение продукции и поглощения глюкозы является важным фактором в поддержании печенью гомсостаза глюкозы в организме. Зональная гетерогенность в распределении ферментов углеводного метаболизма (Lamers et al., 1987; Jungermann, Katz, 1989; Wimmer et al., 1990) развивается у крыс и мышей постепенно, в течение первых недель жизни. Отчасти это происходит еще до перехода детенышей от питания молоком самки на самостоятельное питание, а частично во время этого перехода. Снабжение эмбриона энергией поддерживается путем поступления глюкозы из организма матери. Поэтому в пренатальной печени ферменты глюконеогенеза отсутствуют. Печень эмбриона способна осуществлять только гликолиз и зонация гепатоцитов в это время отсутствует (Jungermann, 1986), Ma стадии питания детенышей молоком матери постоянное богатое глюкозой питание через материнскую кровь, наблюдавшееся у эмбриона, замещается молоком матери, которое богато жирами и белками, но бедно углеводами. Неонатапьная печень уже обладает способностью снабжать глюкозой другие органы. Далее роль глюконеогенеза, как глюкостатического процесса, постоянно растет. Глюконеогенные ферменты, такие как фосфоенолпируват карбоксикиназа, фруктозо- 1,6-днфосфатаза и глюкозо-6-фосфатаза, индуцируются при рождении, но вначале без какой-либо зональной градации. При переходе детенышей к самостоятельному питанию, когда их пища становится богатой углеводами, происходит индукция ключевого фермента гликолиза - глюкокиназы (Kirchner et al., 1993). Печень приобретает функцию "глюкостата", полностью развивается зонация глюкозо-6-фосфатазы (Katz et al., 1976; Sokal et al., 1989) фосфоенолпируват карбоксикиназы (Andersen et al., 1983; Wimmer et al., 1990) и пируваткиназы. В результате всех этих перестроек зонация углеводного обмена в печени приобретает черты характерные для взрослого животного.
Синтез гликогена в гепатоцитах, как известно, может происходить прямым (глюкоза — глюкозо-6- фосфат — гликоген) и непрямым (глюкоза — лактат, пируват — глюкозо-6-фосфат — гликоген) путем. Полагают, что перипортальный гликоген синтезируется «непрямым путем» из глюкоиеогенных предшественников, а перивенозный гликоген образуется «прямо» из глюкозы (Newgard ct а]., 1983; Sugden et al., 1983; Gebhard, 1992; Jungermann, Kictzmann, 1997; Kruszynska, 1999). Этот вывод соответствует данным о зональном распределении глюкокиназы и глюкозо-6-фосфатазы (Jungermann, Katz, 1989). Показано, что отношение глюкокиназы к глюкозо 6-фосфатазе в перивенозных гепатоцитах в 6 раз выше, чем в перипортальных гепатоцитах. Поэтому, когда глюкоза являлась единственным субстратом, синтез гликогена локализовался преимущественно в перивенозной области. Если допустить, что глюкоза/глюкозо-6-фосфатазный цикл регулируется лишь доступностью субстрата (Hers, Hue, 1983), то способность к чистому поглощению глюкозы будет гораздо выше в перивенозных зонах печени. Вышесказанное предполагает, что только перивенозная зона дольки способна осуществлять чистое поглощение глюкозы (Jungermann et al., 1982) и, таким образом, синтезировать гликогена из глюкозы.
Цитофлуориметрическое определение содержание гликогена в гепатоцитах больных хроническим гепатитом и циррозом печени
Показано, что при голодании уровень глюкозы в крови пациентов с хроническими заболеваниями печени обычно находится в пределах нормы или даже несколько превышает ее (Owen et al., 1981; Krahenbuhl ct al., 1991; Giardina et al., 1994; Petersen et al., 1999; Schneiter et al., 1999). Отчасти это можно объяснить большой резервной способностью печени к продукции глюкозы. По некоторым данным, для поддержания продукции глюкозы печенью в норме необходимо всего лишь 20% от функциональной массы гспатоцитов (Kruszynska, 1999). Наличие у таких больных гипогликемии обычно объясняют гепатоцеллюлярной недостаточностью, которая развивается на конечной стадии заболевания или острым воспалительным процессом. Гипогликемия также может быть связана с повреждением печени в результате воздействия различных токсинов (парацетамол, хлороформ) или при остром вирусном гепатите, вызывающем некроз значительной массы паренхимы (Felig et al., 1970; Record, 1975). Некоторые авторы полагают, гипогликемия у пациентов с хроническими поражениями печени связана с повышенной утилизацией глюкозы. Увеличение интенсивности анаэробного гликолиза и повышенная потребность в глюкозе могут быть вызваны гипоксией, которая развивается в циррозной печени (Evans, 1989; Lang, 1992).
Концентрация глюкозы в крови при голодании отражает баланс между ее продукцией печенью и усвоением периферическими тканями. Одновременное усиление или снижение этих процессов вызывает заметные изменения лишь в обороте глюкозы, существенно не влияя на ее уровень в крови. Поэтому нормальный уровень глюкозы в крови у пациентов с хроническими заболеваниями печени еще не означает, что продукция глюкозы печенью находится в пределах нормы.
Данные о продукции глюкозы печенью при циррозе довольно противоречивы. С одной стороны показано, что скорость продукции глюкозы у пациентов с циррозом нормальная (DeLissio et al., 1991; Shmueli et al., 1993; Pctrides et al., 1994), а с другой стороны было найдено, что продукция глюкозы у таких больных снижена (Reichle et al., 1978; Owen et aL, 1981; Merli, et al., 1986; Johansson et al., 1994). Обнаружено, что при алкогольном циррозе относительно нормальная скорость продукции глюкозы печенью, поддерживается за счет усиленной секреции глюкагона (Keller et al., 1982). Другие исследователи также предполагают сниженный гипергликемический ответ у больных с хроническими поражениями печени на введение только глюкагона или глюкагона вместе с адреналином (Felig, 1975; Petrides, 1994). Исследование с использованием радиоизотопов и катетеризации печеночной вены показало, что после ночного голодания продукция глюкозы в печени циррозных больных была на 20-40% ниже, чем в норме (Owen et al., 1981; Piniewska ct al., 1986). Среди главных причин снижения продукции глюкозы циррозной печенью можно назвать невосприимчивость печени к глюкагону; а также ухудшение доставки глюкагона и глюконеогенных субстратов к печени в результате порто-системного шунтирования (Sherwin et al., 1981; Johansson et al., 1994; Petersen et al., 1999; Kruszynska, 1999). Поскольку в норме гликогенолиз играет важную роль в продукции глюкозы печенью после ночного голодания (Magnusson et al., 1995), сниженное содержание гликогена в печени также может играть важную роль в снижении продукции глюкозы у больных циррозом.
Данные о содержании гликогена в цирротически измененной печени немногочисленны и достаточно противоречивы. Сниженные концентрации гликоі-ена в печени были найдены у пациентов с острым вирусным гепатитом (Felig et al., 1975). Показано также, что у больных циррозом алкогольной этиологии содержание гликогена в печени составляет 25.8±3.5 мг/г сырой массы, что ниже, чем у здоровых людей (32.0-48.8 мг/г сырого веса) (Owen et al., 1981). Кроме того, было установлено, что через 5-6 часов после приема пищи концентрация гликогена в печени больных циррозом была значительно ниже, чем у здоровых волонтеров (Petersen et al., 1999). Исследование содержания гликогена в печени крыс с экспериментальным циррозом показало, что оно было на 64% ниже, чем у контрольных животных (Krahenbuhl et al., 1991). Однако в других работах было показано, что содержание гликогена в циррозной печени находится в пределах нормы или даже превышает ее (Bondy, 1958; Мансуров, Кутчак, 1964; Блюгер, 1978). Цитофотометрическое определение содержания гликогена в гепатоцитах, изолированных из биопсийного материала печени больных хроническим гепатитом и циррозом различной этиологии, показало, что его уровни в несколько раз превышают норму (Кудрявцева, 1987; Кудрявцева и др., 1982, 1989).
Исследования, проведенные на животных, показали наличие тесной корреляции между содержанием гликогена в печени и направлением углеродного потока через гликолиз или глюконеогенез (Foster, 1984; Newgard et al., 1984; Holness, 1988; Sugden, 1989). Хотя некоторые авторы считают, что скорость глюконеогенеза при циррозе не изменяется или даже падает (Steiner et al., 1962; Piniewska et al., 1986), большинство имеющихся данных свидетельствует о том, что интенсивность глюконеогенеза в цирротической печени усиливается (Ncwsholme, 1976; Owen et al., 1983; Kruszynska, Mclntyre, 1991; Krahenbuhl, Reichen, 1993; Petersen et al., 1999). Усиление глюконеогенеза цирротической печенью приводит к изменению вклада гликогенолиза и глюконеогенеза в продукцию глюкозы. Если в нормальной печени после ночного голодания 70-80% глюкозы образуется за счет гликогенолиза, а остальные - путем глкжогеногенеза (Kruszynska, Mclntyre, 1991; Kruszynska, 1999), то при циррозе вклад глюконеогенеза в продукцию глюкозы возрастает до 67-87% (Owen et al., 1981; Petersen et al., 1999).
Данные об активности ключевых ферментов гликолиза и глюконеогенеза в цирротической печени неоднозначны. Одни авторы отмечают, что у больных алкогольным циррозом печени после ночного голодания активность ключевых ферментов глюконеогенеза пируваткарбоксилазы, фосфоенолпируваткарбоксикиназы и фруктозо 1 »6« дифосфатазы - не отличается от нормы (Owen et al., 1981). Однако другие авторы наблюдали уменьшение в печени больных циррозом активности фруктозо-1,6-дифосфатазы, глюкозо-6-фосфатазы и глюкокипазы и увеличение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и гексокииазы (Pieniazek et al., 1985; Sotaniemi et al., 1985; Shimamura, 1987; Taketa et al., 1988; Krahenbuhl etal., 2003).
