Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Современные представления о бактерицидных системах нейтрофилов 11
1.1.1. Кислородзависимая система 16
1.1.2. Кислороднезависимая система 24
1.1.3. Нитроксидсинтаза и реактивные нитрогенные радикалы при бактери-альных инфекциях 29
Глава 2. Материалы и методы 39
2.1. Материал 39
2.1.1. Инфекционные агенты 39
2.1.2. Экспериментальные животные 40
2.2. Методы 40
2.2.1. Методы выделения фагоцитирующих клеток и их культивирования 40
2.2.2. Методы оценки функциональной активности нейтрофилов 43
2.2.3. Методы статистической обработки данных 50
Глава 3. Характеристика кислородзависимой и кислороднезависимой бактерицидных систем нейтрофилов при заражении Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes в системе in vitro 53
3.1. Характеристика кислородзависимой и кислороднезависимой систем нейтрофилов человека при заражении Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes 56
3.2. Характеристика кислородзависимой и кислороднезависимой систем нейтрофилов воспалительного экссудата мышей при заражении Y. pseudo- tuberculosis и L. monocytogenes 61
3.3. Сравнительная характеристика бактерицидных систем нейтрофилов воспалительного экссудата мышей и крови доноров при заражении клеток Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes 68
3.4. Сравнительная характеристика кислородзависимой и кислороднезависимой систем лейкоцитов крови и перитонеального экссудата интактных морских свинок при заражении Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes 76
Глава 4. Характеристика кислородзависимой и кислороднезависимой бактерицидных систем лейкоцитов животных, зараженных Y. pseudotu berculosis и L. monocytogenes 83
Глава 5. Нитроксидсинтаза и реактивные нитрогенные радикалы в нейтрофилах при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях 94
5.1. Нитроксидобразующая активность нейтрофилов при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях в системе in vitro 94
5.2. Нитроксидобразующая активность лейкоцитов животных, зараженных Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes 108
Глава 6. Взаимосвязь нитроксидобразующей, кислородзависимой и кислороднезависимой бактерицидных системам нейтрофилов при псевдотубер кулезной и листериозной инфекциях 113
Заключение 125
Выводы 135
Список литературы 137
- Нитроксидсинтаза и реактивные нитрогенные радикалы при бактери-альных инфекциях
- Методы выделения фагоцитирующих клеток и их культивирования
- Характеристика кислородзависимой и кислороднезависимой систем нейтрофилов воспалительного экссудата мышей при заражении Y. pseudo- tuberculosis и L. monocytogenes
- Характеристика кислородзависимой и кислороднезависимой бактерицидных систем лейкоцитов животных, зараженных Y. pseudotu berculosis и L. monocytogenes
Введение к работе
Актуальность. Активная и мгновенная реакционная способность нейтрофильных лейкоцитов на раздражитель определяет их важную роль при различных воспалительных процессах. В двоякой функции нейтрофилов, объединяющей воспалительную и противоспалительную активность, отражено понятие воспаления как совокупности воспалительных и противовоспалительных реакций [139; 142; 236]. Нейтрофилы являются первыми клеточными элементами, которые задолго до моноцитов и лимфоцитов мигрируют через эндотелии сосудов, вблизи очага воспаления. Спектр биологически-активных веществ нейтрофилов включает свободные кислородные радикалы, протеиназы, бактерицидные протеины и цитокины, которые как по отдельности, так и в совокупности, оказывают влияние на регуляцию процессов воспаления.
В конце 1970-х гг. были выявлены и изучены четыре бактерицидных системы нейтрофильных гранулоцитов. В. Е. Пигаревским была предложена следующая их классификация: 1) миелопероксидазная система; 2) лизоцим; 3) лактоферрин; 4) неферментные катионные белки [34]. В дальнейшем, в связи с многочисленными исследованиями, представления о микробицидных системах нейтрофилов несколько изменились [184]. На данный момент сочли необходимым считать миелопероксидазу ферментом кислородзавимой системы, а лизоцим и лактоферрин составляющими кислороднезависимой системы. Кроме того, в связи с открытием молекулы оксида азота, была выделена нитроксидобразующая система. Таким образом, на данный момент для нейтрофилов обозначены три основные бактерицидные системы: 1) кисло-родзависимая система, в состав которой входят система НАДФН-производных оксидантов и Н2О2 — миелопероксидазная система; 2) нитроксидобразующая система, включающая реактивные посредники азота, произ-
водные NO-синтазы; 3) система белков нейтрофильных гранул (антимикробные белки, протеазы, серинпротеиназы, металлопротеиназы) [184].
Основным компонентом бактерицидных систем нейтрофилов, является фермент миелопероксидаза. Наряду с катиоиными белками, этот фермент относится к специфическим маркерам нейтрофила и характеризует качественные стороны гранулярной зернистости клетки. В современной литературе акцентировано внимание на новых направлениях исследований молекул-эффекторов, производных нейтрофилов, рассмотренных на примере миело-пероксидазо-производных оксидантов, действующих на значительном расстоянии от воспалительного очага.
Вопрос о значении оксида азота в обеспечении бактерицидности фагоцитов при различных инфекциях в последнее десятилетие активно изучается в отношении моноцитов/макрофагов, что освящено в обзорах С. Fang [109], С. Nathan [179], N. Zamora с соавт. [244], Ю.Н. Гончарук [15]. Кроме того, показано значение реактивных промежуточных продуктов азота (нитратов и нитритов) при различных патологических процессах у человека, но при этом не достаточно выяснен механизм их эндогенного образования. Также на настоящий момент до конца не раскрыты причины различия нитрооксидобра-зующей активности у нейтрофилов человека и животных.
В исследованиях, проведенных в НИИ СО РАМН ранее, представлена морфофункциональная характеристика нейтрофилов и их влияние на макрофаги при псевдотуберкулезной инфекции [39; 40]. До настоящего времени в литературе отсутствуют сведения о сравнительной характеристике бактерицидных систем нейтрофилов, а также о значении оксида азота в бактерицидности нейтрофилов при бактериальных инфекциях, в частности при псевдотуберкулезе и листериозе. Работ по цитоморфологическим исследованиям NO-синтазной активности нейтрофилов при данных инфекционных заболеваниях в доступной нам литературе не обнаружено.
Цель исследования В сравнительном аспекте охарактеризовать бактерицидные системы нейтрофилов и оценить их значение на ранних этапах псевдотуберкулезной и листериозной инфекций.
Задачи исследования
В системе in vitro определить активность компонентов кислородзави-симой ферментной системы нейтрофилов доноров и интактных животных при заражении их Yersinia pseudotuberculosis и Listeria monocytogenes.
В системе in vitro исследовать нитроксидобразующую активность нейтрофилов доноров и интактных животных при их взаимодействии с Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes.
В системе in vivo исследовать активность нитроксидобразующей, ки-слородзависимой и кислороднезависимой ферментных систем нейтрофилов морских свинок, зараженных Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes.
Провести корреляционный анализ между показателями активности нитроксидобразующей, кислородзависимой и кислороднезависимой систем нейтрофилов различных биологических моделей при обеспечении их бактерицидной функции на ранних этапах псевдотуберкулезной и листериозной инфекций.
Научная новизна
Установлена активность нитроксидсинтазы и образование метаболитов оксида азота в нейтрофилах человека и животных при псевдотуберкулезной инфекции.
В сравнительном аспекте показана реактивность нитроксидобразующей, кислородзависимой и кислороднезависимой бактерицидных систем нейтрофилов различных биологических моделей при их заражении Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes.
На основании цитохимических исследований установлены различия в динамике активности составляющих ферментов дыхательной цепи нейтрофилов в зависимости от вида возбудителя, что свидетельствует о дифферен-
цированных путях образования активных метаболитов кислорода в нейтро-филах при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях.
Установлена корреляция между показателями активности нитроксидобразующей, кислородзависимой и кислороднезависимой бактерицидных систем нейтрофилов при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях.
Теоретическая и практическая значимость работы Теоретическая значимость диссертационной работы заключается в том, что полученные в ней новые данные расширяют понятие о морфофункцио-нальном состоянии нейтрофильных лейкоцитов в зависимости от вида патогенных бактерий, а также о нитроксидобразующей способности этих клеток при бактериальных инфекциях.
Практическая ценность работы определяется тем, что тестирование активности бактерицидных ферментных систем нейтрофилов, относящихся к первой линии антиинфекционной защиты организма, может быть использовано для выявления гранулоцитарных иммунодефицитов и для контроля эффективности коррекции этих состояний. Положения, выносимые на защиту
На ранних этапах псевдотуберкулезной и листериозной инфекций антимикробная защита обеспечивается за счет комплексного реагирования кислородзависимой, кислороднезависимой и нитроксидобразующей бактерицидных систем нейтрофилов человека и животных, активность которых зависит от вида возбудителей и физиологического состояния этих клеток при разных условиях экспериментов.
Различия в динамике активности ферментов дыхательной цепи нейтрофилов изученных биологических моделей свидетельствуют о дифференцированных путях образования активных метаболитов кислорода в этих клетках при контакте с Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes, отличающимися по механизмам фагоцитирования.
3. Установлена взаимосвязь между кислородзависимой, кислород-независимой и нитроксидобразующей бактерицидными системами нейтро-филов при указанных инфекциях, с преимущественно прямой корреляцией показателей активности этих систем в ответ на воздействие Y. pseudotuberculosis и обратной корреляцией - на воздействие L. monocytogenes.
Нитроксидсинтаза и реактивные нитрогенные радикалы при бактери-альных инфекциях
Интенсивное изучение биологического влияния оксида азота (N0) началось с 1980 г., когда в журнале "Nature" появилась статья американского физиолога Роберта Форчготта (Robert Furchgott), в которой сообщалось об открытии в изолированных кровеносных сосудах эндотелиального фактора релаксации сосудов (ЭФРС - endothelium-derived relaxing factor). Этот агент продуцируется в эндотелии кровеносных сосудов в ответ на ацетилхолин, брадикинин и другие биологически активные вещества, вызывая расслабление гладкой мускулатуры сосуда [225]. В 1986 г., через 6 лет после открытия ЭФРС, R. Furchgott с соавторами показали, что поведение этого агента напоминает эффект N0, отсюда ими было сделано предположение, что ЭФРС либо идентичен оксиду азота, либо включает таковой как компонент [65]. Позже в литературе появились данные о накоплении нитратов и нитритов в среде инкубации иммуноактивных макрофагов и было показано, что этот процесс коррелирует с цитотоксическим действием макрофагов на клетки мишени [78; 162; 171; 217].
Известно, что оксид азота обладает высокой проницаемостью через мембраны клеток и субклеточных структур благодаря малым размерам его молекулы. Взаимодействуя с другими свободными радикалами, N0 способен образовывать ковалентные связи, при помощи которых он может, как активировать цепные свободно - радикальные реакции, так и ингибировать их [53; 65; 171; 189]. Кроме того, N0 может взаимодействовать с белками и низкомолекулярными соединениями, содержащими в активном центре ионы переменных металлов, а также вступать в окислительно-восстановительные процессы, образуя многочисленные азотсодержащие соединения [177]. Ряд фактов свидетельствует об участии N0 в процессе воспаления, например, проявлении цитопротективных и цитотоксических свойств при ревматоидном артрите и васкулите [61; 77; 183; 186; 192; 246]. Усиление синтеза N0 в клетках дыхательных путей наблюдалось при аллергическом воспалении у людей, при нарушениях [59], связанных с усиленной текучестью плазмы и при запуске провоспалительной каскадной системы [72]. Провоспалительные цитокины, в частности TNF-a и у-интерферон (IFN-y), индуцируют транскрипцию iNOS [186; 234]. Исследования in vivo показали, что эти цитокины являются регуляторами синтеза N0 во время развития бактериальной инфекции [52; 89; 105; 191; 235; 237].
Как известно по данным В.П. Реутова с соавт. [45], образование нитритов и нитратов в организме млекопитающих может идти разными путями. Существует два механизма образования оксида азота: 1) нитроксидсинтаз-ный механизм при участии NO-синтаз, который осуществляется в присутствии кислорода; 2) нитритредуктазный механизм - восстановление ионов NCb, NO3 в N0 в условиях дефицита кислорода. Эти два механизма связаны между собой и являются составляющими компонентами цикла оксида азота [45; 65]. Отсюда следует, что гистохимическое определение активности NO-синтазы не всегда отражает истинную продукцию оксида азота в клетках организма. Поэтому необходимо сочетанное использование методов определения нитратов / нитритов, гистохимического определения NO-синтазы, а также ее внутриклеточной локализации с помощью моноклональных антител [60]. NO-синтазы - уникальные димерные соединения среди эукариотиче-ских ферментов. Они содержат как флавинадениндинуклеотид, так и флави наденинмононуклеотид - компоненты цепи переноса электронов с редуктаз-ного домена, где находится никотинамиддинуклеотидфосфат (НАДФ), на ок-сигеназный домен, где и происходит электронное окисление неароматической аминокислоты L-аргинина при помощи тетрагидробиптерина [162; 186; 178]. Промежуточные соединения реактивного азота представлены оксидом азота, способным реагировать с кислородом и образовывать более сильные окислители, например двуокись азота (NO2). Существует мнение [74], что прямая токсичность N0 в фагоцитах не является существенной, но она значительно усиливает реактивность кислородного радикала - супероксида -при формировании пероксинитрита. В свою очередь, пероксинитрит оказывает выраженное токсическое действие на клетки эукариоты и прокариоты. У мышей с угнетенной индуцибельной NO-синтазой участие фермента в антимикробной защите проявлялось только против ограниченного ряда инфекций, в частности, Mycobacterium tuberculosis и Leishmania major. У мышей, лишенных как N0, так и НАДФН-оксидазы (gp91phox), формировались огромные абсцессы, содержащие комменсальные микроорганизмы, большей частью энтеробактерии [167].
При нитроксидсинтазном пути основным источником N0 является аминокислота L-аргинин, входящая в состав регуляторных пептидов. При участии NO-синтазы происходит преобразование L-аргинина в L-цитруллин с высвобождением N0 [65; 186]. По классификации выделяют три типа N0-синтаз. Одна из них, индуцибельная NO-синтаза (iNOS), впервые была выделена из макрофагов, имеет молекулярную массу 130 кДа, преимущественно находится в растворимой форме. Она образуется в макрофагах, активированных бактериальными липополисахаридами (эндотоксинами) и некоторыми медиаторами воспаления, в частности, противовоспалительными цитокина-ми, например IL-1 и IL-2, TNF-d, INF-y. Индуцибельная NO-синтаза, в отличие от конститутивных (нейрональной nNOS и эндотелиальной eNOS), менее зависима от кальмодуллина и Са2+ [177].
Как правило, продукция NO-синтазы происходит при воспалительных процессах различной этиологии. В фагоцитирующих клетках N0 действует как один из основных эффекторов системы клеточного иммунитета, направленной на уничтожение в организме патогенных микробов и злокачественных клеток. В клетках грызунов индуцибельная NO-синтаза производит в больших количествах оксид азота, который способен модулировать иммунные, воспалительные и сердечно-сосудистые ответы. Несмотря на немалые усилия, приложенные к разработке селективных ингибиторов iNOS в терапии, роль ее в инфекционных и воспалительных процессах у человека остается мало изученной и нитроксидсинтаза нейтрофилов еще до конца не охарактеризована. В ранних публикациях сообщается о содержании в нейтрофи-лах человека конститутивных NO-синтаз и о способности таковых генериро- ; вать небольшие количества N0 [87].
В настоящее время большинство исследователей полагают [7; 8; 9; 65; 109; 209; 231], что цитостатическое / цитотоксическое действие обусловлено более всего способностью N0 продуцировать в реакции с супероксидным радикалом пероксинитрит (ONOO-). Этот анион сравнительно стабилен в щелочной среде, но при физиологических значениях рН, присоединяя протон, в течение секунды распадается, оказывая как протонированныи продукт сильнейшее окислительное действие на различные внутриклеточные мишени [109]. Известно, что пероксинитрит обладает гораздо большей реакционной способностью, чем N0 или супероксидный радикал в отдельности.
Методы выделения фагоцитирующих клеток и их культивирования
Первичную культуру нейтрофилов мышей (нейтрофилы воспалительного экссудата) получали, вызывая внутрибрюшинное воспаление путем введения стерильного 10 % мясопептонного бульона (0,5 мл). Через 9 ч перитонеальную полость мышей промывали 5 мл холодной среды 199. Концентрацию клеток доводили до 2x106 кл/мл и разносили по 0,9 мл в пробирки с покровными стеклами и в плоскодонные 96-ти луночные микропланшеты по 100 мкл на лунку. Для адгезии взвесь нейтрофилов оставляли в термостате при 37 С в смешанной атмосфере с присутствием 5% СО2. Через 40 мин неадгезированные клетки отмывали дважды и выдерживали в термостате в течение 13 ч в среде 199, включающей 20 % эмбриональной сыворотки коровы, 2 ц.М глутамина, 0,2 иМ гентамицина и 100 ед/мл пенициллина [89]. Качество культуры оценивали методом прижизненного наблюдения клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии. 2) Получение фракции нейтрофилов крови доноров. Для получения фракции человеческих нейтрофилов использовали донорскую кровь, предоставленную Приморской Краевой станцией переливания крови. Лейкоконцентрат крови доноров (5,0 мл) наслаивали на растворы фикол- ла/урографина разной плотности (1,117 и 1,077) в соотношении 1:1:2 соот ветственно в силиконизированные пробирки и центрифугировали в течение 40 мин при 1500 об/мин. Верхняя интерфаза на границе плазма - раствор урографин / фиколл, плотностью 1,077 гр/см , состояла из лимфоцитов и мо ноцитов, нижнюю интерфазу на границе градиентных растворов составляла популяция нейтрофилов. Кольцо нейтрофилов собирали и отмывали трижды от фиколл/урографина холодной средой 199, при 1500 об/мин. Осадок ресус- пендировали, в камере Горяева подсчитывали количество клеток, с верифи кацией нейтрофилов по форме клеточного ядра.
Концентрацию клеток дово дили до 2 х 106 кл/мл и разносили по 100 мкл в лунки плоскодонных 96 лу ночных планшетов и по 0,9 мл в пробирки с покровными стеклами. Жизне способность клеток оценивали в тесте с трипановым синим. 3) Лейкоконцентрат перитонеального экссудата морских сви нок и мышей получали путем промывания холодной средой 199 перитоне- альной полости интактных морских свинок и мышей. В камере Горяева под считывали количество клеток, с верификацией нейтрофилов и мононуклеа- ров по форме клеточного ядра. Жизнеспособность клеток оценивали в тесте с трипановым синим. Концентрацию клеток доводили до 2 х 106 кл/мл и кле точную суспензию разносили по 0,9 мл в пробирки с покровными стеклами, по 100 мкл в лунки плоскодонных 96 луночных планшетов и по 300 мкл в микропробирки Эппиндорфа. 4) Получение фракции адгезирующих клеток крови морских свинок. 5,0 мл гепаринизированной (10 ед/мл) венозной периферической крови смешивали с 0,5 мл 1 % раствора желатина на среде 199 и инкубировали при 37 С в термостате в течение 30 мин. Надосадочную жидкость собирали и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 12 мин, затем осадок ре-суспендировали в холодной среде 199 и дважды отмывали от желатина. После чего клеточный осадок вновь ресуспендировали в 1 мл среды 199, и в камере Горяева подсчитывали количество клеток, с верификацией нейтрофилов и мононуклеаров по форме клеточного ядра. Концентрацию клеток доводили до 2х106 кл/мл и суспензию разносили по 0,9 мл в пробирки с покровными стеклами, по 100 мкл в лунки плоскодонных 96 луночных планшетов и по 300 мкл в микропробирки Эппиндорфа. К адгезированным клеткам вносили суспензию микроорганизмов из расчета 10 бактерий на 1 фагоцит. Время контакта монослоя лейкоцитов с бактериями в термостате при 37 С составило в пенициллиновых флаконах и планшетах 5, 10, 15, 25, 35, 45 мин, 1, 2, 3 и 5 ч; в пробирках Эппиндорфа 15 мин, 1,2, 3 и 5 ч. Для стимуляции нитрообразующей активности клеток использовали человеческий интерферон-у (INF-y, ФГУП НПО «МикроГен»). Для этого к монослою нейтрофилов крови доноров и нейтрофилов воспалительного экссудата мышей добавляли INF-y в концентрации 200 ME на основе инкубационной среды [89]. Через 16 ч инкубации при 37 С в термостате, монослой клеток отмывали физиологическим раствором и вносили суспензию микроорганизмов из расчета 10 бактерий на 1 фагоцит. Контроль составляли клетки без внесения бактерий и INF-y. После инкубации в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9 ч, монослой клеток оставляли при -20 С.
Характеристика кислородзависимой и кислороднезависимой систем нейтрофилов воспалительного экссудата мышей при заражении Y. pseudo- tuberculosis и L. monocytogenes
В ответ на заражение Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes нейтрофилов воспалительного экссудата, полученного после введения в брюшную полость мышей мясопептонного бульона, суммарная активность ферментов дыхательной цепи в НСТ-тесте достоверно не отличалась от контрольных показателей в течение первых 15 мин инфекции (рис. За). Наибольшее повышение активности ферментов Нф в НСТ-тесте при псевдотуберкулезной инфекции отмечалось во временном периоде от 35 мин до 90 мин, где максимальный индекс стимуляции составил 16,14 ± 0,8 %;р 0,05 (35 мин), после чего, до конца срока наблюдения, показатели находились в пределах контрольного уровня. При листериозной инфекции повышение суммарной активности ферментов дыхательной цепи клеток отмечалось в периоде от 25 мин до 120 мин со значениями индекса стимуляции в пределах от 12,35 ± 0,09 %; р 0,02 (25 мин) до 34,96 ± 0,45 %;р 0,002 (90 мин). Через 3 ч листериозной инфекции эти показатели снижались до уровня контроля и оставались в пределах от -0,93 ± 0,53 % (р 0,10) до 4,19 ± 0,82 % (р 0,10) до конца срока наблюдения. Как видно, суммарная активность ферментов дыхательной цепи Нф была интенсивнее при листериозной инфекции, по сравнению с псевдотуберкулезной.
Тем не менее, при псевдотуберкулезной инфекции было выявлено повышение значений индекса стимуляции для сукцинатдегидрогеназы до 6,57 ± 0,26 % (р 0,05) через 35 мин (рис. 36) и для лактатдегидрогеназы в период от 15 мин до 60 мин до 11,79 ± 0,76 %; (р 0,05) (рис. Зв). По нашему мнению, эти данные указывают на образование АМК по пути II комплекса с участием НАДФ, так как указанные ферменты выполняют функции катализаторов при передаче восстановительного эквивалента с субстрата на НАДФ. Отмеченное при этом повышение активности цитохромоксидазы - фермента комплекса IV дыхательной цепи - до 48,04 ± 0,38 % (р 0,01) через 25 мин после заражения Y. pseudotuberculosis (рис. Зг) отражает собственно образование основного аниона Ог", а последующее снижение показателей до -24,77 ± 0,67 %; р 0.05 (5 ч), по нашему мнению, свидетельствуют о цитотоксиче-ском действии на нейтрофилы как бактерий Y. pseudotuberculosis, так и повышенного количества генерированных самими нейтрофилами активных метаболитов кислорода. Этот факт подтверждают высокие значения индекса стимуляции (от 13,67 ± 0,23 % (р 0,05) до 37,67 ± 0,058 % (р 0,05)) для миелопероксидазы (рис. Зд) - фермента- антиокислителя, субстратом для которого служит перекись водорода.
В ответ на заражение L. monocytogenes активность составляющих ферментов кислородзависимой системы (ЛДГ, СДГ) в нейтрофилах воспалительного экссудата повышалась незначительно до 11,11 ±0,037 %; р 0,10 (90 мин) и 4,54 ± 0,04 %;р 0,10 (60 мин) соответственно. Однако имелось достоверное повышение активности ЦХО в клетках до 14,69 ± 0,51 %; р 0,05 (35 мин) и МПО до 15,01 ± 0,93 %;р 0,05 (90 мин) в ответ на заражение этим видом бактерий. Таким образом, как при псевдотуберкулезной, так и при листериозной инфекциях установлена реакция кислородзависимой системы нейтрофилов с дифференцированным ответом отдельных составляющих компонентов этой системы.
На протяжении всего срока наблюдения в нейтрофилах воспалительного экссудата при заражении Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes показатели активности катионных белков были отрицательными и их динамика носила волнообразный характер (рис. 7). По данным 10. А. Мазинга [24; 35], это свидетельствует о расходовании катионных белков в процессе взаимодействия с бактериями, при этом дегрануляция Нф более выражена в ответ на заражение Y. pseudotuberculosis. Периоды достоверного снижения значений индекса стимуляции указывают на выделение катионных белков из гранул, а периоды повышения их до уровня контроля, соответственно, на восстановление этих компонентов. Причем, при контакте Нф с Y. pseudotuberculosis полного восстановления катионных белков не происходило до конца срока наблюдения, о чем свидетельствуют значения индекса стимуляции, которые находились в пределах от -4,45 ±0,15%; р 0,10 (5 мин) до -17,59 ± 0,40 %; р 0,05 (45 мин). При контакте клеток с L. monocytogenes повышение индекса стимуляции до уровня контроля отмечалось через 15 мин и 5 ч (рис. 7), где показатели составляли -2,89 ± 0,13 % (р 0,10) и 1,24 ± 0,39 % (р 0,10) соответственно. Периоды дегрануляции Нф в ответ на заражение этими бактериями наблюдались через 10 мин после заражения и в дальнейшие сроки от 35 мин до 45 мин и от 120 мин до 3 ч. Значения индекса стимуляции в эти периоды составляли -14,25 ± 0,57 %;р 0,05 и -15,90 ± 0,52 %;р 0,05 (45 мин) и -12,60 ± 0,36 %;р 0,05 (3 ч) соответственно.
При сравнении кислородзависимой и кислороднезависимой систем нейтрофилов воспалительного экссудата следует отметить, что при контакте с Y. pseudotuberculosis время частичного восстановления КБ - 35 мин (рис. 7) до -7,83 ±0,12 % совпадает с временем максимального повышения активности МПО (рис. Зд), а при контакте с L. monocytogenes период дегрануляции от 25 мин до 45 мин (рис. 7) совпадает с началом повышения индекса стимуляции в НСТ-тесте (рис. За).
Характеристика кислородзависимой и кислороднезависимой бактерицидных систем лейкоцитов животных, зараженных Y. pseudotu berculosis и L. monocytogenes
Известно [31], что при заражении различными видами бактерий фагоцитирующие клетки в опытах in vitro проявляют ферментативную активность, отличную от таковой в клетках зараженного организма (in vivo). Исходя из вышеизложенного, на модели in vivo нами исследовалась ферментативная активность фагоцитов морских свинок, зараженных внутрибрюшинно Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes.
В периферической крови зараженных животных динамика накопления клеток зависела от вида бактерий (рис. 15а). При заражении морских свинок. Y. pseudotuberculosis процентное содержание нейтрофилов на протяжении 2 ч сохранялось в пределах контроля, а далее до конца срока наблюдения, находилось ниже контрольного уровня в пределах от 8,66 ± 1,53 % до 13,66 ± 2,52 % (р 0,05) (контроль составил 22,91 ± 5,06 %). При этом содержание моноцитов крови увеличивалось, достигая максимума через 7 ч после заражения - 14,33 ± 5,51 %; р 0,05 (контроль - 4,09 ± 1,7 %). Затем процентное содержание моноцитов резко снижалось и к концу срока наблюдения было ниже контроля (2,66 ± 1,53 %;р 0,10).
После заражения животных L. monocytogenes на более поздних сроках наблюдения реагировали нейтрофилы крови. Так, содержание нейтрофилов повышалось после 2 ч до 41,33 + 6,81 % (р 0,05), нарастало с максимумом через 5 ч - 46 ± 6,43 % (р 0,05), а затем находилось выше контрольного уровня до конца срока наблюдения. Процентное содержание моноцитов периферической крови было высоким на протяжении всего срока наблюдения и находилось в пределах от 8,67 ± 1,53 % (р 0,05) до 13,67 ± 2,08 %(р 0,05).
При исследовании перитонеального экссудата морских свинок, зараженных Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes (рис. 156), выявлено, что в очаге воспаления увеличение процентного содержания макрофагов до максимального уровня наблюдалось через 0,5 ч после заражения (59,66 ± 4,72 %; р 0,05 и 83,67 ± 6,03 %; р 0,02 соответственно), контроль составил 36,58 ± 1,5 %. В дальнейшем, содержание макрофагов уменьшалось, но при этом у животных, зараженных Y. pseudotuberculosis, через 2 ч их количество было ниже контрольного уровня и составляло 12,66 ± 3,78 % (р 0,05), а у животных, зараженных L. monocytogenes, сохранялось выше контрольного уровня до конца срока наблюдения. Процентное содержание нейтрофилов в перитонеальном экссудате при обеих инфекциях достоверно увеличивалось через 2 ч после заражения, достигая максимальных значений через 5 ч при псевдотуберкулезной (64 ± 6,55 %; р 0,02), и через 7 ч при листериозной инфекции (48,67 + 2,03 %; р 0,05) (контроль составил 18,1 ± 1,44 %). К концу срока наблюдения (19 ч) содержание нейтрофилов снижалось при обеих инфекциях, но не достигало контрольного уровня.
Таким образом, при заражении животных L. monocytogenes в крови на наблюдается приток нейтрофилов в период от 2 до 5 ч и повышенное содержание моноцитов на протяжении всего периода наблюдения, тогда как при заражении Y. pseudotuberculosis в крови наблюдается поздняя моноцитарная реакция к 7 ч и снижение количества нейтрофилов относительно контроля. В очаге воспаления содержание нейтрофилов и макрофагов было выше контрольного уровня на протяжении всего срока наблюдения, со сменой популяции клеток с макрофагов на нейтрофилы в ответ на заражение обоими видами бактерий.
Для оценки состояния кислородзависимой ферментной системы фагоцитирующих клеток морских свинок, инфицированных Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes, в этих клетках была исследована суммарная активность ферментов дыхательной цепи (НСТ-тест) и активность миелопероксидазы.
В лейкоцитах периферической крови морских свинок суммарная активность ферментов дыхательной цепи зависела от вида бактерий (рис. 16а). Так, в ответ на заражение Y. pseudotuberculosis для ферментов в НСТ-тесте в ранние сроки (0,5 ч) отмечалось значительное снижение индекса стимуляции относительно контроля до -45,12 ± 0,27 % (р 0,02), которое сохранялось до конца срока наблюдения. При инфицировании L. monocytogenes в течение 5 ч показатели НСТ-теста находились в пределах контроля и только к 7 ч повышались относительно контроля до 43,39 ± 2,06 % (р 0,05), составив к 19 ч 22,04 ± 0,91 % 0,05).
В лейкоцитах очага воспаления (перитонеальный экссудат) у животных, зараженных внутрибрюшинно Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes, выявлено достоверное повышение суммарной активности ферментов в НСТ-тесте (рис. 166). При псевдотуберкулезной инфекции показатели НСТ-теста повышались через 2 ч, индекс стимуляции достигал максимального значения - 126,78 ± 2,18 % (р 0,002) к 19 ч. В ответ на листериозную инфекцию резкое повышение данных показателей отмечалось в более ранние сроки (0,5 ч), а максимальное значение индекса стимуляции составило 97,33 ± 0,53 % (р 0,01) через 2 ч после заражения. До конца срока наблюдения при обеих инфекциях показатели НСТ-теста были значительно выше контрольных значений. В лейкоцитах периферической крови животных (рис. 17 а) в ответ на заражение Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes активность МПО повышалась через 0,5 ч инфекции до 53,47 ± 0,55 % (р 0,01) и 11,02 ± 0,42 % (р 0,05) соответственно.
