Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные взгляды на простейших 10
ГЛАВА 2. Основные представления о структурной организации клеточного ядра и хромосом простейших 36
2.1. Морфология, ультраструктура и молекулярная организация ядра 36
2.2. Хромосомы, хромосомные территории и хроматин 53
2.3. Ядерные гены и геномы 71
2.4. Митоз, мейоз и другие способы деления ядра 80
2.5. Эволюция митоза 104
ГЛАВА 3. Материал и методика 110
3.1. Происхождение культур простейших 110
3.2. Культивирование простейших 111
3.3. Светооптические исследования 112
3.4. Электронно-микроскопические исследования 113
3.5. Пульс-электрофорез хромосомных ДНК 115
3.6. Блоттинг ДНК хромосом и гибридизация 117
3.7. Определение содержания ДНК в клетках методом проточной цитометрии 117
3.8. Обработка текста, иллюстраций и трехмерная реконструкция серийных срезов с помощью компьютерных программ 119
ГЛАВА 4. Строение ядра и хромосомного аппарата кинетопластид 120
4.1. Общая характеристика кинетопластид 120
4.2. Структурная организация ядра в интерфазе 126
4.3. Структура хромосом в интерфазе 127
4.4. Деление ядра 131
4.4.1. История изучения и терминология 131
4.4.2. Митозу Trypanoplasma borreli 132
4.4.3. Митоз у Dimastigella mimosa и других свободноживущих бодонид 136
4.4.4. Митоз у Trypanosoma danilewskyi 140
4.4.5. Митоз у Crithidia sp., штамм С4 143
4.4.6. Митоз у Phytomonas sp., Endotrypanum monterogei и Leishmania tarentolae 144
4.4.7. Гипотеза "один кинетохор - одна слабоконденсирующаяся хромосома" 148
4.5. Электрофоретическое кариотипирование 150
4.5.1. Общие представления о пульс-электрофорезе 150
4.5.2. Хромосомные молекулы ДНК бодонид 153
4.5.3. Хромосомные молекулы ДНК трипаносоматид 155
4.6. Содержание ДНК в ядре, плоидность ядра, размер и пластичность генома 162
4.7. О несоответствиях, возникающих при определении числа слабоконденсирующихся хромосом кинетопластид, в процессе использования различных методов исследования 167
4.8. Ядерные структуры и организация хроматина в гигантских многоядерных клетках 169
4.9. Ядерные структуры и организация хроматина в цистах и цистоподобных клетках 176
4.10. Заключение 182
ГЛАВА 5. Строение ядра и структурная организация хромосомного аппарата микроспоридий 185
5.1. Общая характеристика микроспоридий 185
5.2. Ядро и хромосомы в интерфазе 186
5.3. Деление ядра 189
5.4. Электрофоретическое кариотипирование 191
5.5. Заключение 193
ГЛАВА 6. Строение ядра и структурная организация хромосомного аппарата entamoeba histolytica 197
(Ш 6.1. Общая характеристика энтамеб 197
6.2. Ядро и хромосомы в интерфазе 199
6.3. Деление ядра 202
6.4. Электрофоретическое кариотипирование, плоидность и содержание ДНК в ядре 204
6.5. Заключение 206
ГЛАВА 7. Слабоконденсирующиеся хромосомы как этап эволюции хромосомного аппарата одноклеточных Эукариот 209
Заключение 216
Выводы 221
Список литературы
- Хромосомы, хромосомные территории и хроматин
- Пульс-электрофорез хромосомных ДНК
- Митозу Trypanoplasma borreli
- Ядро и хромосомы в интерфазе
Введение к работе
Актуальность проблемы Изучение структурной организации индивидуальных хромосом и хромосомных комплексов эукариот - важнейшая проблема современной клеточной биологии. В течение последних 30 лет многие ее аспекты анализировались особенно интенсивно благодаря существенному расширению круга объектов и методов исследования (см например- Ченцов, Поляков, 1974, ЗбарекиЙ, 1988, Албертс и др , 1993, Родионов, 1999, Grif, 2000; Жимулев, 2002; Sumner, 2003) В ходе изучения этой проблемы произошло обособление целого спектра новых научных направлений Одно из них связано с изучением структурной организации и эволюции хромосом простейших и некоторых других протистов, которых традиционно исследуют лротозоологи (Райков, 1978, 1989; Raikov, 19Э2, 1994). Полагают, что среди именно этих организмов следует искать наиболее вероятных прямых потомков первичных ядрооодержащих форм К числу таких потомков в разное время относили динофлзгеллят, некоторых других жгутиконосцев, ряд групп амеб, микроспоридйй и др (Vickerman, 1998, Серавин, 2000, Cavalier-Smrth, 2002} Несмотря на сохраняющуюся неопределенность в вопросе об очередности происхождения современных таксонов этих низших эукариот существует убеждение, что именно у каких-то предков Protozoa около 2 млрд лет назад впервые структурно оформились протохромосомы и появился примитивный митоз
В прошлом столетии было показано, что все простейшие имеют хромосомы и характеризуются большим размахом изменчивости хромосомных чисел в гаплоидном наборе - от 2 до нескольких сотен Подтвержден закон постоянства числа хромосом в геноме по крайней мере для тех хромосом, которые несут гены "домашнего хозяйства" Однако морфологическая индивидуальность хромосом оказалась выраженной у относительно небольшого числа видов (Райков, 1978)
Среди современных простейших выделяются две большие и неоднородные группы различающиеся по степени конденсации хромосом Каждая из этих групп включает значительный набор таксонов разного уровня Хромосомы простейших первой группы остаются конденсированными на протяжении всего жизненного цикла организма Среди таких простейших наибольшую известность приобрели панцирные жгутиконосцы-динофлагелляты, а строению их хромосом и ядра в целом было придано существенное филогенетическое значение (см Райков, 1978) Еще 15-20 лет назад во многих руководствах, энциклопедических словарях и учебниках по биологии подробно освещалась гипотеза, согласно которой генетический аппарат ядра этих жгутиконосцев сохранил мезокариотный уровень организации, те уровень,
.її ,
} ' ,; '"
! <--
промежуточный между прокзриотным ("предъядерным") и эукариотным ("настоящим ядерным") В итоге сторонники этой гипотезы предлагали выделить бывший отряд Dinoflagelltfa в отдельное царство, надцарство или даже подымперию Однако дальнейшие исследования указали на вторичное упрощение этих одноклеточных в ходе эволюции.
Хромосомы простейших второй группы, наоборот, сохраняют слабую конденсацию на протяжении жизненного цикла При этом в митозе они часто не только не уплотняются, а, напротив, степень их конденсации становится меньше, чем в интерфазе Эти хромосомы не могут быть выявлены с применением обычного светового микроскопа, что значительно осложняет их изучение Для таких хромосом-"невидимок" простейших был предложен специальный термин "слабоконденсирующиеся хромосомы" (СХ) (Скарлато, 1997, 1999, 2000, Скарлато и др , 1998) Долгие годы идентификация и эффективные исследования СХ простейших были существенно затруднены или просто невозможны Оставалось неясным, насколько широко они представлены у этих ядросодержащих микроорганизмов, какие морфологические особенности СХ все же поддаются регистрации с помощью микроскопического анализа, в каких фазах жизненного цикла простейшего это сделать проще, и, наконец, каково "место" СХ в эволюции хромосомного аппарата эукариот Значительный прогресс в развитии методических приемов современного естествознания обеспечил новые подходы к выявлению и изучению СХ В течение последних десятилетий появилась возможность наряду с традиционными цитологическими методами исследования хромосом использовать новейшие методы клеточной и молекулярной биологии При этом важное значение приобрели как глубокие исследования СХ у модельных объектов, так и широкие сравнительные исследования этих хромосом у представителей различных систематических групп простейших а разных фазах жизненного цикла
Цель настоящей работы - изучить структурную организацию СХ и их комплексов у представителей различных систематических групп простейших и некоторых других ядросодержащих микроорганизмов, а также оценить вероятное "место" этих хромосом в эволюции генетического аппарата эукариот
Задачи исследования состояли в следующем
(1) на основе анализа литературы установить, у каких простейших хромосомы слабо
конденсируются в митозе и поэтому не могут быть идентифицированы как дискретные
структуры с помощью обычных методов световой и электронной микроскопии
(2) определить, представители каких таксонов могут служить подходящими
модельными объектами для исследования СХ,
с помощью современных методов изучить у этих объектов структурную организацию СХ в интерфазе и митозе,
выявить специфику структурной организации СХ в некоторых особых фазах жизненного цикла ряда паразитических простейших (например, в многоядерных и цистоподобкых клетках);
(5) охарактеризовать "место" СХ в эволюции хромосомной структуры простейших и
других эукариот
На зашиту выносятся следующие основные положения и результаты
ядерный геном некоторых простейших и других низших эукариот представлен не только в интерфазе, но и в митозе в виде СХ,
у многих простейших и других низших эукариот, для которых характерны СХ, такое состояние генетического аппарата является показателем его эволюционной примитивности,
(3) у некоторых видов паразитических простейших наличие СХ может быть не
результатом сохранения примитивной ("древней") структурной организации
генетической системы, но следствием упрощения хромосомной структуры в связи с
переходом к паразитизму (вторичный примитивизм)
Научная новизна Настоящее исследование структурной организации и эволюции СХ простейших - новое направление а области клеточной биологии эукариотных микроорганизмов В пределах современного царства Protozoa и у некоторых других Protista выявлены систематические группы, у представителей которых хромосомы слабо конденсируются в митозе Показано, что жгутиконосцы-кинетопластиды могут служить удобными модельными объектами для исследования СХ Впервые в сравнительном плане исследованы комплексы хромосом-"невидимок" у свобод ножи вущих и паразитических кинетопластид Представлены новые данные о числе, размерах, форме и нэднуклеосомнои организации СХ у этих важных в практическом отношении жгутиконосцев Морфологические и ультраструктурные данные соотнесены с оценкой содержания ДНК в ядре и плоидностью кинетопластид Впервые изучены механизмы, лежащие в основе сегрегации СХ в ходе митоза у паразитических бодонид Построены графические модели делящихся ядер кинетопластид Впервые исследованы СХ в многоядерных клетках этих простейших Изучена структурная организация СХ в разных фазах жизненного цикла у представителей других групп одноклеточных эукариот энтамеб и микроспоридий Впервые показано, что ядро трофоэоитов дизентерийной эмебы Entamoeba histolytica содержит более 50 мелких нитевидных хромосом, а не 5-6 относительно крупных хромосом, как считалось ранее Установлено, что мелкие СХ Є histolytica в разных
фазах клеточного цикла объединяются в более крупные бусовидные или лентовидные хроматиновые ассоциаты Последние формируют умеренно плотную кариосому в центральной области интерфазного ядра Впервые показано, что для хроматина микроспоридий характерен нуклеосомный уровень организации Однако нукпеосомы в составе нукпеосомной фибриллы этих организмов расположены менее упорядочение чем у большинства других эукариот Полученные данные свидетельствуют о том, что нуклеосомная организация хроматина закладывалась на ранних этапах эволюции низших эукариот Более высокие уровни организации хроматина появились позднее и претерпевали сходную эволюцию у различных ядросодержащих организмов Предложена гипотеза, согласно которой слабая конденсация хромосом является древним, филогенетически примитивным признаком организации генетического аппарата ядра низших эукариот Вместе с тем, предполагается, что у ряда видов паразитических простейших наличие СХ в митозе может быть следствием упрощения хромосомной организации в связи с переходом к паразитизму
Теоретическая и практическая ценность работы На большом фактическом материале показано, что структура хромосом и клеточного ядра в целом могут существенно различаться у низших и высших эукариот Полученные данные представляют собой важный шаг к пониманию структурной организации и эволюции хромосомных комплексов у ядросодержащих микроорганизмов СХ выявлены в жизненном цикле ряда видов простейших и других протистов, которые играют важную роль в экосистемах, имеют существенное хозяйственное значение и являются популярными объектами научных исследований Особый интерес представляют исследования СХ у кинетопластид, паразитических амеб и микроспоридий, среди которых имеются возбудители опасных заболеваний человека животных и растений Выявленные различия а организации хромосомных комплексов клеток хозяина и паразита могут послужити базой для создания новых антипротозойных препаратов
Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ленинградского отделения Всесоюзного общества протозоологов (197В и 1984 гг), VII Всесоюзном симпозиуме по структуре и функциям клеточного ядра (Харьков, 1980), заседании Болгарского зоологического общества {София, 1985), IV и V съездах Всесоюзного общества протозоологов (Ленинград 1987 Витебск, 1992), VIII и IX Международных конгрессах по протозоологии (Япония, Тсукуба 1989, Германия Берлин, 1993), Международном симпозиуме по трансмиссии хромосом и митозу (Ленинград, 1990), семинаре отдела паразитологии Ун-та г Сан-Паулу (Бразилия, Сан-Паулу, 1990), отчетной сессии Ин-та цитологии РАН (Ленинград 1991). XXXVII чтении памяти чп -корр АН СССР 8 А Догеля (Санкт-Петербург, 1992), I съезде Вавиловского
общества генетиков и селекционеров {Саратов, 1994), XI ХИ и XI» Всероссийских симпозиумах ло структуре и функциям клеточного ядра (Санкт-Петербург, 1993, 1996, 1999), коллоквиуме Ин-та водной экологии Университета г Росток (Германия, Росток, 2001); на заседании объединенного научного семинара лабораторий цитологии одноклеточных организмов морфологии клетки и клеточной патологии Ин-та цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2003)
Финансов а" поддержка работы была получена от Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 96-04-48107, 00-04-49502). Международного научного фонда (проекты R5G00O и R5G300), Чехословацкой академии наук (1983 г), Болгарской академии наук (1985-1996 гг) и Университета г Сан-Паулу (Бразилия) (1990 г) Кроме того, частичная финансовая поддержка была получена из фантов Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 93-04-21621. 96-03-4О046. 96-04-48124, 96-04-48578, 96-15-97670, 00-07-90287), Государственной научно-технической программы "Приоритетные направления генетики" (1992-1995 гг) и Меэкду на родной ассоциации по содействию сотрудничеству с учеными из новых независимых государств на территории бывшего Советского Союза (ИНТАС проект 99-4-1732)
Публикации По теме диссертации опубликована 51 работа (37 статей в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах, 1 статья в материалах Всесоюзного симпозиума, 1 статья в материалах Международной конференции, 11 тезисов и 1 автореферат)
Структура и объем диссертации Диссертация объемом "JWcrpaниц включает введение 7 глав, заключение, выводы, список литературы (740 названий), 1 таблицу и приложение, содержащее 143 рисунка
Хромосомы, хромосомные территории и хроматин
Для правильного понимания взглядов большинства исследователей того времени на положение "одноклеточных животных" в общей системе органического мира следует иметь ввиду, что эти взгляды формировались в рамках традиционного деления жизни на Земле на два царства, принятого со времен Аристотеля (IV в. до н.э.). По этой схеме признавалось существование царства растений (Vegetabilia, или Plantae) и царства животных (Animalia). К последнему протозоологи со времен Гольдфуса и Зибольда традиционно относили объекты своих исследований. При разделении царств преимущественно использовались эколого-физиологические характеристики, такие, как характер питания (автотрофный или гетеротрофный) и способность к движению (наличие, тип и число локомоторных структур: жгутиков, ресничек, псевдоподий). Именно в недрах двуцарственной системы зародилась концепция Protozoa Бючли и сформировалась протозоологическая тенденция в исследовании "одноклеточных животных" (Butschli, 1880-1889), сохраненная Международным комитетом по таксономии простейших (Honigberg et al., 1964). Одна из слабых сторон этой концепции заключалась в том, что при использовании предлагаемых критериев различения животных и растений некоторые группы одноклеточных фототрофных жгутиконосцев (эвгленовые, динофлагелляты, криптомонады и др.) могли быть в равной степени отнесены как к простейшим, так и к водорослям. Дело осложнялось еще и тем, что упомянутым выше группам жгутиконосцев протозоологи традиционно присваивали ранг отряда, а ботаники низших растений - ранг отдела, что приблизительно соответствует рангу типа или класса в системе Зоологической номенклатуры (см.: Кусакин, Дроздов, 1994; Corliss, 1998).
Эти и некоторые другие трудности первичной концепции Protozoa послужили толчком к ее пересмотру, а затем и к решительному отказу от двуцарственнои системы жизни. Первые попытки ревизии общей метасистемы живых организмов начались еще в XIX веке. Сначала в дополнение к двум царствам Plantae и Animalia предлагалось выделить все "низшие", главным образом, одноклеточные организмы в самостоятельное третье царство (Hogg, 1861; Haeckel, 1866). Для последнего было предложено несколько названий, однако в наши дни продолжают использоваться только два из них: PROTOCTISTA (Hogg, 1861) и PROTISTA (Haeckel, 1866). Более подробные сведения об истории развития мегасистематики живых организмов можно подчерпнуть в специальной литературе (Крылов и др., 1980; Воронцов, 1987; Карпов, 1990, 2000; Кусакин, Дроздов, 1994, 1998; Cavalier-Smith, 1993, 1998, 2002, и др.). Для нас же существенным является то, что начиная со второй половины позапрошлого века параллельно с концепцией Protozoa Бючли получает достаточно широкое распространение и концепция Protista (Protoctista) Геккеля (Хогга), в рамках которой также шло изучение простейших.
К сожалению, концепция Protista (Protoctista) имела не меньше трудностей, чем концепция Protozoa. В первую очередь они касались положения линий раздела царства протистов с царствами животных и растений. Теперь уже две границы, а не одна, как в случае двуцарственнои системы жизни, оказывались размытыми. Вторая сложность была связана с чрезвычайно большим объемом мегатаксона Protista (Protoctista), в котором оказывалось множество "низших", морфологически просто устроенных, филогенетически не родственных организмов. При такой классификации "типичные" простейшие оказывались в одном ансамбле с водорослями, грибоподобными существами, некоторыми настоящими грибами, многоклеточными животными, растениями и даже бактериями.
Следует отметить, что некоторые авторы иногда вместо протистов в третье царство выделяли грибы (Fungi, или Mycoida), другие же - к трем эукариотным царствам (Plantae, Animalia, Protoctista) добавляли четвертое царство прокариот - Monera (Mychota) (Copeland, 1938, 1956). В отечественной литературе важную роль в развитии мегасистематики сыграли работы академика-зоолога А.В. Иванова и академика-ботаника А.Л. Тахтаджяна. А.В. Иванов посвятил один из своих трудов (Иванов, 1968) изучению филогении низших беспозвоночных, в котором он обозначил три главные группы эукариотных организмов: Protozoa, Metazoa, Protophyta+Metaphyta. А.Л. Тахтаджяна (1973) предложил свою четырехцарственную систему, включавшую в свой состав следующие таксоны: Mychota, Animalia, Mycetalia (Fungi, Mycota) и Vegetabilia (Plantae). Важные идеи в области макросистематики простейших и протистов, а также мегасистематики в целом, были высказаны в ряде работ других ученых (Мережковский, 1909; Pascher, 1918; Мошковский, 1957; Whittaker, 1959, 1969; Догель и др., 1962, и др.). Их детальное рассмотрение не входит в круг задач настоящего исследования. Поэтому вкратце остановимся лишь на взглядах американского биолога Уиттэйкера (Whittaker, 1959, 1969), которые во многом повлияли на развитие и пропаганду концепции Protista (Protoctista). Этот ученый, вначале используя преимущественно трофические, а позднее и цитологические критерии, предложил выделять следующую пятицарственную систему органического мира: Monera (Bacteria), Protista, Plantae, Fungi, Animalia (Whittaker, 1969). Узловое место в его системе занимало царство Protista, поскольку другие эукариотные царства (Plantae, Fungi и в меньшей степени Animalia) были на схемах частично погружены в его толщу. Более того, между царствами грибов и животных граница была проведена лишь приблизительно. Эта система обращала внимание на единство всего органического мира, но одновременно допускала отнесение некоторых таксонов, в том числе ряда таксонов простейших, к нескольким царствам одновременно, что считается недопустимым для традиционной систематики. Несмотря на жесткую критику этой скорее функциональной, а не таксономической, системы некоторыми крупными специалистами (Одум, 1975; Кусакин, Дроздов, 1994), она в дальнейшем получила широкое распространение на Западе (Маргелис, 1983; Margulis, Schwartz, 1982, 1998; Margulis et al., 1990, 1993, и др.) и нашла видных последователей у нас в стране (Воронцов, 1965).
Таким образом, к началу последней трети XX века сложилось два частично перекрывающихся взгляда на простейших. В соответствии с первым взглядом, базирующимся на протозоологической тенденции (концепции Бючли), простейших рассматривали в качестве подцарства животных, к которому относили единственный тип Protozoa (см., например: Biitschli, 1880-1889; Догель, 1951; Dogiel, 1965; Honigberg et al., 1964; Grell, 1973, и др.). При этом в последний по молчаливому согласию большинства исследователей попадали некоторые группы фототрофных жгутиконосцев так называемого двойного "подчинения" - зоологического и ботанического. Второй взгляд, опирающийся на интегрированную протистологическую перспективу Хогга-Геккеля-Коупленда-Уиттэйкера, приводил к объединению простейших с водорослями, грибоподобными и некоторыми другими организмами в громоздкое, явно полифилетическое и трудно определяемое царство Protista (Protoctista) (Copeland, 1938; Whittaker, 1959, 1969; Маргелис, 1983; Margulis, Schwartz, 1982, Corliss, 1984, и др.). Оба концептуальных взляда имели серьезные недостатки, главная причина которых заключалась в использованных критериях для выделения таксонов высокого ранга. Как уже отмечалось выше, большинство простейших и протистов характеризуется бедностью внешних морфологических признаков, которые возможно регистрировать с помощью световой микроскопии. Поэтому при выделении крупных таксонов приходилось придавать излишне большое значение экологическим и физиологическим признакам. В результате, как справедливо отмечали многие ученые (Карпов, 1990; Кусакин, Дроздов, 1994; Corliss, 1998; Vickerman, 1998, и др.), как таксон Protozoa, так и в еще большей степени таксон Protista (Protoctista) оказывались в значительной степени искусственными конгломератами в чем-то сходных жизненных форм, а не систематическими образованиями, включающими филогенетически родственные формы. Нельзя сказать, что этого обстоятельства не замечали современники. Однако улучшение обеих концепций оказалось возможным только после получения новых данных, которые стали быстро накапливаться в ходе методической революции в биологии конца XX века.
Пульс-электрофорез хромосомных ДНК
Ранее было показано, что у Trypanosoma brucei после переваривания изолированных ядер микрококковой нуклеазой большая часть хроматиновых фрагментов (хроматосом) имеет размер 150 п.н. (Hecker et al., 1989). С учетом же относительно длинного ДНК-линкера, обнаруженного у критидий (107 п.н., см. выше), можно предположить, что величина нуклеосомного повтора этих жгутиконосцев составляет около 250 п.н.
Сохранившиеся на препарате диспергированного в течение 10 мин хроматина Crithidia фибриллы толщиной 20 нм местами разъединяются на две нуклеосомные фибриллы (рис. 17). Создается впечатление, что эти хроматиновые фибриллы состоят из двух сцепленных или закрученных относительно друг друга нуклеосомных фибрилл. Кроме того, на фибриллах толщиной 20 нм иногда образуются одиночные утолщения диаметром около 40-50 нм (рис. 17). Эти утолщения не имеют розетковидного строения, как это имеет место у многих других эукариот, и, по нашему мнению, возникают в результате локального перекручивания хроматиновых фибрилл в процессе приготовления препаратов.
Нередко среди масс диспергированного хроматина выявляются отдельные петли, образованные хроматиновыми фибриллами (рис. 18). Контурная длина таких петель варьирует от 767 до 2230 нм. Часто с петлями хроматиновых фибрилл связаны небольшие скопления электронноплотного материала, природа которых неизвестна. Можно предположить, что скопления этого материала представляют собой фрагменты ядерного матрикса или ламины (рис. 19).
При обработке ядер раствором низкой ионной силы дольше 15 мин ядерные структуры разрушаются (рис. 20). В этом случае хроматин представлен только нуклеосомными филаментами, причем большая часть из них распрямляется, приобретает однообразный вид "бусин на нитке", и(или) распадается на отдельные нуклеосомные частицы (рис. 20).
Интересно, что в растворах низкой ионной силы декомпактизация кинетопласта происходит медленнее, чем декомпактизация хроматина (Бобылева, Скарлато, 2002). Так, при продолжительности дисперсии 6 мин кинетопласт еще остается плотной органеллой, и на препаратах, приготовленных по Миллеру, в нем не различаются внутренние структурные элементы (рис. 21). Последние начинают выявляться только при сроках дисперсии 10-13 мин (рис. 22). При этом на электронограммах кинетопласт предстает в виде крупноячеистой сети, расположенной в связи с базальным телом жгутика. Дальнейшие исследования показали, что для отчетливого выявления кинетопластных кольцевых структур необходима продолжительность дисперсии не менее 15 мин (Скарлато, Бобылева, 2002). Однако даже при дисперсии 60 мин полного распада кинетопластной сети кольцевых кпДНК на отдельные кольца не происходит (рис. 23).
Таким образом, результаты исследований, проведенные в настоящей работе, позволили выявить в ядрах кинетопластид нуклеосомные фибриллы толщиной около 10 нм и хроматиновые фибриллы толщиной около 20 (изредка 25 нм). По-видимому, в интерфазном ядре кинетопластид именно эти фибриллы являются основными структурными единицами неактивного хроматина. При этом 20-нм фибрилла, вероятно, состоит из двух взаимозакрученных нуклеосомных фибрилл. Хроматиновые фибриллы кинетопластид образуют топологически обособленные петли, прикрепляющиеся как к ядерному матриксу, так и к ядерной ламине. Однако механизм компактизации (упаковки) хроматина более высоких уровней у этих жгутиконосцев, очевидно, отличается от известного у высших эукариот.
Интерфазный хроматин кинетопластид находится в слабоконденсированном состоянии и в растворах низкой ионной силы быстро декомпактизуется до нуклеосомных фибрилл. Для этих целей достаточно всего 5-10 мин дисперсии, в то время как для удовлетворительной декомпактизации ассоциата кпДНК требуется обработка
в аналогичных растворах в течение как минимум 13-15 мин. Отсюда следует, что у критидий генетический материал в ядре упакован менее прочно, чем генетический материал в кинетопласте. Этот вывод необходимо учитывать при проведении многих медико-биологических экспериментов, в частности, при подборе эффективных трипаноцидных препаратов, когда необходимо добиваться строго избирательной инактивации генетического материала ядра и цитоплазмы клеток паразита, но не генетического материала клеток хозяина (Скарлато, Бобылева, 2002).
В интерфазе кинетопластид индивидуальные хромосомы ни на ультратонких срезах (рис. 6-15), ни на препаратах диспергированного хроматина (рис. 16-19) не идентифицируются. При этом хромомероподобные структуры умеренной плотности нередко выявляются на срезах по периферии ядра, однако эти структуры не обнаруживаются на препаратах диспергированного хроматина даже при очень кратковременных обработках материала в растворах низкой ионной силы (менее 5 мин). Отметим, что кинетопластиды - не единственные паразитические протисты, у которых на препаратах диспергированного хроматина не выявляются наднуклеосомные структуры высокого уровня упаковки типа глыбок или хромомеров. Аналогичные наблюдения были сделаны при изучении интерфазных ядер микроспоридии Nosema grylli (см. ниже) и дизентерийной амебы Entamoeba histolytica (Демин и др., 2001; Skarlato et al., 2001). По-видимому, эта особенность структурной организации хроматина некоторых паразитических протистов может рассматриваться либо как филогенетически древняя, примитивная черта в их строении, либо как специфическая адаптация к паразитическому образу жизни (Скарлато, 2000; Демин и др., 2001).
Получили подтверждение наши предварительные данные о структурной гетерогенности нуклеосомных фибрилл кинетопластид (Бобылева, Скарлато, 1994, 1997). Гетерогенность выражается в различной длине линкерных участков и неоднородном положении нуклеосомных частиц на фибрилле. С этими наблюдениями хорошо согласуются данные о специфике биохимического состава гистонов кинетопластид, в первую очередь, о содержании у них линкерного Н1-подобного белка (Duschak, Cazzulo, 1990; Hecker et al., 1995; Espinoza et al., 1996, и др.). Показано, что этот гистон содержится в ядрах жгутиконосцев в незначительном количестве и по ряду характеристик отличается от линкерного гистона высших эукариот. Специального внимания заслуживает предположение о том, что ведущая роль в процессе компактизации хроматина трипаносоматид принадлежит коровым гистонам (Bender et al., 1992). Вместе с тем, в структурной организации интерфазного хроматина кинетопластид отмечены и черты, типичные для хроматина высших эукариот. Таково, например, формирование хроматиновыми фибриллами петлевидных структур, закрепленных в ядерном матриксе и на ламине (Бобылева, Скарлато, 1994, 1997). Таким образом, в настоящее время до полной ясности в отношении способа упаковки генетической информации в ядре кинетопластид еще далеко, однако уже сейчас можно с уверенностью сказать, что эти жгутиконосцы становятся перспективными модельными объектами для изучения структурной организации слабоконденсированного хроматина низших эукариот.
Митозу Trypanoplasma borreli
Entamoeba histolytica (рис. 131) - возбудитель амебиаза (амебной дизентерии) человека и некоторых видов млекопитающих животных (Авакян, 1975; Гинецинская, Добровольский, 1978; McLaughlin, Aley, 1985; Крылов, 1994; Сопина, 1997,1998; Смирнов, Гудков, 2000, и др.). По самым скромным оценкам этим паразитом заражено более 500 млн. человек, главным образом, в районах Земного шара с теплым и жарким климатом, причем от 50 до 100 тыс. из них ежегодно погибают (Walsh, 1986).
Вид Е. histolytica относится к сем. Entamoebidae, систематическое положение которого до конца не ясно, как, впрочем, и систематическое положение многих других групп амебоидных паразитов человека и животных (Крылов, 1994; Сопина, 1997,1998; Смирнов, Гудков, 2000). В настоящее время энтамеб обычно относят к типу Rhizopoda, классу Lobosea, подклассу Gymnamoebia и отряду Euamoebida (Сопина, 1997,1998; Смирнов, Гудков, 2000).
В жизненном цикле Е. histolytica выделяют фазы вегетативного трофозоита (рис. 131) и цисты с одной, реже двумя оболочками. Прижизненные наблюдения трофозоитов Е. histolytica из штамма А, проведенные в ходе выполнения настоящей работы (Демин, Скарлато и др., 2001; Skarlato et а!., 2001), показывают, что цитоплазма паразита четко подразделяется на оптически прозрачную эктоплазму (гиалоплазму) толщиной около 1 мкм и эндоплазму (гранулоплазму), содержащую ядро, органеллы, вакуоли и различные включения (рис. 131). Подвижные трофозоиты обычно имеют вытянутую форму и одну широкую псевдоподию (лобоподию), с помощью которой перемещаются по субстрату (рис. 131). В ряде случаев длина таких клеток Е. histolytica может превышать 30 мкм (Демин, Скарлато и др., 2001).
Е. histolytica является агамным организмом, клетки которого имеют необычную ультраструктурную организацию и размножаются простым делением (Авакян, 1975; McLaughlin, Aley, 1985; Сопина, 1997). В цитоплазме простейшего выявляются рибосомы, многослойные мембранные структуры, различные вакуоли и пузырьки. Вместе с тем, у паразита не обнаруживаются митохондрии, гидрогеносомы, пероксисомы, сократительная вакуоль, шероховатый эндоплазматический ретикулум, а также морфологически выраженный аппарат Гольджи. В 80-х - начале 90-х годов прошлого века некоторые исследователи полагали, что эти важнейшие органеллы отсутствуют в клетках энтамеб первично, на основании чего паразитов отнесли к царству Archezoa (Cavalier-Smith, 1983). Однако позднее энтамебы были выведены из состава этого древнего гипотетического царства, поскольку в их клетках были обнаружены структуры, напоминающие диктиосомы, а результаты сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей рДНК свидетельствовали в пользу не слишком раннего "ответвления" энтамеб на филогенетическом древе эукариот (Cavalier-Smith, 1991, 1993; Sogin, 1991). Тем не менее, отсутствие митохондрий позволяло долгие годы рассматривать Entamoeba в качестве одной из реликтовых моделей первичной эукариотной клетки (Bakker-Grunwald, Wostmann, 1993). Лишь относительно недавно были получены убедительные доказательства того, что энтамебы потеряли митохондрии вторично под влиянием паразитизма в анаэробной среде кишечника. В ядре Е. histolytica были обнаружены гены, которые когда-то в прошлом кодировали митохондриальный белок српбО (Clark, Roger, 1995). Эти данные действительно подтвердили факт происхождения энтамеб от предка, обладавшего митохондриями. Однако они еще не доказывают относительно позднего происхождения этого простейшего по сравнению с другими ядросодержащими эукариотами (Clark et al., 1998). На древнее происхождение энтамеб указывают многие признаки, например, результаты анализа нуклеотидного состава тубулиновых и актиновых генов, а также отсутствие интронов в этих и некоторых других кодирующих последовательностях ДНК (Meza, 1992; Clark et al., 1998). Об этом же свидетельствуют особенности структурной организации ядерного аппарата этого простейшего в митозе (см. ниже). Поэтому неудивительно, что и в настоящее время подавляющее большинство ведущих исследователей этих организмов признает происхождение энтамеб от предка с митохондрией, но соглашается с тем, что вопрос о положении этих простейших на эволюционном древе эукариот остается предметом дискуссии и требует дальнейших исследований (Clark et al., 1998). Таким образом, предпринятое в настоящей работе исследование загадочного ядра и хромосомного комплекса Е. histolytica представляет собой не только чисто кариологический, но также и филогенетический и прикладной интерес.
Трофозоит Е. histolytica обычно содержит одно ядро диаметром 4-8 мкм, а циста - от одного до четырех ядер диаметром 2,5-4 мкм (Авакян, 1975; Albach, 1989). Ранее эти ядра относили к пузырьковидным (Райков, 1978; Raikov, 1982), в настоящее время - чаще к овулярным (Сопина, 1997). По данным электронной микроскопии ядерная оболочка имеет типичное строение и содержит поры диаметром 60-80 нм (Rosenbaum, Wittner, 1970; Авакян, 1975; Gonzalez-Robles, Martinez-Palomo, 1992). Ядерная ламина в виде так называемого сотового слоя у Е. histolytica отсутствует. Приблизительно в середине ядра располагается умеренно плотная Фельген-положительная кариосома (Гордеева, Соловьев, 1967), а вблизи ядерной оболочки отмечается присутствие так называемого "периферического хроматина" (Rosenbaum, Wittner, 1970; Авакян, 1975; Чернов и др., 1984). Типичные ядрышки у энтамеб не обнаруживаются. Однако их структурные и функциональные элементы были найдены в слое "периферического хроматина" с помощью цитохимических и авторадиографических методов (Albach et al., 1980; Albach, 1989), а также гибридизации in situ и флуоресцентной детекции метки (Willhoeft, Tannich, 2000). В кариоплазме отмечены внутриядерные пузырьки и включения (Miller et al., 1961; Авакян, 1975; Чернов и др., 1984, 1988; Meza, 1992).
Неактивный хроматин Е. histolytica в основном организован в виде цепочек нуклеосомных частиц диаметром около 10 нм. Однако в составе многих из этих нуклеосомных фибрилл было отмечено существенное варьирование длины линкерной ДНК, а в ряде случаев - полное отсутствие нуклеосом на ее протяженных участках (Torres-Guerrero et al., 1991; Fodinger et al., 1992; Meza, 1992; Bender, Mirelman, 1995). В составе хроматина E. histolytica были обнаружены белки, имеющие сходство с гистонами высших эукариот по электрофоретической подвижности, иммунологическим свойствам и характеру связывания с хромосомными молекулами ДНК (Fodinger et al., 1992; Meza, 1992; Bender, Mirelman, 1995). Вместе с тем были отмечены и существенные отличия. Преимущественно они касались биохимических свойств Н1-подобного гистона. Кроме того, была отмечена повышенная чувствительность хроматина к нуклеазам, что некоторыми исследователями рассматривается в качестве примитивной черты в структурной организации хроматина Е. histolytica (Meza, 1992).
До самого последнего времени оставался нерешенным вопрос о числе, структурной организации и пространственной локализации хромосом в интерфазных и делящихся ядрах Е. histolytica, несмотря на интенсивные кариологические исследования на протяжении всего XX века. В связи с этим в настоящей работе было предпринято переисследование хромосомного аппарата трофозоитов энтамеб с помощью современных светооптических методов (рис. 132, 135-142) и электронной микроскопии (рис. 133, 134) (Демин, Скарлато и др., 2001; Skarlato et al., 2001). Специальное внимание было уделено изучению хромосомоподобных тел в ядрах живых распластанных клеток и в растянутых на предметных стеклах безмембранных ядрах Е. histolytica, приготовленных по методу Демина (1997, 1999).
Ядро и хромосомы в интерфазе
Полагают, что в соответствии с этим или близким сценарием приблизительно 1,5-2 млрд. лет назад возникли первые эукариоты от предъядерных одноклеточных организмов, которые были анаэробами (Cavalier-Smith, 2002). Последние смогли выжить и широко распространиться на Земле в условиях накопления молекулярного кислорода за счет симбиоза с более мелкими аэробными бактериями, которые в конце концов преобразовались в митохондрии современного типа (Маргелис, 1983; см. однако: Серавин, 1986г). Таким образом, наряду с ядерным компартментом в цитоплазме протоэукариот формировались и(или) приобретались симбиотическим путем (например, митохондрии, хлоропласты) новые компартменты, окруженные одной, двумя, реже большим числом мембран, которые во многом отличались по своим структурным и химическим свойствам от плазматической мембраны и мембран ядерной оболочки. Вскоре на цитоплазматических мембранах сконцентрировались молекулярные комплексы, осуществляющие метаболические реакции, которые обеспечивают основные функции клеток.
Компартментализация цитоплазмы современных ядросодержащих клеток на множество мембранных органелл была замечена уже на заре "электронно-микроскопической" эры развития биологии, что впоследствии позволило сформулировать единую концепцию структурной и "функциональной" компартментализации эукариотной клетки (см.: Патрушев, 2000). В полной мере она может быть приложима и к простейшим. Более того, именно широкие электронномикроскопические исследования простейших на протяжении последних 30 лет позволили проверить многие гипотезы, выдвинутые в ходе формирования этой концепции, и создать прочный фактический и теоретический фундамент для ее распространения на клетки других эукариот.
Внутри ядра, в котором сосредоточена основная часть генома эукариотной клетки, также проходил процесс обособления структурированных отделов, называемых в современной биологической литературе доменами (областями), субдоменами и территориями. В некоторых работах внутриядерные структуры высших эукариот иногда также называют ядерными субкомпартментами (см. например: Lamond, Earnshaw, 1998), что на наш взгляд не совсем точно. Дело в том, что понятие "компартмент" или "субкомпартмент" подразумевает существование у соответствующего отдела клетки границ, образованных мембранами. Таким образом, само ядро, окруженное двумя мембранами и сопутствующими структурными элементами, несомненно, является компартментом, причем важнейшим и самыми сложным компартментом эукариотной клетки. Однако внутренние структуры и отделы ядра за очень редкими исключениями (см.: Skarlato, Lorn, 1997) лишены мембранного обрамления и, строго говоря, не могут быть названы субкомпартментами. Более удачным термином для обозначения относительно обособленных отделов внутри ядра является "ядерный домен", или "ядерная область" (Spector, 2001). В свою очередь эти домены (области) могут быть подразделены на структурные и "функциональные" субдомены (субобласти). Как уже отмечалось выше, для обозначения хромосомных доменов обычно используют термин "хромосомная территория".
Все вышесказанное позволяет предположить, что в ходе эволюции оформленное ядро и хромосомы образовались в результате сложных процессов компартментализации и доменизации, протекавших в клетках предков современных эукариот. Теоретически среди современных протистов могли сохраниться и такие клетки-организмы, которые рекапитулируют анцестральные признаки в структурной организации своего ядерного аппарата. К их числу в первую очередь могли бы быть отнесены простейшие, поскольку именно у них наиболее ярко выражены многие другие адаптации, имевшие ведущее значение на заре формирования эукариотного состояния, как то: способность к фагоцитозу, активному движению для поиска пищи, внутриклеточному симбиозу. Благодаря этим и некоторым другим адаптациям они смогли успешно использовать ресурсы окружающей среды, ранее недоступные прокариотам, что способствовало их выживанию и размножению в неблагоприятных условиях. Особый интерес представляют те группы простейших, в ядрах которых содержится незначительное количество молекул ДНК, и при этом они упакованы в морфологически просто устроенные слабоконденсированные хромосомы, содержащие небольшое число мало дифференцированных структурных и функциональных субдоменов.
Простейшие с маленькими геномами могут иметь и весьма просто устроенные ахроматиновые аппараты для сегрегации генетической информации в дочерние ядра в ходе деления клеток. По существу такие ныне живущие простейшие являются элементарными живыми клетками и представляют собой минимально возможные эукариотные организмы, которые могли бы отдаленно напоминать первых эукариот на Земле.
Также обращает на себя внимание тот факт, что СХ выявлены преимущественно у паразитических простейших. Отчасти это можно объяснить тем, что к началу XXI в. первостепенное значение приобрели исследования именно паразитических простейших, имеющих большое практическое значение. При исследовании именно таких простейших были в первую очередь использованы современные методы клеточной и молекулярной биологии, которые позволили выявить и изучить СХ. Несомненно, СХ имеются и у свободноживущих простейших. Об этом, в частности, свидетельствуют результаты исследования СХ у свободноживущих кинетопластид (бодонид), которые были получены именно в последние годы. К сожалению, до сих пор отсутствуют сведения о числе, размерах, морфологии, ультраструктуре и некоторых других основных признаках хромосом большинства других известных видов свободноживущих простейших. В настоящее время этот пробел постепенно заполняется. Таким образом, есть все основания ожидать, что по мере роста объема наших знаний о живой природе число видов эукариотных микроорганизмов, у которых будут обнаружены СХ, будет неуклонно возрастать, и место устаревшей мезокариотной гипотезы происхождения эукариот будет занято новой гипотезой - гипотезой происхождения эукариот от предков со слабоконденсированными протохромосомами.
![Активность ядрышкообразующих районов хромосом в популяции жителей Курской обл. [Электронный ресурс]](/i/i/4366/192794.png "Активность ядрышкообразующих районов хромосом в популяции жителей Курской обл. [Электронный ресурс] Амелина Ирина Валерьевна")
