Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. История изучения репаративного остеогенеза 10
2.2. Методы стимуляции репаративного остеогенеза 13
2.3. Культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток 32
2.4. Культивирование хондробластов 36
3. Материалы и методы исследования 41
3.1. Получение культуры пренатальных мультипотентных мезенхимальных клеток стромы костного мозга 41
3.2. Получение культуры пренатальных хондробластов 42
3.3. Методики характеристики фенотипа полученных культур клеток 44
3.4. Экспериментальное исследование 47
4. Результаты исследования 55
4.1. Характеристика фенотипа полученных культур клеток 55
4.1.1. Культура мультипотентных мезенхимальных клеток стромы костного мозга 55
4.1.2. Культура хондробластов 57
4.2. Результаты экспериментального исследования 63
4.2.1. Десятые сутки наблюдения 63
4.2.2. Тридцатые сутки наблюдения 79
4.2.3. Шестидесятые сутки наблюдения 94
4.2.4. Девяностые сутки наблюдения 109
Заключение 123
Выводы 133
Литература 135
- Культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток
- Получение культуры пренатальных хондробластов
- Методики характеристики фенотипа полученных культур клеток
- Культура мультипотентных мезенхимальных клеток стромы костного мозга
Введение к работе
1.1. Актуальность темы
Современные травмы опорно-двигательного аппарата, различные дегенеративные заболевания костной и хрящевой тканей нередко характеризуются большой тяжестью. Растущая распространенность заболеваний, ранняя трудовая и бытовая инвалидизация свидетельствуют об отсутствии эффективных средств медикаментозного или хирургического лечения [3, 8]. Несмотря на то, что костная ткань обладает высокой восстановительной способностью, в ряде случаев репаративный процесс в костной ткани даже при использовании различных остеопластических и остеоиндуктивных материалов не заканчивается восстановлением ее структуры и функции. Подобные состояния, обусловленные разрушением или несостоятельностью камбиальных клеточных элементов костной ткани, можно охарактеризовать как "остеогенную недостаточность" [8].
Регенерация кости - сложный многоступенчатый процесс, составляющими которого являются миграция, пролиферация, дифференцировка различных клеточных популяций мезенхимального происхождения. Регенерация костной ткани и развитие кости в эмбриогенезе протекают с участием незрелых клеток мезенхимы, которые сохраняются в так называемых стволовых нишах периоста, эндоста и костного мозга [55, 138, 173].
Учитывая недостаточность функционально ' активных
предшественников остеобластов, при лечении обширных травм и дегенеративных заболеваний кости особое значение приобретают методы, связанные с трансплантацией собственных или аллогенных клеток-предшественников. В связи с развитием клеточной биологии стало возможным в лабораторных условиях получать культуры
стволовых/прогениторных клеток и трансплантировать их с целью стимуляции регенерации костной и хрящевой тканей.
Можно выделить три популяции самообновляющихся клеток, которые обладают высоким пролиферативным потенциалом и обусловливают рост и перестройку костной ткани [173, 181, 222]. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) [17, 126], остеобласты (ОБ) [74] и хондробласты (ХБ) [20, 118] благодаря их высокой пролиферативной активности, могут быть успешно получены, размножены в культуре и использованы для стимуляции регенерации при различных заболеваниях костной и хрящевой тканей.
Разработка методов селективного выращивания стволовых и прогениторных клеток костного мозга, хряща и периостиума привела к ощутимому прогрессу фундаментальных исследований в области механизмов регенерации костной и хрящевой ткани in vitro и in situ. Однако современная реконструктивная хирургия пока не имеет надежных клеточных технологий, которые бы обеспечивали стимуляцию направленной регенерации кости и хряща. Несмотря на большое количество экспериментальных исследований на животных с использованием ММСК, хондро- и остеопрогениторных клеток, предпочтительная стратегия подготовки клеточного трансплантата для репаративного остеогенеза и хондрогенеза не сформулирована, поскольку существует несколько лабораторных путей репаративного гистогенеза кости как из прикрепленных к различным носителям клеток, так и суспензионной культуры [14, 70, 145]. Большинство исследований в этой области посвящены изучению репаративного остеогенеза при трансплантации ау то логичных остеогенных клеток с использованием трехмерных конструкций из различных остеопластических материалов [32, 47, 116, 143]. Эти материалы обладают выраженной остеоиндуктивной активностью, являясь компонентами органического или неорганического матрикса кости и/или сорбируя на своей поверхности факторы роста и регенерации костной ткани [60, 80, 130, 217]. Однако плохо изученным
остается вопрос о стимуляции регенерации кости и ее механизмах при введении только клеток предшественников без дополнительного действия остеопластических материалов. Причиной этого, по всей видимости, является отсутствие адекватной экспериментальной модели повреждения кости, которая позволила бы эффективно апплицировать и иммобилизовать суспензионный клеточный трансплантат.
Современные методы селективного культивирования ММСК и ХБ
позволяют эффективно избавляться от примеси предшественников
иммунокомпетентных клеток, несущих антигены главного комплекса
совместимости II класса, что позволяет избежать развития реакции
«трансплантат против хозяина». В ряде работ и нашем исследовании было
показано, что при длительном культивировании существенно снижается
уровень экспрессии HLA I [135]. Кроме того, в настоящее время широко
изучается иммуномодулирущий эффект ММСК, который проявляется
ингибирующим действием на пролиферацию Т-лимфоцитов при
сокультивировании и супрессией Т-клеточного ответа при реакции
смешанных лимфоцитов [102, 123, 136], экспрессией и синтезом различных
противовоспалительных и иммуномодулирующих цитокинов, факторов роста
(TGF, HGF, IL-3 и др.) [78, 122]. Трансплантация даже аллогеных МСК
пролонгирует выживаемость ксено- и аллографтов. Безопасность и
эффективность применения аллогенных и ксеногенных
стволовых/прогениторных клеток для регенерации костной ткани и необходимость проведения иммуносупрессивной терапии требует дальнейшего изучения.
В свете приведенных положений разрабатываемая нами проблема является актуальной и представляет не только теоретическое, но и практическое значение, что определяет тему данного экспериментального исследования.
1.2. Цель исследования
Изучить влияние трансплантации пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток . и хондробластов человека на репаративный остеогенез трубчатых костей крыс в эксперименте.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Получить культуры пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и хондробластов гиалинового хряща человека, охарактеризовать фенотип полученных культур.
Разработать экспериментальную модель повреждения бедренной кости для введения суспензионного трансплантата мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов.
Оценить влияние суспензии мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов при ксенотрансплантации на скорость и качество регенерации костной ткани диафиза бедра крысы.
Изучить особенности репаративного остеогенеза на противоположной конечности при односторонней трансплантации клеток.
5. Провести сравнительную оценку репаративного потенциала
обоих типов клеток.
1.3. Научная новизна
Данная работа является первым экспериментальным исследованием, в котором проводится оценка стимуляции регенерации костной ткани при ксенотрансплантации суспензионного клеточного трансплантата мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов человека на модели повреждения бедренной кости у крыс. Кроме того, исследован системный (дистантный) эффект стимуляции регенерации кости на противоположной конечности при односторонней трансплантации клеток.
В ходе исследования разработана модель экспериментального повреждения кости для оценки влияния суспензии мультипотентных
мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов на эндоостальный и костномозговой остеогенез.
Установлено, что костная ткань, образующаяся при трансплантации ММСК и ХБ, встраивается в костный орган и подвергается полноценному ремоделированию, что приводит к восстановлению целостности органа.
Впервые было проведено сравнительное исследование репаративного потенциала двух типов клеток: мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов.
Показано, что ксенотрансплантация пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов без проведения иммуносупрессии не вызывает осложнений и местных реакций отторжения трансплантата.
1.4 Научно-практическая значимость
Анализ полученных экспериментальных результатов позволяет разработать и внедрить в клиническую практику метод стимуляции регенерации дефекта костной ткани путем трансплантации пренатальных ММСК и ХБ, используя их выраженную остеогенную активность in situ и возможность крупномасштабного получения культур этих клеток.
1.5. Положения, выносимые на защиту
Трансплантация ксеногенных пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов обеспечивает стимуляцию регенерации костной ткани, при этом образованная костная ткань встраивается в костный орган, подвергается ремоделированию и морфологически не отличается от окружающей кости.
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки обладают более выраженным остеорепаративным потенциалом, чем хондробласты.
При локальном одностороннем введении клеточного трансплантата имеет место системный эффект стимуляции регенерации кости.
1.6. Апробация работы
Основные положения работы доложены на: II Московском международном конгрессе «Биотехнология и медицина» (2003 г., Москва); XXXI Annual ESAO congress (2004 г, Варшава); Московской научной конференции «Клиническая трансплантация органов» (2005 г., Москва); II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (2005 г., Москва); Межлабораторной научной конференции в НИИ морфологии человека РАМН (2006 г., Москва); Научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (2006 г., Москва).
1.7. Публикации
По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 3 в центральной печати, получен 1 патент.
1.8. Объем и структура работы
диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Литературный указатель включает в себя 226 источников, из них 32 - отечественных, 194 - иностранных. Работа иллюстрирована 60 фотографиями, 35 таблицами.
Культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток
По современным представлениям, мезенхимальные стволовые клетки, МСК, (современное название этих клеток - мультипотентная мезенхимальная стромальная клетка, ММСК [106]) представляют собой популяцию клеток, присутствующую в тканях взрослого организма и способные дифференцироваться в клетки мезенхимальной линии (Pittenger М. ) [170]. Они могут быть изолированы, размножены в культуре и охарактеризованы in vitro. ММСК способны поддерживать гемопоэтические стволовые клетки или эмбриональные стволовые клетки в культуре. ММСК в культуре спонтанно или, будучи индуцированы, способны продуцировать цитокины, обеспечивающие поддержку (стромальную функцию) гемопоэтических клеток [65, 146], что свидетельствует о наличии у них стромальной функции. Сокультивирование ММСК с гемопоэтическими клетками подтверждает это предположение - ММСК способна не только поддерживать существование клеток гемопоэтического ряда в культуре, но и способствовать их экспансии [205]. ММСК с равнозначными потенциями были выделены из различных тканей мезенхимального происхождения как человека, так и животных. Впервые термин «мезенхимальная стволовая клетка» был предложен Арнольдом Капланом в 1991 году [56]. Однако этот термин не был взят на вооружение всеми исследователями. Так, А. Я. Фриденштейн и соавторы, которые впервые получили культуру этих клеток [85], использовали «термин остеогенные прекурсорные клетки», ими же был предложен и термин «колониеобразующие единицы фибробластов» [84]. Также используются термины «стромальные клетки костного мозга» [172], «взрослые мультипотентные прогениторные клетки» [180].
После открытия; субпопуляций MGK были введены термины «рециркулирующие стволовые клетки (RS1,2)» и «зрелые MGK (mMSG)» [67]. Научной группой А. Я. Фриденштейна в 1966-76 годах из костного мозга была выделена популяция клеток, способных к остеогенезу [83, 85, 88, 89]. В результате были выделены в культуре и охарактеризованы «колониеобразующие единицы фибробластов» (КОЕ-ф), обнаруженные в костном мозге морских свинок. Эти клетки были способны к пролиферации и могли быть дифференцированы в остеогенном направлении. Помещенные в диффузные камеры и имплантированные внутрибрюшинно, они давали развитие костной ткани; что было подтверждено гистологически при проведении целой серии экспериментов; Эти клетки были названы-остеогеннымипрекурсорными клетками из-за способности к остеогенезу. В 1980 году Gastro-Malaspina [61] впервые изолировал КОЕ-ф из красного костного мозга человека и охарактеризовал их in vitro. Выделенные: ... клетки не экспрессировали VII фактор, коллаген базальной мембраны:, факторы роста, поддерживающие рост и. созревание гранулоцитов и макрофагов, что отличало их от эндотелиальных клеток. Их характеристики во многом сходны с таковыми у КОЕ-ф полученных из костного мозга морских свинок и кроликов: Однако на тот период не был исследован их дифференцировочный потенциал. Методика культивирования ММСК прошла довольно длительный путь развития и окончательно ещё не установилась. Одной из основных особенностей ММСК in vitro является их способность к колониеобразованию при выращивании в низкой плотности [36, 85]. При культивировании в низкой плотности выделяется субпопуляция дормантных, «спящих» клеток, изначально неактивно пролиферирующих, однако затем начинающих быстро пролиферировать. Клональный анализ MMGK из костного мозга кроликов выявил положительное влияние EGF (увеличивался размер колоний и уменьшалась спонтанная экспрессия щелочной фосфатазы - маркера остеогенной дифференцировки) [165].
Gronthos и Simmons (1995) применили для культивирования клонов ММСК бессывороточную среду, содержащую дексаметазон, 1-ascorbate. Также ими была показана положительная зависимость роста колоний от присутствия PDGF и EGF [96]. Другими исследователями была показана необходимость присутствия FGF-2 для роста и формирования колоний [150]. Lodie et al (2002) было проведено исследование, в котором сравнивали влияние различных концентраций факторов роста (FGF-2, EGF, PDGF) и сыворотки на рост ММСК и их способность образовывать колонии [141]. Каких-либо значимых различий по данным анализа экспрессии поверхностных молекул и способности к дифференцировке выявлено не было. -1 На сегодняшний день наиболее часто исследователи применяют протокол выделения и культвирования ММСК, описанный Pittenger М et al. [170]. В качестве источников для выделения ММСК используются красный костный мозг [56, 166], жировая ткань [225], костная ткань [163], дерма [154], мышечная ткань [73], хрящ [199], адвентиция сосудов [192], печень [177], тимус [17]. Фенотипически ММСК отличаются отсутствием экспрессии маркеров гематопоэтических клеток ККМ: CD34, CD45, CD14, glycophorin А и CD133. Также в ММСК отсутствует секреция МНС II, Т-клеточных костимулирующих факторов (В7-1, В7-2, CD40, CD40L), рецепторов к матриксу (CD65L, CD65P), к факторам роста (CD120A, TGFbllR), маркёров предшественников остеогенных клеток - STRO-1, щелочная фосфатаза, остеонектин, остеокальцин. ММСК идентифицируются по экспрессии Thy-1 (CD90), CD 105, VCAM-1, CD44. Также ММСК экспрессируют CD29, CD51 (интегрины) и характерные для MCK SH2, SH3. Характерными для ММСК являются виментин, фибронектин, коллаген I и III, VI типов и т.н. osteoblast -specific factor.
Получение культуры пренатальных хондробластов
Для получения культуры МММСК стромы костного мозга использовали свежий аутопсийный материал, полученный в патолого-анатомическом отделении Морозовской детской городской клинической больницы №1 при искусственном прерывании беременности (18-20 нед.) у здоровых, предварительно обследованных на наличие вирусных и бактериальных инфекций женщин. Трубчатые кости переносили в стерильный контейнер с раствором Хэнкса и гентамицина (80мг/л). Дальнейшую работу проводили в стерильных условиях ламинарного бокса в режиме GMPi Культура ММСК была получена в соответствии с протоколами Pittenger и Ргосор [166, 170] с некоторыми модификациями. Материал помещали пинцетом в пластиковую чашку Петри, промывали дважды 10 мл р-ра Хэнкса пипеткой на 10мл. При помощи маленьких ножниц и двух пинцетов трубчатые кости отпрепаровывали от мягких тканей и переносили в 10 мм пластиковую чашку Петри. При помощи шприца с 3-5 мл среды Хэнкса производили аспирирование костного мозга. Клеточный материал отмывали 5-кратным объемом среды Хэнкса и центрифугировали. Производили подсчет количества клеток в камере Горяева без учета эритроцитов. Клеточный материал ресуспендировали в ростовой среде DMEM/F12 («Life Tech») с 20% эмбриональной телячьей сыворотки («Ну Clone/Fetal Clone») в посевной дозе 100-300 тысяч клеток в Г мл. Через 24 часа не прикрепившиеся клетки удаляли, а прикрепившаяся культура отмывалась дважды стерильным фосфатно-солевым буфером, рН 7,4. Клетки инкубировали 5-7 дней при 37С в атмосфере 5 % С02.
Для выделения популяции быстро пролиферирующих клеток культуру рассевали с плотностью 3 клетки\см2 в ростовой среде, содержащей 10 нг/мл FGF-2 (фактор роста фибробластов-2, «Sigma») и 8 Е\мл гепарин («ПанЭко»). Через 10-12 дней клетки снимали с пластика, центрифугировали и аликвоты замораживали.
Замороженные аликвоты культур стромальных клеток размораживали, и клетки высевали с плотностью 5000 клеток/см и инкубировали до получения преконфлуентного монослоя. На следующем пассаже плотность уменьшали до 3 клеток/см . Через 6-8 дней в контрольной чашке производили подсчет колоний (КОЕ) с использованием окрашивания спиртовым раствором 0,5% кристаллического фиолетового. Отбор колоний из остальных засеянных чашек производили исходя из следующих параметров: размера колонии - не менее 2 мм и высокой степени гомогенности мелких клеток с негранулированной цитоплазмой. Отбор колоний производили под контролем инвертированного микроскопа с чашек, предварительно покрытых раствором 1мМ ЭДТА.
В дальнейшем клетки пассировали в плотности 50-100 клеток/см , проводя не более 10 пассажей для получения трансплантатов. За 2-3 часа до трансплантации, клетки, полученные в соответствии с Паспортом культуры, после последнего пассажа снимали с пластика 0,25% раствором трипсина («ПанЭко»). Готовили суспензионный клеточный трансплантат в физиологическом растворе, подсчитывали количество клеток, и их жизнеспособность при окраске трипановым синим. Количество клеток в трансплантате доводили до концентрации 1x10 клеток/мл с содержанием жизнеспособных клеток не менее 96%. Для изолирования ХБ использовали свежий аутопсийный материал, (2-3 часа после операции), полученный в патологоанатомическом отделении
Морозовской детской городской клинической больницы №1 при искусственном прерывании беременности (8-12 и 18-20 нед.) у здоровых, предварительно обследованных на наличие вирусных и бактериальных инфекций женщин. Гиалиновую хрящевую ткань переносили в стерильный контейнер с раствором Хэнкса и гентамицина (80мг/л). Дальнейшую работу проводили в стерильных условиях ламинарного бокса в режиме GMP. Для отработки протокола получения культуры хондробластов за основу был взят протокол изолирования и культивирования постнатальных хондробластов Britberg М. et al. [198]. Выделенную с помощью хирургических инструментов хрящевую ткань тщательно отмывали от сгустков крови, максимально отделяли все мягкие ткани (кожу, фасции, мышцы, сухожилия, связки) и костную ткань. Полученную хрящевую ткань измельчали до кусочков не более 1 мм . Хрящевую ткань, подвергали механической и ферментативной обработке -инкубировали 90-180 мин в 0,1% коллагеназы II типа («Sigma»), 0,05% проназы Е («Sigma») и 0,1% гиалуронидазы («Sigma») (1:1:1) и каждые 15 минут пипетировали. Полученную суспензию клеток трижды промывали центрифугированием (1000 об/мин) в р-ре Хэнкса. Суспензию одиночных изолированных клеток (с жизнеспособностью 40-93% при окраски трипановым синим) засевали на чашки Петри 100 мм («Nunc») с плотностью 2 млн. клеток/мл в ростовую среду DMEM+F12 (1:1, «Gibco BRL») с добавлением 10% эмбриональной телячей сыворотки («ПанЭко»), 50 мкг/мл аскорбата («Sigma»), 10 мкг/мл гентамицина, 5 мкг/мл амфотерицина В, 5 нг/мл bFGF (основного фактора роста фибробластов, «Sigma»), 0,1 нг/мл TGFPi («Sigma»). При достижении конфлюэнтного состояния культуру рассевали с использованием 0,25% раствора трипсина («ПанЭко») с плотностью посева не менее 1x10 клеток/мл. Культуральную среду меняли 1 раз в 3 дня. Клетки культивировали 18-25 дней при 37 С в атмосфере 5 % СО2. Для приготовления клеточного трансплантата культуру хондробластов пассировали не более двух раз в соответствии с Паспортом культуры. За 2-3 часа до трансплантации, клетки, полученные после последнего пассажа, снимали с пластика 0,25% раствором трипсина («ПанЭко»), готовили суспензионный клеточный трансплантат в физиологическом растворе, подсчитывали количество клеток, и их жизнеспособность при окраске трипановым синим. Количество клеток в трансплантате доводили до концентрации 1x10 клеток/мл, с содержанием жизнеспособных клеток не менее 96%.
Методики характеристики фенотипа полученных культур клеток
Для оценки динамики иммунофенотипа культур клеток при культивировании и в зависимости от сроков гестации применяли сканирующую электронную микроскопию, иммуноцитохимическое окрашивание и проточную цитофлуориметрию. Сканирующая электронная микроскопия. Прикрепленные к покровному стеклу клетки отмывали от среды в фосфатно-солевом буфере и фиксировали 1,5% раствором глютарового альдегида 12 часов при +4С. Препарат инкубировали в 1% растворе OsOu в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) 1,5 часа при 20 С. Затем образцы обезвоживали в серии спиртов восходящей крепости, смеси этилового спирта с ацетоном в соотношениях 3:1, 1:1, 1:3 и 100% растворе ацетона. Препарат высушивали методом перехода критической точки жидкого СОг в аппарате НСР-2 («Hitachi Critical Point dryer») и покрывали слоем золота (100 нМ ) в аппарате EIKO-1 («EIKO engineering»). После обработки образец просматривали в растровом электронном микроскопе S-570 («Hitachi») при ускоряющем напряжении 15 кВ. . Проточная цитофлуориметрия. Клетки суспендировали в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) в концентрации 100 тыс. клеток в мл, фиксировали в 1% метаноле при 4С в течение 10 минут, затем отмывали. Неспецифическое связывание блокировали инкубацией в 1% БСА (бычий сывороточный альбумин) и 0,1% козьей сыворотке в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем клетки отмывали в трех объемах фосфатно-солевого буфера, центрифугировали и осадок ресуспендировали в 0,5% рабочего раствора первичных антител на 1% EGA и 0,1% козьей сыворотке. После инкубации в течение 40 минут при 4G клетки отмывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,4). Использовали мышиные антитела («PharMingen», «Santa. Cms Biotechnology», «Chemicon»).
В качестве отрицательного контроля использовали неспецифические мышиные IgG («Chemicon»). Инкубацию с антивидовыми антителами, меченными ФИТЦ проводили 20 минут. Клетки затем отмывали в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) и в объеме 1 мл анализировали на проточном цитофлуориметре «FAGS Caliber» ("BD Biosciences"). Иммуноцитохимия. Преконфлюэнтный слой клеток на 35 мм чашке Петри отмывали фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) без Са и Mg , фиксировали ЗО мин. 4% раствором параформа при комнатной температуре. Клетки вновь отмывали, и реакцию блокировали 3% раствором БСА 15 минут при 20С. На 60 мин добавляли первичные антитела в 3% БСА, затем препарат отмывали фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) и блокировали 3% БСА 15 мин при 20 С. На 30 минут добавляли раствор вторичных антител мышиных IgG + IgM + IgA («Abeam») в 3% БСА, и отмывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,4). В Табл. 3 перечислены все моноклональные антитела, которые использовались для характеристики иммунофенотипа полученных культур клеток. Выбор фенотипических,маркеров определялся данными литературы [141, 148, 156, 166, 170]. По данным Procop et al, Pittenger et al и других исследователей CD44, CD90, CD 105 являются; специфичными позитивными для ММСК маркерами [141, 166, 170]. Однако, обязательным критерием принадлежности полученной культуры к ММСК является возможность к индуцированной дифференцировке в миогенном, хондрогенном, остегенном, адипогенном (мультипотентность), что было изучено в нашей лаборатории [17]. Позитивными фенотипическими маркерами для ХБ являются специфичные для гиалинового хряща белки внеклеточного матрикса коллаген II типа и аггрекан [148, 156]. Коллаген I типа (маркер дедифференцировки ХБ [113]) и CD34 (маркер гемопоэтических клеток [117]) мы рассматривали как негативные маркеры. Кроме того, в задачи исследования входило определение примеси предшественников иммунокомпитентых клеток (HLA I-позитивные) и динамики уровня экспрессии HLAII класса при культивировании. Животные. В работе использовали половозрелых самцов беспородных крыс, весом 180-200 г. Животных содержали на стандартной лабораторной диете. За 24 часа до проведения оперативного вмешательства животные не получали пищи.
Проведено 5 серии экспериментов на 52 животных. Экспериментальная модель. Разработанная методика операций во всех сериях опыта была одинаковой с соблюдением правил асептики (Рис. 1, 2, 3). Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977. На проведение экспериментального исследования было получено разрешение Комиссии по биоэтике ГУ НИИ морфологии человека РАМН (Протокол №3 от 21.04.2005). Оперативные вмешательства проводили под эфирным наркозом, до и после операции животным вводили ненаркотические анальгетики. Операцию осуществляли на обеих конечностях животных. Перед операцией шерсть с наружной поверхности бедра крысы состригали. В области диафиза латеральной поверхности бедра производили разрез кожи длиной 1,5 см. Послойно рассекали фасции и мышцы, отводили в стороны и обнажали диафиз бедренной кости. Опытным путем были найдены максимальные размеры стандартных костных дефектов, которые позволили избежать переломов кости: диаметром 1,5 мм и глубиной 0,5 мм. Их воспроизводили с помощью стоматологического бора (шаровидный, №1). Костная рана такой глубины вызывала кровотечение. В качестве кровоостанавливающего фактора использовали тампонаду костной раны фрагментами гемостатической коллагеновой губки с последующей ревизией раны и удалением коллагенового материала. В дно дефекта с помощью инсулинового шприца вводили клеточный трансплантат - 1x107 клеток в 0,1 мл физиологического раствора или физиологический раствор в том же объеме. Для иммобилизации в области дефекта суспензионного клеточного трансплантата накладывали фиксирующую мембрану. Полиэфирсульфоновую мембрану («Millipore»), имеющую форму правильного круга диаметром 2,0 мм, плотно фиксировали над костной раной с помощью шелковой лигатуры (№1), охватывающей бедренную кость с наложением узла на противоположной ране стороне кости, после чего рану послойно ушивали. Наркоз и операцию, длившуюся 15-20 минут, все животные переносили удовлетворительно, без ранних и поздних осложнений.
Культура мультипотентных мезенхимальных клеток стромы костного мозга
Для получения культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток стромы костного мозга в качестве источника использовали трубчатые кости 18-20 недель гестации. На этих сроках можно получить необходимое количество аспирата костного мозга для изолирования и культивирования ММСК. Культура ММСК характеризовалась содержанием однородной популяции небольших полигональных клеток. Было отмечено, что при длительном культивировании морфологические характеристики и особенности роста полученных клеток не изменяются. При-пассировании культуры более 10 раз клетки оставались мелкими, полигональными, сохранялась их пролиферативная активность, возможности клоногенного роста и дифференцировки в разных направлениях. Кроме того, не было получено статистически достоверных различий по уровню экспрессии основных иммунофенотипических маркеров. Для трансплантации в дефект костной ткани мы использовали клеточные культуры ММСК стромы костного мозга 18-20 недель гестации, пассированные не более 9 раз. Результаты иммунологического фенотипирования трансплантированных культур представлены в Табл. 6 и на Рис.5. Культуры изолированных ХБ, выделенных из гиалиновой хрящевой ткани 8-12 и 18-20 недель развития, содержали весьма однородные популяции клеток с характерной морфологией и особенностями роста. В культуре из раннего хряща (8-12 недели) преобладали вытянутые клетки с небольшим количеством отростков. В культуре из хряща (18-20 недели) превалировали округлые, полигональные клетки без отростков. Обе культуры содержали от 50 до 90% клеток, положительно окрашивающихся альциановым синим, на аггрекан и на коллаген II типа. Относительное количество клеток, окрашивающихся положительно антителами к коллагену II типа, нарастало в хрящевой ткани более поздних сроков развития (Рис. 6). Популяция ХБ (8-12 нед) в культуре представлена двумя типами клеток. Первый тип - сверхраспластанные клетки без рельефных образований, которые покрывают значительную часть поверхности.
Второй тип - клетки, располагающиеся вторым слоем поверх сверхраспластанных. Клетки размером 10-15 микрон, на их поверхности располагается большое количество рельефных образований в виде блебсов и небольшого количества филоподий, осуществляющих контакт между слоями клеток. Культура ХБ (18-20 нед.) представлена также двумя типами клеток. Первый тип - округлые, полигональные сильно распластанные клетки размером 30-40 микрон с небольшим количеством рельефных образований в виде микроворсинок, большая часть которых располагается в ядросодержащей зоне клеток. Клетки располагаются на субстрате. Второй тип - сферические клетки шаровидной формы размером 10-15 микрон, практически не распластанные на субстрате, прикрепляются к нему небольшим количеством филоподий, содержат большое количество рельефных микрообразований в виде блебсов и микроворсинок. Клетки данного типа крайне редко располагаются на поверхности других клеток, а чаще на субстрате (Рис. б). При иммуноцитохимическом исследовании количество коллаген II продуцирующих клеток возрастало с увеличением сроков гестации. Гиалиновая хрящевая ткань на 8-12 неделях развития содержит 53,2±7,6% коллагенП-синтезирующих клеток, на 18-20 неделях - 85,3±6,8% (р 0,001) (Рис.6). При длительном культивировании ХБ приобретают вытянутую, веретеновидную форму, что совпадало с переключением синтезом коллагена II на коллаген I типа. Если среднее количество коллаген П-позитивных клеток в первичной культуре составляло 84,3±12,2%, коллаген 1-позитивных клеток- 13,2±1,8%, то в пассированной культуре - соответственно 19,8±2,2% и 56,9±7,3% (р 0,00\) (Рис.7). КоллагенІ-продуцирующие клетки характеризуются снижением пролиферативной активностью в стандартно используемых культуральных условиях. Для определения количества клеточных элементов крови, костного мозга, антигенпрезентирующих клеток была проведена проточная цитометрия. Во всех культурах отмечалось незначительное количество клеток, несущих молекулы CD 34, CD 90, CD 105, CD 44, HLA-DR - на уровне отрицательного контроля. При пассировании культур выявлено достоверное увеличение количества клеток несущих HLA-ABC (р 0,001) (Табл. 7, Рис. 8). Для трансплантации мы использовали культуры ХБ пренатальной гиалиновой хрящевой ткани, полученные из абортного материала на 18-20 неделях гестации и пассированные с высокой плотностью не более двух раз. При этом в культуре содержались 84% клеток синтезирующих коллаген II типа, 13% - синтезирующих -коллаген I типа. Экспрессии маркеров предшественников клеток крови и иммунокомпитентных клеток был на уровне Fab контроля. Антигены гистосовместимости I класса несли более 90% клеток. Полученная культура по своим фенотипическим характеристикам отвечала целям и задачам исследования.
