Введение к работе
Актуальность проблемы
Хеморецепторы являются наиболее древними сенсорными системами
позвоночных животных, осуществляющими контроль над основными
жизненными функциями организма. Вкусовой аппарат языка во многом
определяет особенности питания, опосредованно влияет на массу тела и
энергетический обмен млекопитающих. Несмотря на то, что изучение вкусового
анализатора продолжается уже около ста лет, механизмы дифференцировки
вкусовых луковиц в процессе внутриутробного развития млекопитающих до сих
пор не выяснены. В настоящее время существует несколько гипотез, каждая из
которых имеет экспериментальные подтверждения. Классическая точка зрения
основывается на нейрогенной дифференцировке вторичных сенсорных органов, к
которым также относятся вкусовые луковицы позвоночных (Zelena, 1994).
Эксперименты с повреждением нервов языка хирургическим (Hosley et al., 1987;
Nagato et al., 1995; Sollars, 2005) и химическим путем (Morris-Wiman et al., 1999)
показывают, что вкусовые луковицы млекопитающих развиваются только при
наличии в эпителии языка интактных афферентных нервных окончаний.
Зависимость вкусового аппарата от иннервации также подтверждается
клиническими данными; у человека при некоторых неврологических
расстройствах наблюдается отсутствие или деградация вкусовых сосочков
(Axelrod, Gold-von Simson, 2007; Gardiner et al., 2008; Rubin, Anderson, 2008). В
течение эмбрионального развития человека зачатки вкусовых луковиц
появляются только после проникновения нервных окончаний в эпителий языка
(Witt, Reutter, 1996, 1998), что также подтверждает нейрогенную гипотезу.
Однако, исследования развития вкусовой системы амфибий показали, что
формирование вкусовых луковиц может происходить без участия иннервации
(Barlow et al., 1996; Barlow, Northcutt, 1997). При этом дифференцировка клеток
вкусовых луковиц является результатом местного эпителиально-мезенхимального
взаимодействия, осуществляемого с помощью дифференциальной экспрессии
сигнальных молекул и транскрипционных факторов (Parker et al., 2004). На
данный момент влияние нервных и эпителиально-мезенхимальных сигналов на эмбриональное развитие вкусового аппарата млекопитающих активно изучается на экспериментальных животных – крысах и мышах (Hall et al., 1999; Okubo et al., 2006; Thirumangalathu et al., 2009). В отличие от человека, морфологически обособленные вкусовые луковицы у грызунов появляются непосредственно перед рождением или в течение неонатального периода после формирования на поверхности языка вкусовых сосочков (Farbman, 1965; Farbman, Mbiene, 1991). В эпителии языка грызунов обнаружено множество факторов и сигнальных молекул, влияющих на дифференцировку клеток эпителиальных и нервных тканей: сигнальная молекула Sonic hedgehog (Shh), костные морфогенетические белки – Bmp 2 и 4, белки семейства Noggin, фактор роста фибробластов FGF8, транскрипционный фактор Sox2 и лиганды сигнальной системы Wnt (Bitgood, McMahon, 1995; Hall et al., 1999; Jung et al., 1999; Zhou et al., 2006; Okubo et al., 2006). Но, несмотря на активные исследования, определение специфической роли каждого из факторов в регуляции развития вкусовых луковиц грызунов на данный момент затруднено из-за отсутствия маркеров для их клеток-предшественников и раннего морфогенеза сосочков языка, предшествующего их дифференцировке (Krimm, 2007).
Морфологически обособленные зачатки вкусовых луковиц (вкусовые примордии) у человека появляются в течение эмбрионального периода развития до формирования сосочков языка (Witt, Reutter, 1996, 1998). Большая часть исследований, проведенных на эмбриональном материале человека, посвящена оценке влияния иннервации на развитие вкусовых луковиц (Bradley, Stern, 1967; Witt, Reutter, 1996, 1998; Tamatsu, Gasser, 2004). Благодаря раннему появлению морфологически обособленных клеток-предшественников вкусовых луковиц, человек является удачным объектом для изучения влияния нервных и эпителиальных сигналов на дифференцировку вкусового аппарата языка, а полученные результаты могут быть применены к развитию других вторично-чувствующих рецепторов. Однако, активность эпителиальных сигнальных
каскадов, определяющих дифференцировку эпителия языка грызунов, у человека
остается неизученной. Приведенные выше данные демонстрируют необходимость комплексных исследований механизмов дифференцировки клеток вкусовых луковиц на эмбриональном материале человека.
Цель исследования – изучение закладки, раннего эмбрионального развития, иннервации и дифференцировки вкусового рецепторного аппарата языка человека.
Задачи исследования:
-
Изучение эмбриональной закладки и первичной морфологической дифференцировки нервного аппарата языка человека, начиная с 4-й недели внутриутробного развития, с помощью иммуногистохимических маркеров к белкам нервной системы (3-тубулину, NSE, S100).
-
Гистологическое и иммуногистохимическое типирование вкусовых рецепторных комплексов и их предшественников в развитии вкусового аппарата языка человека.
-
Анализ топологических закономерностей распределения дифференцирующихся вкусовых луковиц в эпителии сосочков языка плодов человека.
-
Изучение морфогенеза вкусовых луковиц и сосочков языка человека с помощью маркеров пролиферации (Ki67, PCNA) и антител к транскрипционным факторам, влияющим на дифференцировку нервных и эпителиальных клеток (Sox2, NeuroD1).
-
Иммуногистохимическое и электронномикроскопическое исследование реснитчатых клеток эпителия ротовой полости эмбрионов и плодов человека.
Научная новизна
В работе с помощью иммуногистохимических методов детально исследовано формирование нервного аппарата языка эмбрионов человека с 3-й по 7-ю неделю внутриутробного развития. Впервые описано раннее проникновение нервных волокон в мезенхиму языка человека на 4-й неделе, а также формирование язычного нерва на 5-й неделе внутриутробного развития.
В клетках вкусовых примордиев, появляющихся на поверхности языка
человека в конце 6-й недели развития, впервые обнаружена апикальная
локализация ядер, а также цитоплазматическая экспрессия нейрон-
специфического белка 3-тубулина.
С помощью ядерных пролиферативных маркеров Ki67 и PCNA установлено, что клетки вкусовых луковиц и примордев человека с 6-й по 15-ю неделю внутриутробного развития обладают пролиферативной активностью.
В эпителии языка человека впервые исследована экспрессия
транскрипционных факторов Sox2 и NeuroD1. На стадии закладки вкусовых
примордиев (конец 6-й недели развития) специфическая экспрессия
транскрипционных факторов Sox2 и NeuroD1 в эпителии языка отсутствует. NeuroD1 обнаружен в зонах пролиферации эпителия языка и в клетках вкусовых луковиц, начиная с 8-й недели и на всех последующих исследованных сроках развития; Sox2 – с 10-й по 15-ю неделю выявлялся как в клетках вкусовых луковиц, так и в очагах пролиферации эпителия языка, а после 18-й недели только в клетках вкусовых луковиц.
Впервые изучено топологическое распределение и иннервация реснитчатых клеток в эпителии ротовой полости эмбрионов и плодов человека.
Научно-практическая значимость
Результаты работы представляют собой детальное описание формирования вкусового рецепторного аппарата языка человека и дополняют имеющиеся к настоящему моменту сведения. Полученные данные могут быть использованы при экстраполяции результатов исследований дифференцировки вкусовой системы экспериментальных животных на человека, а также при изучении морфогенеза других вторично чувствующих рецепторных органов.
Обнаруженные цитологические и иммуногистохимические особенности вкусовых примордиев человека позволят выявлять зоны их первичного обособления на ранних стадиях дифференцировки, протекающих до иннервации и специфической экспрессии транскрипционных факторов Sox2 и NeuroD1, а также могут быть использованы для типирования клеток-предшественников вкусовых луковиц у экспериментальных животных.
Результаты исследования экспрессии транскрипционных факторов Sox2 и NeuroD1, показывают, что в течение эмбрионального и раннефетального периода внутриутробного развития человека возрастает опасность возникновения отклонений в развитии, связанная с нарушением процессов пролиферации и дифференцировки в эпителиальных дериватах ротовой полости. Выявленные особенности экспрессии данных факторов могут быть использованы при изучении механизмов развития онкологических заболеваний ротовой полости человека и их диагностике. Полученные результаты также необходимы для уточнения функций Sox2 и NeuroD1 в разных эпителиальных тканях в течение пренатального онтогенеза человека.
Наличие реснитчатых клеток в эпителии ротовой полости эмбрионов и плодов человека необходимо учитывать при изучении развития и патологий эпителиальных дериватов первичной ротовой полости. Формирование описанных в тератологии врожденных кист языка, содержащих клетки с реснитчатыми структурами, может быть следствием нарушения процессов дифференцировки в эпителии языка в течение эмбрионального и раннего фетального периода развития.
Внедрение в практику в курс лекций на кафедре гистологии и биологии
Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего
профессионального образования «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Положения, выносимые на защиту:
-
Вкусовые примордии структурно обособляются из эпителия языка эмбрионов человека в конце 6-й недели внутриутробного развития до начала его иннервации. Их ранняя дифференцировка характеризуется локализацией ядер в апикальной области клетки и цитоплазматической экспрессией нейрон-специфического 3-тубулина.
-
Транскрипционные факторы Sox2 и NeuroD1 не являются специфическими
маркерами ранней дифференцировки вкусовых луковиц человека. Sox2
выявляется в зонах пролиферации эпителия языка и во вкусовых луковицах с 10-й недели внутриутробного развития, а после 18-й недели только в клетках вкусовых луковиц и прилежащего к ним эпителия. NeuroD1 обнаружен как в клетках вкусовых луковиц и примордиев, так и в очагах пролиферации эпителия языка человека с 8-й по 21-ю неделю внутриутробного развития.
3. В эпителии ротовой полости эмбрионов и плодов человека, начиная с 7-й
недели развития, выявляются реснитчатые клетки. Количество реснитчатых клеток в эпителии языка максимально в период с 10-й по 12-ю неделю внутриутробного развития, в течение которого их локализация не связана с морфогенезом вкусовых сосочков и желез языка.
Апробация работы
Основные результаты исследования были представлены на V
Всероссийской научно-практической конференции «Стволовые клетки и
регенеративная медицина» (Москва, 2013), XI международной заочной научно-
практической конференции «Научная дискуссия: вопросы математики, физики,
химии, биологии» (Москва, 2013), XI международной научно-практической
конференции «Проблемы современной биологии» (Москва, 2014),
межлабораторной конференции ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН (Москва, 2013).
Публикации материалов исследования
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
