Введение к работе
Актуальность темы. Грипп занимает особое место в инфекционной патологии человека, не имея себе равных по распространенности и частоте заболеваний. Особый интерес представляет возбудитель гриппа А/H5N1, характерными особенностями которого является широкая географическая распространенность, высокая патогенность для человека, приводящая к тяжелому заболеванию с высокой смертностью при отсутствии специфического иммунитета в человеческой популяции (To K.F. et al., 2001; Pei F. et al., 2005; Suzuki Y., 2005). По данным ВОЗ на 10 августа 2012 года заболеваемость человека гриппом А/H5N1 зарегистрирована в 58 странах мира, а общее количество вирусологически подтверждённых случаев заболевания людей, вызванного штаммами гриппа А/H5N1, составило 608, из которых 359 (60%) закончились летальным исходом. При этом среди детей до 15 лет летальность при гриппе А/H5N1 достигает 89% (www.who.int/ru/, 2012).
По оценке ВОЗ в связи с высокой изменчивостью вирусов гриппа А/H5N1 и его способностью к прямой передаче от птиц к человеку существует постоянная угроза возникновения пандемии (www.who.int/ru/, 2012).
Несмотря на многочисленные исследования, проведенные за последние 10 лет, механизмы высокой вирулентности новых рекомбинантных высокопатогенных штаммов вируса гриппа А/H5N1 остаются малоизученными. Имеющиеся в современной литературе данные не дают полноценного представления о механизмах развития заболевания и его осложнений, что диктует необходимость дальнейшего изучения патогенетических аспектов, особенно для новых, ранее неисследованных штаммов, в частности, выделенных на территории Российской Федерации.
Комплексное исследование на молекулярно-клеточном уровне структурно-функциональных особенностей клеток органов-мишеней у млекопитающих при гриппе А/H5N1 является необходимым условием для понимания основных механизмов развития вирусной инфекции и важнейших ее патоморфологических проявлений, обусловливающих высокую летальность у людей и животных. Это позволит улучшить проспективное прогнозирование исходов инфекционного заболевания, обусловленного вирусами гриппа А, и одновременно разработать принципиально новые патогенетически обоснованные подходы к профилактике и лечению гриппа А/H5N1 у людей, направленные на снижение риска заболеваемости, уменьшение частоты и тяжести его осложнений.
Высокая антигенная вариабельность, свойственная вирусам гриппа А, отсутствие специфических вакцин, нерациональная фармакотерапия приводят к появлению новых штаммов, резистентных к основным противовирусным препаратам (Cheung C.L. et al., 2006; Menno N. et al., 2006). Все это определяет особую значимость разработок по созданию новых эффективных средств неспецифической профилактики гриппа А, не оказывающих прямого действия на вирус, что исключало бы возможность возникновения лекарственной резистентности.
Такими препаратами являются иммуномодуляторы микробного происхождения, в частности, модифицированные крупномолекулярные полисахариды (окисленные декстраны), которые способны повышать функциональную активность клеток моноцитарно-макрофагальной системы (Шкурупий В.А., 2007). Однако исследований, направленных на изучение эффективности таких препаратов при вирусных инфекциях и, в частности, при гриппе А/H5N1 у млекопитающих и человека не проводили.
На основании вышеизложенного были сформулированы цель и задачи исследования.
Цель исследования: изучить патоморфогенез гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05 у мышей и его молекулярно-клеточные проявления при профилактике модифицированным декстраном.
Задачи исследования:
-
Исследовать патогенность вируса гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05 для млекопитающих на мышиной модели.
-
Исследовать топологию вируса в клетках легких, печени, почек, селезенки, головного мозга мышей, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, на разных сроках заболевания методом иммуногистохимии.
-
Исследовать морфофункциональные и ультраструктурные изменения в органах мышей, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05, и особенности морфогенеза вирусной инфекции.
-
Исследовать роль про- и противовоспалительных цитокинов в патогенезе гриппа А/H5N1 по цитокиновому профилю инфицированных мышей в сыворотке крови и в клетках органов в динамике развития вирусной инфекции.
-
Исследовать молекулярно-клеточные пути реализации клеточной гибели в органах мышей, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05.
-
Изучить динамику фибротических проявлений в органах инфицированных мышей и молекулярно-клеточные механизмы их регуляции при гриппе А/H5N1.
-
Сформулировать патогенетическое обоснование профилактики гриппа А/H5N1 модифицированным декстраном (диальдегиддекстраном) на основе полученных данных о патогенезе вирусной инфекции, изучить его профилактическую эффективность для мышей, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05.
-
Исследовать особенности иммунологических реакций у мышей, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05, при профилактике диальдегиддекстраном.
-
Изучить структурно-функциональные проявления гриппа А/H5N1 в органах инфицированных животных после профилактического введения им диальдегиддекстрана.
Научная новизна. В ходе эксперимента впервые методом иммуногистохимии выявлены особенности топологии вируса гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в динамике развития вирусной инфекции. Показана пролонгированная персистенция вируса гриппа А/H5N1 в альвеолоцитах, макрофагах, фибробластах, эндотелиоцитах легких; гепатоцитах, клетках Купфера, синусоидальных эндотелиоцитах печени; мезангиальных и эндотелиальных клетках почек; лимфоцитах, макрофагах синусов и эндотелиоцитах селезенки; нейронах, глиальных и эндотелиальных клетках головного мозга.
Высокая тропность вируса гриппа А к эндотелиоцитам сосудов легких и экстрапульмонарных органов способствует ранней диссеминации вируса и генерализации инфекционного процесса, а также детерминирует структурные изменения микроциркуляторного русла с деструкцией эндотелиальной выстилки сосудов, повышением их проницаемости, тромботическими и геморрагическими осложнениями, создающие условия для острой гипоксии – фактора риска развития в органах ишемии, ведущей к распространенным деструктивным изменениям и полиорганным нарушениям.
Показано, что успешная пролонгированная репликация вируса гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в клетках органов инфицированных мышей отчасти обусловлена блокадой интерферонового противовирусного ответа, проявляющейся в снижении уровня эндогенных интерферонов – IFN-, IFN-, что в дальнейшем усугубляется масштабным апоптозом лимфоидных клеток селезенки и тимуса и угнетением лимфоидного ростка костного мозга.
Персистенция вируса гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в клетках различного гистогенеза сопряжена с существенной активацией клеточного звена иммунитета, проявляющейся в увеличении экспрессии провоспалительных цитокинов (TNF- и IL-6), лизосомальных гидролаз (лизоцима, катепсина Д, миелопероксидазы), NO-синтаз (eNOS и iNOS), ростовых факторов и их рецепторов (FGF, FGFR, VEGFR) в клетках легких, печени, головного мозга, селезенки. Это является пусковым фактором процессов деструкции, пролиферации, ангиогенеза и раннего фиброзирования в органах инфицированных животных. Высокий уровень пролиферации в рассматриваемых экспериментальных условиях носит двойственный характер: с одной стороны способствует восстановлению утраченных структур, с другой – увеличивает концентрацию новых клеток, необходимых для проникновения, репликации и персистенции вируса гриппа А, способствуя тем самым прогрессированию инфекции.
Показано, что масштабы некроза и апоптоза и их соотношение, а также пути реализации этих процессов в различных органах при гриппе А/H5N1 зависят от длительности развития инфекции и органно-тканевой принадлежности: в печени, почках и головном мозге инфицированных мышей гибель клеток происходит путем некроза, в легких и селезенке в структуре деструктивных изменений преобладает гибель клеток апоптозом. Основными механизмами апоптоза при гриппе А/H5N1 являются: митохондриальный, реализуемый на ранних сроках инфекционного процесса и связанный преимущественно с цитопатическим действием вирусов; рецепторно-опосредованный, обусловленный с гиперсекрецией провоспалительных цитокинов, в частности TNF-, и активацией каспазы-3 через TRAIL – домены.
Персистенция вируса гриппа А/H5N1 в фибробластах органов инфицированных мышей является триггерным фактором инициации их фиброзирования. Прогрессирующее развитие фиброза в органах мышей при гриппе А/H5N1 детерминировано многими факторами: пролонгированной персистенцией вируса в клетках органов, включая макрофаги и фибробласты, блокадой интерферонового ответа, ишемией, инфильтративными изменениями с повышением гидролитического потенциала и избыточной продукцией свободных радикалов в локусах воспаления, гиперцитокинемией. «Дисбаланс» этих процессов в динамике развития вирусной инфекции, видимо, одна из причин раннего фиброза.
Предложено средство (диальдегиддекстран) и патогенетически обосновано его применение для профилактики вирусной инфекции, индуцированной вирусом гриппа А/H5N1. Показана его высокая профилактическая эффективность при экспериментальном инфицировании мышей вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, которая проявляется увеличением средней продолжительности жизни животных на 24,8%, уменьшением летальности в 3,2 раза, уменьшением числа инфицированных клеток различного гистогенеза в органах мышей, прежде всего, макрофагов и фибробластов легких, уменьшением масштабов повреждения паренхиматозных органов, выраженными антифибротическими эффектами.
Механизмы профилактического действия диальдегиддекстрана при гриппе А/H5N1 у мышей опосредованы повышением мощности механизмов естественной резистентности макроорганизма, прежде всего, клеток системы мононуклеарных фагоцитов, проявляющимся повышением уровня IFN-, IFN- за счет усиления интерферон-продуцирующей функции эффекторных клеток, нормализацией дифференцировочного потенциала и баланса между различными ростками костномозгового кроветворения, уменьшением масштабов апоптоза лимфоцитов в органах иммуногенеза, снижением внутриклеточного синтеза провоспалительных цитокинов – TNF-, IL-6, лизосомальных гидролаз (лизоцима, катепсина Д, миелопероксидазы), NO-синтаз, что существенно снижает масштабы гемодинамических, деструктивных, фибротических осложнений.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные существенно дополняют известные сведения о морфопатогенезе гриппа А /H5N1, в том числе вызываемого новым штаммом, дополняют сведения о механизмах развития осложнений вирусной инфекции, свидетельствуют о необходимости поиска новых средств и способов ранней профилактики и лечения гриппа.
Результаты исследования молекулярно-клеточных и патоморфологических особенностей морфогенеза вирусной инфекции, вызываемой новыми штаммами вируса гриппа А/H5N1, могут быть использованы в процессе преподавания патологической физиологии, патологической анатомии, клеточной биологии, курса «инфекционные болезни», послужить основой для разработки средств и способов патогенетически обоснованной профилактики и терапии гриппа А.
Полученные данные о высокой эффективности предложенного средства (диальдегиддекстрана) при профилактики гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05 у мышей могут послужить основой для доклинических испытаний данной субстанции как средства профилактики гриппа А и его осложнений у человека.
Работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013гг.», государственный контракт №02.740.11.0709.
Внедрение результатов. Результаты исследования внедрены в учебный процесс в ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России: на кафедре патологической анатомии лечебного факультета по темам: «Компенсаторно-приспособительные процессы», «Клеточная смерть. Некроз. Апоптоз», «Инфекционные болезни. ОРВИ».
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Высокая патогенность вируса гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 связана с его пролонгированной персистенцией в клетках альвеолярного эпителия, гепатоцитах, нейронах, резидентных макрофагах, фибробластах, эндотелиоцитах сосудов и во внеклеточных пространствах, что обусловлено блокадой интерферонового ответа и детерминирует каскад патологических реакций в морфогенезе гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05 с развитием вазопатического, отечно-деструктивного, гиперпластического и фибропластического синдромов, вследствие которых формируется капиллярно-паренхиматозный блок с развитием острой гипоксии, что определяет масштабные процессы деструкции, реализуемые путем некроза и апоптоза, и инициирует пролиферацию и ускоренную дифференцировку коллагенпродуцирующих клеток с ранним постгипоксическим фиброзированием органов.
-
Персистенция вируса гриппа А/H5N1 А/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в клетках различного гистогенеза сопряжена с активацией клеточного звена иммунитета, проявляющейся в увеличении экспрессии провоспалительных цитокинов (TNF- и IL-6), лизосомальных гидролаз (лизоцима, катепсина Д, миелопероксидазы), NO-синтаз (eNOS и iNOS), металлопротеиназ и их ингибиторов, ростовых факторов и их рецепторов (FGF, FGFR, VEGFR) в клетках легких, печени, головного мозга, селезенки, что приводит к вторичной альтерации тканей органов, расширяя масштабы повреждения органов, и ускоряет процессы пролиферации клеток, приводя к неполноценной репарации тканей с развитием фиброза.
-
Ддиальдегиддекстран оказывают выраженный профилактический дозозависимый эффект при экспериментальном инфицировании мышей вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, который проявляется увеличением средней продолжительности жизни животных и снижением летальности, уменьшением инфицирующей способности вирусов, снижением масштабов деструктивных и фибротических процессов, что, видимо, обусловлено его иммуномодулирующими свойствами, опосредованными через активацию системы мононуклеарных фагоцитов, способствующими стимуляции интерфероногенеза, снижению синтеза провоспалительных цитокинов, лизосомальных гидролаз, NO-синтаз, что существенно снижает масштабы осложнений – гемодинамических, деструктивных, фибротических.
Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на: Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России за 2007-2012г.г.» (Москва, 2007); The Third European Influenza Conference (Vilamoura, Portugal, 2008); Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России за 2007-2012г.г.» (Москва, 2008); III Съезде Российского общества патологоанатомов (Самара, 2009); IV Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009); V Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2011); XLIX Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2011); IV Международной Научно-практической конференции молодых ученых "Клинические и теоретические аспекты современной медицины" (Москва, 2012).
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 25 печатных работ, из которых 11 статей в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации; 1 Евразийский патент на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 389 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, описание материала и методов исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы, приложение. Диссертация иллюстрирована 62 таблицами и 80 рисунками, в том числе микрофотографиями. Список литературы включает 451 источник, в том числе 350 работ зарубежных авторов.
