Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1 Стадии воспалительной реакции в зоне перелома диафиза длинной трубчатой костей и механизмы регуляции репаративной регенерации .12
1.2 Физические факторы, влияющие на количественные и качественные характеристики репаративного остеогенеза 16
1.3 Морфо-функциональные особенности строения сосудистого русла диафиза длинных трубчатых костей и его перестройка после высокоэнергетического перелома 19
1.4 Недостатки существующих методов оптимизации репаративного остеогенеза и пути их совершенствования 25
1.5 Физико-химические свойства перфторированных углеводородов. Биологические эффекты кровезаменителя с газотранспортной функцией «Перфторан» 29
Заключение обзора литературы 36
2. Материал и методы исследования 38
Общая характеристика исследования 38
Объем исследования и схема проведения эксперимента 38
Обоснование выбора экспериментальной модели и методика выполнения оперативного вмешательства 40
Схема введения препаратов 42
Клинические методы исследования 43
Морфологические методы исследования 44
Методы статистической обработки данных 45
3. Результаты собственных исследований 47
3.1 Состояние тканей в зоне высокоэнергетического перелома на ранних сроках после его моделирования 47
3.2 Сравнительное исследование динамки консолидации костных отломков 56
3.3 Отличительные особенности репаративной регенерации костной ткани диафиза бедренной кости экспериментальных животных на сроках 15 — 60 суток наблюдения после моделирования высокоэнергетического перелома 59
1 Группа экспериментальных животных (контрольная) 59
2 Группа экспериментальных животных (интрамедуллярное введение перфторана) 63
3 Группа экспериментальных животных (внутрибрюшинное введение перфторана) 67
4 Группа экспериментальных животных (введение перфторана в межотломковую зону) 71
5 Группа экспериментальных животных (интрамедуллярное введение физиологического раствора) 76
Заключение 81
Выводы 88
Практические рекомендации 90
Указатель литературы 91
Приложение 1 114
- Физические факторы, влияющие на количественные и качественные характеристики репаративного остеогенеза
- Недостатки существующих методов оптимизации репаративного остеогенеза и пути их совершенствования
- Обоснование выбора экспериментальной модели и методика выполнения оперативного вмешательства
- Отличительные особенности репаративной регенерации костной ткани диафиза бедренной кости экспериментальных животных на сроках 15 — 60 суток наблюдения после моделирования высокоэнергетического перелома
Введение к работе
Актуальность исследования. Рост показателей общего травматизма на протяжении последних 10-15 лет происходит на фоне роста частоты и тяжести осложнений травматических повреждений костей скелета. Во многих случаях это связано с нарушениями остеорепарации и зависит от объема повреждения и механизма самой травмы, природы травмирующего агента, развития инфекционных осложнений и ряда других факторов [9]. Несмотря на очевидный прогресс хирургической техники и медицинских технологий, появление новых средств и методов фармакологической коррекции [109, 162], частота нарушений консолидации отломков костей и возникновения ложных суставов остаётся на высоком уровне [3, 62, 71, 76, 84, 138, 175]. Так, по данным Ю.Г. Шапошникова (1997) причиной инвалидизации, наступившей вследствие травмы аппарата движения, в 70% случаях являются осложнения течения заживления переломов, а по данным ряда авторов [63, 86, 94, 177] от 6 до 25% случаев диафизарных переломов длинных трубчатых костей средних сегментов скелета свободных конечностей костей осложняются развитием ложных суставов. Совокупность перечисленных обстоятельств определяет актуальность изучения особенностей репаративной регенерации тканей в зоне травмы и, в частности, реактивности пластинчатой костной ткани. Разработка новых способов оптимизации репаративной регенерации костной ткани остается актуальной проблемой теоретической морфологии, решение которой имеет важное значение для травматологии [22, 24, 82, 103].
Известно, что особенностью течения процесса репаративной регенерации костной ткани является последовательная смена этапов. От момента альтерации до образования морфологически зрелой костной ткани, заполняющей костный дефект и восстановления
функции кости, проходит достаточно много времени. При этом
стадийность репаративного процесса и временная протяженность
каждой стадии зависят от многих условий: объем и механизм
повреждения, функциональные нарушения отдельных регуляторных
систем и их сочетанные дисфункции [1, 7, 10, 18, 51], степень
повреждения транспортных систем и выраженность отека и
гипоксии. Одно из главных мест в этом, далеко не полном перечне
обстоятельств, обусловливающих особенности течения
репаративной регенерации костной ткани занимает сохранность и пролиферативная активность пула остеогенных клеточных элементов [25, 28, 30, 39, 91].
При точной репозиции и хорошей фиксации костных отломков, сохранности кровоснабжения зоны повреждения кости у молодых пациентов с неотягощенным анамнезом репаративный процесс имеет благоприятное течение и исход. Пожилой возраст, обширные костные дефекты, нарушение кровоснабжения зоны перелома, наследственные заболевания соединительной ткани, ослабление организма, связанное с перенесенными заболеваниями и т.п. снижают способность организма к остеогенезу. Восстановление поврежденных костей в этих случаях может оказаться неполноценным или замедленным [62, 86].
Решение указанной проблемы возможно посредством оптимизации состояния внутритканевой среды непосредственно в зоне регенерации, а также активации остеогенеза с выходом за пределы генетического алгоритма остеогенных клеток и их предшественников, характерного для естественного течения репаративной регенерации. При этом необходимо учитывать, что основным механизмом как физиологической, так и репаративной костной регенерации является пролиферация и дифференцировка
предшественников остеогенных клеток, находящихся в периосте и эндосте [28, 39, 42, 43]. Перечисленные структуры как раз и повреждаются в наибольшей степени при диафизарных переломах длинных трубчатых костей. Поэтому частота посттравматических осложнений, связанных с нарушением репаративного остеогенеза, остается достаточно высокой. В первую очередь потому, что в условиях гипоксии в области повреждения происходит дифференцировка остеогенных клеток в хондробласты с последующим формированием ложного сустава даже и при надежной фиксации репонированных отломков. Это побуждает к постоянному поиску средств и способов нормализации кровотока в зоне травмы с целью купирования гипоксии в области перелома с целью оптимизации формирования костной мозоли [70].
В этой связи перспективно использование функциональных возможностей кровезаменителей с газотранспортной функцией, в частности перфторана. Среди биолбгических эффектов при введении перфторана разработчики препарата отмечают улучшение показателей гемодинамики, в том числе мембраностабилизирующий и кардиопротекторный эффекты. Улучшение реологических показателей крови происходит за счет повышения эластичности мембраны эритроцитов. Перфторан предназначен для возмещения острой и хронической гиповолемии при травматическом, геморрагическом, ожоговом и инфекционно-токсическом шоке, черепно-мозговой травме, операционной и послеоперационной гиповолемии; для лечения нарушений микроциркуляции и периферического кровообращения (изменении тканевого метаболизма и газообмена, гнойно-септическом состоянии, инфекции, нарушении мозгового кровообращения, жировой эмболии); а также применяется при регионарной перфузии, лаваже
легких, для промывания гнойных ран брюшной и других полостей; для противоишемической защиты донорских органов [35].
Цель исследования: изучить . особенности репаративной регенерации костной ткани после экспериментального моделирования высокоэнергетического перелома при различных способах введения кровезаменителя с газотранспортной функцией «Перфторан».
Задачи исследования:
1. Изучить динамику восстановления пластинчатой костной
ткани компактного костного вещества после моделирования
высокоэнергетического перелома диафиза бедренной кости белой крысы.
Провести сравнительное рентгенографическое исследование особенностей консолидации костных отломков и формирования костной мозоли на сроках 3, 7, 15, 21, 30, 45 и 60 суток после моделирования высокоэнергетического перелома диафиза бедренной кости белой крысы и введения перфторана различными способами (местно, внутрибрюшинной и интрамедуллярно).
Изучить морфологические отличия воспалительного инфильтрата в межотломковой зоне на сроках 3 и 7 суток после моделирования высокоэнергетического перелома диафиза бедренной кости белой крысы и введения перфторана различными способами (местно, внутрибрюшинной и интрамедуллярно).
Исследовать отличительные морфологические особенности формирования костной мозоли на сроках 15, 21, 30, 45 и 60 суток после моделирования высокоэнергетического перелома диафиза бедренной кости белой крысы и введения перфторана различными способами (местно, внутрибрюшинной и интрамедуллярно).
Научная новизна. На значительном экспериментальном материале при высокоэнергетических переломах диафизов длинных трубчатых костей доказана целесообразность применения перфторана с
целью оптимизации репаративной регенерации пластинчатой костной ткани компактного костного вещества диафизарной локализации.
Впервые для оптимизации репаративной регенерации пластинчатой костной ткани диафизов длинных трубчатых костей применено введение кровезаменителя с газотранспортной функцией в костно-мозговой канал.
С помощью рентгенологического и комплекса морфологических методов в ходе сравнительного экспериментального исследования доказана эффективность внутрикостного (интрамедуллярного) способа введения препарата по сравнению свнутрибрюшинным (системным) и местным (в область перелома) способами.
Практическая значимость работы. Создано техническое устройство (полый перфорированный стержень для экспериментального внутрикостного остеосинтеза длинных трубчатых костей мелких животных и введения лекарственных препаратов в костномозговой канал), могущее стать прототипом для разработки аналогичных по функциональным возможностям устройств для применения их на людях.
Разработан новый способ применения известного лекарственного вещества по новому назначению, предполагающий адресную доставку кровезаменителя с газотранспортной функцией непосредственно в зону перелома, позволяющий избежать дополнительной травматизации и уменьшить дозу вводимого препарата.
Показано, что внутрикостное (интрамедуллярное) введение кровезаменителя с газотранспортной функцией перфторан при высокоэнергетических переломах диафизов длинных трубчатых костей оптимизирует репаративный остеогенез. Иные способы введения перфторана (внутрибрюшинный и местный — в межотломковое пространство) существенно не влияют на течение репаративных процессов в зоне перелома
Реализация работы. Основные положения, выносимые на защиту, выводы и практические рекомендации внедрены в лекционный курс и практическую часть учебного курса кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии Ивановской государственной медицинской академии, кафедр морфологического профиля и кафедры травматологии и ортопедии с курсом военно-полевой хирургии Курского государственного медицинского университета, а также кафедры анатомии и гистологии Белгородского государственного университета (приложение 1).
Апробация работы. Основные результаты, полученные в ходе исследования были представлены на итоговых научных сессиях Курского государственного медицинского университета и Центрально-Черноземного научного центра РАМН (Курск, 2007, 2008, 2009), конференции молодых учёных КГМУ (Курск, 2007), межкафедральной конференции морфологических кафедр КГМУ (Курск, 2009), Научно-практической конференции с международным участием, посвященной 85-летию со дня рождения доктора медицинских наук, профессора Степанова Петра Федоровича (Смоленск, 2009).
Публикации: по материалам диссертации опубликовано 6 статей, в том числе 2 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Получено 1 свидетельство на полезную модель и 1 положительное решение на выдачу патента РФ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 118 странице основного текста, иллюстрирована 6 таблицами и 36 рисунками, среди которых микрофотографии гистологических препаратов, графики и гистограммы. Работа состоит из введения, глав «обзор литературы», «материал и методы исследования», главы «результаты собственных исследований», заключения, выводов, практических рекомендаций и приложения. Указатель использованной
литературы включает 101 работу отечественных и 87 зарубежных
авторов. , ':
Основные положения, выносимые на защиту
1. Высокоэнергетический перелом в силу объема повреждения
диафиза длинной трубчатой кости, распространенности разрушения
эндоста и периоста в проксимальном и дистальном направлениях,
приводит к расстройству локального кровообращения и гипоксии. В
результате этого создаются условия для расстройств репаративной
регенерации костной ткани в виде замедленной консолидации костных
отломков, несращения перелома и образования ложных суставов.
2. Введение перфторана (эмульсии перфторированных
углеводородов) в зону травмы позволяет купировать гипоксическое
состояние регенерирующих тканей и, тем самым, создать оптимальные
условия микроокружения для дифференцировки остеогенных клеток в
остеобласты.
3. Из трех исследованных способов введения перфторана -
эмульсии перфторированного углеводорода в качестве кровезаменителя
с газотранспортной функцией (системный — внутрибрюшинный и
местные способы: в полость костномозгового канала через полый штифт
для металлоостеосинтеза и с помощью инъекции непосредственно в
регенерирующие ткани) наиболее оптимальным является
интрамедуллярный способ введения.
4. Интрамедуллярное введение перфторана (эмульсии
перфторированного углеводорода в качестве кровезаменителя с
газотранспортной функцией) непосредственно в зону
высокоэнергетического перелома диафиза трубчатой кости стимулирует
привлечение сюда фагоцитирующих клеток, чем ускоряет течение
экссудативной стадии воспаления; стимулирует дифференцировку
остеогенных клеток в остеобласты — чем ускоряет наступление
11 ,
пролиферативной фазы воспаления; способствует уменьшению посттравматической деформации диафиза; ускоряет консолидацию костных отломков и препятствует формированию ложных суставов.
1. Обзор литературы
Физические факторы, влияющие на количественные и качественные характеристики репаративного остеогенеза
К местным регуляторным механизмам репаративного остеогенеза также следует отнести и совокупность факторов физической природы.
Раньше всего были получены эмпирические данные о положительном влиянии температуры на заживление ран и переломов костей. Это привело к широкому внедрению в практику физиотерапии парафино- и озокеритотерапии, а позднее - прогревания с помощью ультрафиолетового облучения, электрических полей различной длины волны [58, 107, 108] и магнитных полей [106]. Определенный интерес представляют экспериментальные и клинические наблюдения по использованию лазера для стимуляции репаративного процесса при переломах [56]. Имеются сведения об оптимизирующем влиянии на костную регенерацию КВЧ — терапии, электростимуляции [161, 174], ультразвуковых воздействий [127, 128] и пр. Одним из главных звеньев механизма лечебного воздействия в большинстве случаев является усиление притока крови и, как следствие, улучшение оксигенации прогреваемого участка организма человека.
Также было установлено, что внешнее механическое воздействие на формирующуюся костную мозоль приводит к изменению взаимодействия клеток с матриксом, благодаря чему изменяется структура матрикса и функциональное состояние клеток [118]. Этот феномен лежит в основе методики дистракционно-компрессионного остесинтеза [36, 79]. Исследование динамики формирования тканей костной мозоли при дистракционно-компрессионном остесинтезе по методу Илизарова показало [36, 147, 172, 186], что от скорости дистракции зависит не только синтетическая активность клеток, но и распределение коллагена 1 и 2 типов в формирующейся мозоли [148], что позволяет выделить три разных типа ее оссификации [151, 186], при которых обнаружены отличия в динамике минерализации коллагена [130, 154, 182]. Также обнаружено влияние скорости дистракции на темпы пролиферации клеток остеобластического ряда эндостальной локализации и периоста [122, 145]. При этом большинство исследователей обращали внимание на то, что скорость минерализации межклеточного вещества и восстановления остеонной организации зависели от степени васкуляризации формирующейся костной мозоли и, соответственно, обеспечения всех компонентов тканей регенерата кислородом.
Развитием подхода к стимуляции репаративной регенерации костной ткани в области перелома посредством ее «насыщения» кислородом является применение гипербарической оксигенации [13, 81], позволяющей снижать выраженность локальной гипоксии [40, 53]. Применение этой методики в клинике [41] позволяет уменьшить количество осложнений при лечении пациентов с травмами. Тем не менее, учитывая техническую сложность и относительную дороговизну аппаратуры для проведения гипербарической оксигенации, в 90-х годах были предприняты успешные пойытки купирования гипоксии с помощью озонирования поверхности открытых ран, в том числе и при открытых переломах костей [32]. Положительный эффект озона на репаративный остеогенез был подтвержден морфологически [88].
Установлено, что парциальное давление кислорода, влияет непосредственно на клетки остеогенного ряда [39, 70]. Изменение содержания кислорода в тканях влияет на внутриклеточный метаболизм, запускает каскад ответных реакций, поэтому от величины напряжения кислорода в тканях будет зависеть характер формирующейся костной ткани [18, 39, 44, 70, 139]. В настоящее время окончательно установлено, что фибробласты и остеобласты в межотломковой грануляционной ткани способны синтезировать коллаген и ферменты его минерализации лишь при превышении порогового значения парциального давления кислорода в грануляционной ткани [12, 50, 57, 102]. Считается, что в условиях дефицита кислорода пролиферирующие остеогенные клетки, адаптируясь к гипоксии переходят на гликолитический тип метаболизма и происходит их дифференцировка в клетки волокнистой соединительной и хрящевой тканей [57]. Морфологически это выглядит как массив слабоминерализованной ткани в межотломковом пространстве без признаков восстановления остеонной структуры. Последующие дистрофические изменения препятствует трансформации фиброзной ткани в пластинчатую костную ткань. Это может привести к образованию ложного сустава [24, 25].
Учитывая то, что отличительной особенностью воспалительной реакции в области диафизарного перелома длинной трубчатой кости является близость красного костного мозга - главного источника популяции нейтрофильных лейкоцитов и макрофагов - особое значение приобретают имеющиеся во взрослом организме человека анастомозы между сосудистыми сетями эпифизов, как мест локализации красного костного мозга, и диафиза. Эти анастомозы формируются и получают достаточное развитие преимущественно в эндосте после оссификации метафизарного хряща.
В связи вышесказанным, процесс восстановления сосудистой сети эндоста и/или адекватной перфузии кровью зоны перелома имеет важное значение для миграции сюда макрофагов и лейкоцитов, доставки пластических и энергетических материалов, обеспечения циркуляции биологически активных веществ, дренирования зоны повреждения. Все это исключительно важно для процесса консолидации отломков и последующей трансформации костной мозоли [65, 70]. Поэтому раннее восстановление перфузии крови в зоне перелома имеет большое значение на всех этапах формирования костной мозоли [102, 117, 159].
Недостатки существующих методов оптимизации репаративного остеогенеза и пути их совершенствования
Историю становления методов воздействия на репаративный остеогенез можно разбить на два этапа. На первом этапе происходило накопление эмпирического опыта. На втором этапе этого процесса разрабатывались уже патогенетически обоснованные методы коррекции и/или оптимизации репаративного остеогенеза.
Наиболее эффективные методы, внедренные в практику травматологии на этапе ее становления как медицинской специальности - это вся совокупность способов репозиции и иммобилизации костных отломков при переломах костей скелета, а также комплекс методов, которые сегодня можно назвать физиотерапевтическими [97]. Эффективность последних установлена эмпирически. А объяснение механизма влияния на репаративный остеогенез было получено в течение конца XX, начала XXI веков. Это группа методов температурного воздействия (парафино-, озокерито-, псаммотерапия); воздействие активных веществ биологического происхождения (мумие, алоэ, грязелечение и т.п.); принудительная оксигенация (генерализованная - в виде разных режимов гипербарической оксигенации и локальная - инъекции и/или орошение аэрированными или озонированными растворами области травматического повреждения); массаж и лечебная физкультура, воздействие колебаний ультразвукового диапазона [127, 128, 129], электромагнитных колебаний [12, 58, 106, 108, 174], лазерного излучения [56]. Этот список методов лечения, пришедших в современную медицину из эпохи накопления эмпирических данных можно продолжить. Но все их объединяет следующее: они существенно сокращают длительность восстановления целостности кости после перелома; - они одновременно действуют на несколько ключевых звеньев процесса репаративной регенерации кости; - их эффекты одновременно реализуются на разных уровнях регуляции репаративной регенерации костной ткани (генетическом, системном и местном); - в каждом случае оказывается воздействие на сосудистую систему и в большей или меньшей степени происходит снижение выраженности гипоксии в зоне перелома. Эволюция представлений об уровнях и механизмах регуляции репаративного остеогенеза вкупе с достижениями цитологии и клеточной биологии привели к тому, что в клинической практике появились патогенетически более обоснованные методы воздействия на репаративный остеогенез. Механизм позитивного влияния методов первой группы основан на механическом воздействии на кооперации клеток и волокнистого каркаса формирующейся костной мозоли. Это методы компрессионно-дистракционного остеосинтеза [6, 44, 62, 79, 102, 145, 147, 148, 151, 154, 167, 168]. Вторая группа методов основана на замещении дефекта кости аллогенными трансплантатами; с или без предварительной деминерализации; с или без применения ростовых факторов и цитокинов (МСР, оФРФ , ТКФР-fi, ТФР-В, ТцРФ, ФНО , ФРСЭ, МКБ и т.д.) [120, 131, 137, 143, 150, 171]. Третья группа методов представляет собой модификацию выше указанных способов, но в качертве трансплантата используются композитные материалы и сочетание индукторов пролиферации остеогенных клеток и индукторов минерализации костного матрикса [76, 82, 138, 150, 175]. Четвертая группа методов получила развитие в последние 10-15 лет. Сюда следует отнести все исследования на тему возможности имплантации в зону перелома стволовых клеток, взятых из разных источников (кровь пациента, красный костный мозг пациента, жировая ткань пациента, пуповинная алло- и аутокровь и т.д.). Особого внимания заслуживают попытки оптимизации репаративной регенерации костной ткани с помощью имплантации культуры стромальных стволовых клеток красного костного мозга [91, 133, 149] и т.н. «мезенхимальных» клеток [111, 125]. По-видимому, исследователи подразумевают получить существенное ускорение васкуляризации зоны повреждения и, тем самым, создать оптимальные условия для пролиферации имеющихся в зоне травмы остеогенных клеток и их дифференцировки в остеобласты. Но на развитие сосудистой сети до необходимого состояния требуется от одних до нескольких суток (в зависимости от механизма травмы и степени повреждения эндостальных и периостальных источников кровоснабжения), а инициация пролиферации остеогенных клеток начинается сразу после травмы. Поэтому главным недостатком вышеуказанных методов является отсутствие возможности обеспечения оксигенации зоны повреждения на уровне, необходимом для дифференцировки остеогенных клеток в остеобласты в течение первых нескольких суток после перелома, диафиза длинной трубчатой кости. Резюме. Таким образом, представляется перспективным исследование возможности оптимизации доставки кислорода в зону повреждения костной ткани с помощью новой группы препаратов -кровезаменителей с газотранспортной функцией за счет повышения эффективности юкставаскулярного транспорта и перфузии зоны перелома плазмой крови. Эти кровезаменители - препараты, созданные на основе перфторированных углеводородов (ПФУ), или как их таюке называют - полностью фторированные органические соединения (ПФОС).
Обоснование выбора экспериментальной модели и методика выполнения оперативного вмешательства
По данным ряда исследователей [24, 78, 83] при высокоэнергетическом переломе диафизов длинных трубчатых костей наряду с повреждением надкостницы и окружающих мягких тканей, происходит разрушение эндоста в проксимальном и дистальном отломках. Поэтому в нашем исследовании мы воспроизводили открытое повреждение диафиза бедренной кости крысы с последующим разрушением эндоста, надкостницы и окружающих мягких тканей бедренных костей.
Оперативные вмешательства и все манипуляции проводились в соответствии с «Правилами гуманного обращения с лабораторными животными» [80] под наркозом, для чего использовали 20% раствор хлоралгидрата, который вводили внутрибрюшинно в дозе 200 мкл/100 грамм веса тела животного. В интраоперационном и послеоперационном периоде всем крысам применялась антибактериальная терапия.
После отбора животных в экспериментальные группы и карантинной отсидки в условиях вивария, в асептических условиях животным под наркозом подготавливали операционное поле, для чего удаляли шерсть и затем обрабатывали кожу 96% спиртом и раствором йода.
Производили разрез кожи и .фасции по наружной поверхности правого бедра длиной 2 см. Тупым путём выделяли среднюю треть диафиза бедренной кости. С помощью портативной бормашины ортопедическим сепарационным диском распиливали диафиз бедренной кости на 2/3 его толщины. После чего производили надлом диафиза (рис. 1). На обоих отломках отслаивали надкостницу на протяжении 0,5 см. от линии перелома по всему диаметру (рис. 2). С помощью спицы Киршнера с перьевой заточкой производили разрушение эндоста глубину 0,5 см. Затем в костномозговой канал проксимального отломка
С целью предупреждения инфекционных осложнений животным вводили антибиотики в рану непосредственно перед ее ушиванием, а также на протяжении 2 суток послеоперационного периода.
Схема введения препаратов. В эксперименте использовался перфторан (ОАО НПФ «Перфторан», г. Пущино) и изотонический раствор хлорида натрия аптечного приготовления. Введение препаратов во всех группах исследования в обеих сериях эксперимента осуществлялось под наркозом и в асептических условиях. В группах с интрамедуллярным способом введения № 2, 5 (табл. 1, 2) животным производилась артротомия коленного сустава оперированной конечности. Стоматологической конусовидной фрезой наносился точечный дефект в межмыщелковой ямке на всю толщину хрящевого покрова и субхондрального слоя бедренной кости. Интрамедуллярно в дистальный метафиз через инъекционную иглу медленно вводили
Всех животных наблюдали на протяжении всего эксперимента. При общем осмотре оперированной конечности оценивали изменения кожи, состояние раны, швов, мышц, наличие деформаций, опорная функция конечности. У всех групп животных второй серии эксперимента оценивали степень сформированности костной мозоли рентгенологическим методом. Рентгенография в прямой проекции проводилась на аппарате «РДК-50/6». Расстояние между фокусом рентгеновской трубки и кассетой составляло 60 см при следующем режиме съемки: напряжение - 40 KV, сила тока - 1 ООмА, экспозиция - 0,20 сек. Морфологические методы исследования Выведение животных из эксперимента осуществлялось передозировкой наркоза. Для морфологического исследования иссекались фрагменты конечностей, включавшие зону экспериментального воздействия, с окружающими тканями. Материал фиксировался в 10% нейтральном формалине. После промывки в проточной воде проводилась декальцинация солями этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). После стандартных процедур заливки в парафин и микротомирования, срезы толщиной 10-12 мкм окрашивались по Ван-Гизон, Маллори и гематоксилин-эозином. Наличие солей кальция в костной мозоли оценивали по препаратам, импрегнированными по Коссу. В этом случае изготавливали поперечные срезы через костную мозоль без предварительной декальцинации. Наличие высокосульфатированных гликозоаминогликанов в межклеточном веществе оценивали по препаратам, окрашенным альциановым синим при рН 1.0 и 2.5. После юстировки оптической системы микроскопа Leica -СМЕ с помощью фотоаппарата Olympus SP350 были сфотографированы интересующие участки препаратов при увеличениях 100 и 400 . Морфометрию осуществляли с помощью версии свободно распространяемой программы Image-J [140] по цифровым микрофотографиям по логическим алгоритмам, приведенным в руководстве Г.Г. Автандилова (1990). Измерению подлежали: толщина костной мозоли и клеточный состав инфильтрата (в серии исследования №1). При этом полиморфноядерные лейкоциты, лимфоциты, макрофаги и плазматические клетки дифференцировали на основе кариологических признаков. Процентное соотношение указанных представителей клеточной популяции рассчитывали после подсчета 100 клеток в нескольких полях зрения при увеличении микроскопа х400, для чего использовали объектив с встроенной диафрагмой, сужающей видимое поле зрения.
Отличительные особенности репаративной регенерации костной ткани диафиза бедренной кости экспериментальных животных на сроках 15 — 60 суток наблюдения после моделирования высокоэнергетического перелома
При исследовании препаратов на малых увеличениях (х4 — х20) в этой группе животных обращает на себя внимание малая толщина формирующейся внутренней костной мозоли, и слабая выраженность наружной мозоли на всех сроках наблюдения. Вокруг мозоли обнаружена выраженная соединительнотканная капсула, консолидированная с периостом проксимального и дистального отломков и имеющая такую же толщину (рис. 18). Нарушения геометрии диафиза в области перелома минимальны в этой группе по сравнению с другими группами в этой серии исследования. В препаратах межотломковой зоны на 30 сутки после моделирования перелома обнаруживается сформированная костная мозоль, построенная из волокнистой костной ткани, пучки которой строго ориентированы. На больших увеличениях обнаружено, что процесс преобразования хряща в молодую кость наиболее отчетливо выявляется на концах костных спикул, непосредственно обращенных к зоне перелома (рис. 19). На препаратах, окрашенных по Маллори (рис. 20) обнаруживаются равномерно распределенные в объеме внутренней костной мозоли очаги минерализации. На 45 сутки в большинстве препаратов межотломковое пространство занято молодой костной тканью с островками омеленного хряща. Анализ данных, представленных на гистограмме (рис.21) показывает, что межотломковое расстояние минимально в группе животных, которым перфторан вводился интрамедуллярно. Тем не менее, величина этого параметра плавно увеличивается с увеличением срока наблюдения после экспериментального воздействия, и начиная со срока 30 суток после моделирования перелома эти отличия становятся статистически значимыми по сравнению с контролем и сроком наблюдения 45 суток при р 0.05 в этой серии исследования. Анализ и сравнение препаратов в группе эксперимента с внутрибрюшинным введением перфторана после моделирования высокоэнергетического перелома показали, что на 15-сутки после экспериментального воздействия толщина мозоли достоверно меньше по сравнению с контрольной группой (рис. 22). На 21-е сутки имеет место утолщение костной мозоли с одновременным увеличением в объеме наружной костной мозоли (рис. 23).
Следует полагать, что это следствие задержки перехода пролиферативной фазы воспалительного процесса в зоне перелома в фазу ремоделирования. Тем не менее, уже на 30-сутки после экспериментального воздействия толщина мозоли достигает значений 0.296±0.0916 мм, что статистически достоверно меньше, чем в контрольной группе на любом сроке и также по сравнению с 15 и 21 сутками в этой группе животных. Обращает на себя внимание, что на 21 сутки основной объем мозоли состоит из пучков коллагеновых волокон, между которыми располагаются группы хондроцитов и остеогенных клеток различной степени дифференцировки. Относительная бедность клеточными элементами в центральных отделах мозоли компенсируется участками выраженной пролиферации остеогенных клеток без четких границ, располагающихся в основном периваскулярно на периферии мозоли (рис. 24, 25А). Рис. 25. Состояние внутренней костной мозоли в группе животных с внутрибрюшинным введением перфторана (2-я серия эксперимента) на 21-е сутки (А) и 30-е сутки (Б) после моделирования перелома. Окраска по Ван-Гизон. Увеличение- XI00 На 30-е сутки после экспериментального воздействия в этой группе исследования отмечается не только уменьшение толщины внутренней мозоли в два раза по сравнению с предыдущим сроком наблюдения, но и четкая консолидация отломков без существенной деформации в зоне перелома. Пучки коллагеновых волокон из мозоли ассоциированы в коллагеновыми волокнами в костных балках (рис. 25Б). Анализ данных, полученных при морфометрическом исследовании препаратов в группе эксперимента с введением перфторана в межотломковую зону после моделирования высокоэнергетического перелома показал, что на 15-сутки после экспериментального воздействия толщина мозоли не отличается от контрольной группы (рис. 26) и составляет 0.53±0.119 мм. На 21-е сутки толщина костной мозоли уменьшается до значений 0.345±0.135 мм, что статистически достоверно меньше чем на этом же сроке после экспериментального воздействия в контрольной группе животных и в группе с внутрибрюшинным введением препарата. На 30-е сутки эксперимента в межотломковой зоне обнаруживается грубая волокнистая костная ткань с очагами обызвествленной хрящевой ткани (рис. 27).
