Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Современные аспекты молекулярной организации нейтрофилов 11
1.1.1. Особенности морфологии и функционирования нейтрофилов 11
1.1.2. Строение и функции мембран нейтрофильных лейкоцитов 19
1.2. Молекулярные основы проявления реактивности нейтрофилов 21
1.2.1. Роль snare гипотезы в ходе регулируемого экзоцитоза гранул нейтрофилов 21
1.2.2. Молекулярные основы фагоцитоза 26
1.3. Активация нейтрофилов 33
1.3.1. Структурно-функциональные основы транспортных систем нейтрофилов 33
1.4. Изменение реактивности нейтрофилов под влиянием эндотоксинов при бронхолегочных заболеваниях 35
1.5. Влияние мембранотропных эндотоксинов на деструктивные изменения нейтрофилов при бронхолегочных заболеваниях и их коррекция 5 низкоэнергетическим гелий-неоновым лазером и антиоксидантными препаратами 40
2. Материал и методы исследования
2.1. Объект исследования 54
2.2. Методы исследования 56
3. Реактивные изменения нейтрофилов при бронхолегочных заболеваниях 75
3.1. Нейтрофилы и их морфофункциональная организация 75
3.2. Влияние эндотоксинов на фагоцитарные реакции при бронхолегочных заболеваниях 90
3.3. Роль апоптоза и некроза нейтрофилов в реактивных и деструктивных процессах 133
4. Коррекция процесса фагоцитоза различными дозами низкоэнергетического гелий-неонового лазера 156
5. Влияние антиоксидантных препаратов на нейтрофилы при развитии антиоксидантного стресса 198
6. Обсуждение результатов исследований 219
Выводы 256
Научно-практические предложения по использованию результатов исследования 258
Список литературы 259
- Особенности морфологии и функционирования нейтрофилов
- Роль snare гипотезы в ходе регулируемого экзоцитоза гранул нейтрофилов
- Изменение реактивности нейтрофилов под влиянием эндотоксинов при бронхолегочных заболеваниях
- Влияние эндотоксинов на фагоцитарные реакции при бронхолегочных заболеваниях
Введение к работе
Актуальность исследований. Созданное И. И. Мечниковым учение о фагоцитозе и высоко оценимое наукой, за последние десятилетия получило дальнейшее развитие, связанное с успехами молекулярной биологии. Большой вклад в углубление фагоцитарной теории внесли работы отечественных и зарубежных ученых - А. А.Богомольца, А. Д. Сперанского, А. Д. Адо, А. Н. Маянского, Р. И. Сепиашвили, Р. В. Петрова, Б. В. Пинегина, D. F. Bainton, J. Н. Brumell, N. Borregaard, Т. A. Sollner, М. Chignard, D. Pidard (1975 - 2006 гг.)
Иммуногистохимические, электронно-микроскопические, молекулярно-биологические методики позволили значительно расширить представления о фагоцитирующих клетках. Нейтрофилы обладают мощной бактерицидной системой, изучение которой постулировано открытием De Duve (1963) клеточных лизосом, обеспечивающих биохимические механизмы фагоцитоза. Большая роль принадлежит исследованиям, посвященным процессам гранулопоэза, функциям отдельных гранул нейтрофилов и изучению апоптоза в процессе фагоцитоза (Серов В. В., Пауков В. С, 1995; Маянский А. Н., 1995; 1997; Сосунов А. А., Кругляков П. П., 1996; Певницкий Л. А., 1996; Ярилин А. А., 1998; Набокина С. М., 2001; Пыцкий В. И., 2001; Адо А. Д., 2002; Авдеева М. Г., Шубич М. Г., 2003; Маянский А. Н., 2004; Bianchi S. М., Dockrell D. Н., Renshaw S. А. 2006; Moraes Т. J., Zurawska J. Н., Downey G. P., 2006).
Исследование реактивности нейтрофилов, ее причин, молекулярных механизмов относится к фундаментальным проблемам биологии клетки. Велико значение этой проблемы не только для биологии, но и для практической медицины, постановки правильного диагноза, контроля за эффективностью лечения, профилактики болезней. Изучение общебиологических закономерностей реализации повышения реактивности нейтрофилов, безусловно, является приоритетным направлением (Маянский А. Н., Пикуза О. И., 1993; Галанкин В. Н. и соавт., 1994; Sengelov Н. et al., 1995; Nabokina S. M. et al., 1997; Галкин А. А. и соавт., 1997; Белова Л. А., 1997; Бахов Н. И.,
7 2000; Хаитов Р. М., Пинегин Б. В., 2000; Герасимов И. Г., Калуцкая О. А., 2000; Долгушин И. И., Бухарин О. В., 2001; Jones Н. А., 2005; Louis R., Djukanovic R., 2006; Janardhan К. S. et al., 2006).
Проблема эндотоксикоза в настоящее время занимает одно из ведущих мест в развитии различных заболеваний (Киселева Р. Е., Кузьмичева Л. В., 1986; Альба Д. Л., 1994; Грызунов Ю. А., 1994; Малахова М. Я., 2000; Добротина Н. А., 2004; Кузьмичева Л. В., 2005; Федотова Г. Г., 2006). Синдром эндогенной интоксикации относится к числу наиболее распространенных. Его проявления, несмотря на различную этиологию, имеют общие патогенетические механизмы. С помощью количественного и качественного определения эндотоксинов детектируются соединения химической и биологической природы, обладающие мембранотропным действием. К настоящему времени накоплен обширный материал о структуре иммуно-компетентных клеток при различных заболеваниях. Однако, исследования по влиянию мембранотропных эндотоксинов на них, являются во многом фрагментарными и не дают полной картины морфофункциональных изменений. Практически отсутствует сравнительный анализ различных ультраструктурных особенностей лизосомального аппарата клетки в процессе фагоцитоза.
Наиболее общим и, вероятно, пусковым звеном в развитии эндотоксикоза при бронхолегочных заболеваниях является деструкция клеточных мембран, связанная с гипоксией. Накопление эндотоксинов свидетельствует о наличии воспалительного очага и предрасположенности к хронизации патологии. Комплекс токсических веществ, запускающих патологические процессы, характеризует степень и глубину дисфункции структур организма на клеточном уровне.
Реактивные свойства нейтрофилов в стадии апоптоза, эндотоксикоза, при действии низкоэнергетического гелий-неонового лазера (НЭГНЛ), применении лекарственных препаратов (димефосфона и мексидола) не изучены. Универсальность действия НЭГНЛ обусловлена влиянием на клеточный уровень регулирования и поддержания гомеостаза: изменение метаболи-
8 ческой и энергетической активности клеточных структур. При возникающих нарушениях этих механизмов, являющихся истинной причиной многих заболеваний, НЭГНЛ корректирует стратегию адаптации организма на всех уровнях гомеостаза.
Внимание клиницистов привлекают работы фармакологов, теоретически и экспериментально обосновавших возможность безопасного и эффективного воздействия на первичные звенья воспалительного процесса препаратов с антиоксидантными, энергообеспечивающими, противогипоксическими свойствами (Смирнов Л. Д., 1992; Балашов В. П., 1994; Воронина Т. А. и соавт., 1995; Цибулькина В. Н.,1999; Инчина В. И., 2001; Esper А. М, Martin G. S., 2005; Nagata М., 2005).
Цель исследования - выяснение общих закономерностей морфофунк-ционального состояния нейтрофилов при бронхолегочных заболеваниях, а также проведение сравнительного анализа структурно-гистохимических особенностей фагоцитоза под действием эндогенной интоксикации.
Задачи исследования:
Изучить гистохимическими и иммунопатологическими методами нейтрофилы крови человека и влияние эндотоксинов на фагоцитарные реакции при бронхолегочных заболеваниях (бронхит, пневмония, бронхиальная астма).
Исследовать роль апоптоза и некроза нейтрофилов в реактивных и деструктивных процессах.
Изучить морфофункциональные изменения в нейтрофилах, характеризующиеся деструктивными процессами и их коррекция низкоэнергетическим гелий-неоновым лазером.
Изучить структурно-функциональную организацию мембран нейтрофилов при бронхолегочных заболеваниях и коррекция их димефосфоном и мексидолом.
Научная новизна исследования. Впервые выявлены общебиологические закономерности морфологической и гистохимической организации
9 нейтрофилов, выяснена роль лизосом в процессе фагоцитоза, а также митохондрий в процессах энергогенеза при эндотоксикозе и апоптозе. Гранулярные люминесцирующие клетки быстро реагируют на незначительные изменения в содержании эндогенных токсинов. Становление гистохимической активности в стимулированных нейтрофилах следует закономерной динамике - вначале продукт реакции находится в ядре, затем в мембранах эндоплазматического ретикулума, лизосомах, митохондриях и на плазматической мембране, о чем свидетельствует люминесцентно-гистохимический анализ. Установлено наличие среди нейтрофилов мелко- и крупногранулярных клеток, обладающих различной ферментативной активностью. Установлена взаимосвязь между активностью кислой фосфатазы и щелочной фосфатазы, а также кислой фосфатазы и миелопероксидазы под влиянием низкоэнергетического гелий-неонового лазера в процессе фагоцитоза. Впервые установлено влияние эндотоксинов при бронхолегочных заболеваниях на митохондрии нейтрофилов, которые сочетают хорошо известные метаболические функции с участием в регуляции апоптоза. Наиболее эффективным средством, оказывающим свое позитивное воздействие на нейтрофилы, является димефосфон. Препарат увеличивает общую антиоксидантную активность и значительно угнетает интенсивность перекисного окисления липидов, в результате чего происходит регенерация мембранного аппарата клетки. Впервые показано, что мексидол является ингибитором свободнорадикальных реакций, протекающих в нейтрофилах, изменяет структурно-функциональное состояние мембран, липид-белковые взаимосвязи, функции рецепторов и мембраносвязанных ферментов. Показана роль антиоксидантного стресса в деструктивных реакциях нейтрофилов, выражающаяся в изменении мембранного аппарата и гранулообразования при бронхолегочных заболеваниях, коррекция за счет стимуляции низкоэнергетическим гелий-неоновым лазером и использования лекарственных препаратов. Впервые исследовано содержание биогенных аминов в крови и форменных элементах при бронхолегочных
10 заболеваниях в развитии эндогенной интоксикации в острую фазу патологического процесса.
Теоретическая и практическая значимость исследования. Данная работа является фундаментальным исследованием, результаты которой существенно расширяют представления о структурной организации нейтро-филов в норме и выявляют общебиологические закономерности в процессе развития фагоцитоза, в связи с комплексным изучением динамики реактивных реакций, вызванных эндотоксинами мембранотропного действия и коррекции их НЭГНЛ и антиоксидантными препаратами.
Результаты исследований позволили углубить, расширить сведения о морфологических, ультраструктурных и биохимических характеристиках нейтрофильных лейкоцитов. Доказано влияние эндотоксинов на нейтрофилы в фазу обострения и ремиссии в различных этиологических группах заболеваний. В процессах деструкции неЙтрофилов существенную роль играют продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ). Впервые разработана технология влияния мембранотропных эндотоксинов на процесс фагоцитоза при бронхолегочных заболеваниях. Установлено, что наиболее эффективными для повышения реактивности нейтрофилов оказались дозы облучения НЭГНЛ 6,0 Дж/см и 18,0 Дж/см . Разработан рост прогнозирования заболевания по альбумину. Полученные результаты используются в учебном процессе и практической медицине.
Положения, выносимые на защиту
Механизмы действия мембранотропных эндотоксинов на нейтрофилы в норме при различных формах бронхолегочных заболеваний.
Роль апоптоза и некроза нейтрофилов в реактивных и деструктивных процессах.
Характеристика терапевтического действия низкоэнергетического гелий-неонового лазера на нейтрофилы при эндотоксикозе.
Особенности действия лекарственных препаратов (димефосфона и мексидола) на нейтрофилы при развитии антиоксидантного стресса.
Особенности морфологии и функционирования нейтрофилов
Количество нейтрофилов в крови здоровых взрослых людей относительно постоянно. Оно составляет 2000-5500 в 1 мкл (47 - 72 % по отношению к общему количеству лейкоцитов) для сегментоядерных и 40 -300 в 1 мкл (1 - 6 %) для палочкоядерных элементов. Минимальное количество нейтрофилов в крови наблюдается у детей в конце первого года жизни, после чего оно начинает постепенно возрастать и к 13 - 15 годам достигает значений, свойственных взрослым. В последующие годы жизни число нейтрофилов существенно не изменяется. Кинетика нейтрофилов количественно описывает их движение и распределение в основных компарт-ментах: костном мозге, крови и тканях (Хаитов Р. М., Пинегин Б. В., 1995; Галкин А. А. и соавт., 1997). Время их нахождения в костном мозге составляет 13-15 суток. Для нейтрофилов костный мозг - это депо, где сосредоточен огромный резерв зрелых нейтрофильных гранулоцитов, готовых выйти в кровеносное русло. Клетки, покинувшие костный мозг, назад в него не возвращаются. Почти половина нейтрофилов крови свободно циркулирует в ней, а другая половина прилипает к поверхности эндотелия сосудов; адгези-рованные нейтрофилы могут возвращаться в кровь. Однако, в конечном счете, все они уходят в ткани, оттуда назад уже не рециркулируют. Время их жизни в тканях от нескольких часов до 7 сут (в норме в среднем 1-2 сут).
Клетка зрелого палочкоядерного нейтрофила имеет размеры 10-15 мкм. В цитоплазме этих лейкоцитов, которая занимает большую площадь клетки, расположено ядро, имеющее форму палочки, буквы S, подковы. Для отличия от метамиелоцита, имеющего довольно большое подковообразное ядро, следует обратить внимание на то, что ядро нейтрофила неодинаково по ширине - в нем самая узкая часть меньше 2/3 самой широкой части. Размеры клетки, цитоплазма и зернистость сегментоядерного нейтро-фила практически ничем не отличаются от палочкоядерного нейтрофила. Отличительным признаком данных лейкоцитов является ядро. Оно полиморфное, имеет разные формы в виде свернутого жгута с утолщениями и перетяжками в различных местах, иногда настолько глубокими, что ядро представляется разделенным на отдельные сегменты, соединенные тонкими перемычками. Это и дало название данному виду лейкоцитов. Цитоплазма заполнена гранулами различного типа.
В зрелых клетках присутствуют гранулы, которые окрашиваются различными красителями и отражают процесс эволюции. Вначале появляются азурофильные, а затем специфические гранулы. Для изучения компонентов гранул были использованы электронно-микроскопические подходы с применением цитохимических методик, позволяющих производить окрашивание ферментов, связанных с гранулами. Оказалось, что азурофильные гранулы, формируемые на стадии промиелоцитов, содержат пероксидазу. Эти гранулы не утрачиваются в ходе созревания и присутствуют в зрелых нейтрофилах. Появление нейтрофилии в ранних миелоцитах отражает образование второго типа гранул, которые являются пероксидаза-негативными, а по своей численности более чем в два раза превышают азурофильные гранулы. Термины первичные и вторичные гранулы в настоящее время используют для обозначения популяции пероксидаза-позитивных и пероксидаза-негативных гранул, соответственно, с целью подчеркнуть очередность появления этих гранул в клетках-предшественниках нейтрофилов (Mollinedo F. et al, 1991; НабокинаС.М.,2001).
Электронно-микроскопические данные показывают, что гранулы обоих типов имеют мембрану, ограничивающую содержимое гранул от цитоплазмы. Мембрана имеет триламинарную структуру, хотя вторичные гранулы более мелкие и плеоморфные по сравнению с первичными гранулами, ультраструктурная морфология обнаруживает значительные различия между двумя типами гранул. Причем, эти различия могут быть выявлены в зрелых клетках только при помощи цитохимических методик (Bainton D. F., 1987; Borregaard N. et al., 1993; Набокина С. М., 2001).
Гранулы формируются в области аппарата Гольджи. В зрелых нейтро-филах гранулопоэз не происходит, что подтверждается редукцией в этих клетках гранулярного эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи, уменьшением числа митохондрий.
Первичные гранулы по набору ферментов являются типичными лизо-сомами. Они содержат разнообразные гидролитические ферменты с оптимумом активности при низких значениях рН (кислую фосфатазу, В-глюку-ронидазу и т. д.). Лизосомы характеризуются высоким содержанием миело-пероксидазы, на долю которой приходится около 1 - 5 % сухого веса нейтро-филов. В лизосомах идентифицировано большое количество основных (ка-тионных) белков, кислых мукополисахаридов. Многие из этих соединений обладают четкой биологической активностью. К числу этих соединений относятся лизоцим (около 1/3 всего лизоцима нейтрофилов), белки, обладающие бактериостатическими и бактерицидными свойствами (Пигаревский В. Е., 1982; Манько В. М., Хаитов Р. М., 1987; Bainton D. F., 1995).
Вторичные гранулы представляют собой типичную специфическую зернистость нейтрофилов, в состав которой входят гликоген, липиды, ряд ферментов, в частности щелочная фосфатаза. Вторичные гранулы, как и лизосомы, содержат лизоцим (Borregaard N., 1988).
Использование высокоразрешающих методов субклеточного фракционирования, электрофоретических методов, а также иммуноэлектронной микроскопии привело к обнаружению значительной гетерогенности в популяции как пероксидаза-позитивных, так и пероксидаза-негативных гранул, а также к идентификации еще одного типа внутриклеточных секреторных органелл, названных секреторными везикулами (Borregaard N., 1996).
Роль snare гипотезы в ходе регулируемого экзоцитоза гранул нейтрофилов
В настоящее время феномен экзоцитоза вновь привлекает к себе внимание исследователей. Известное лизирующее действие полиморфно-ядерных лейкоцитов на омертвевшие ткани объясняют выходом гранул из разрушающихся нейтрофилов, что позволяет говорить о них как о секреторных клетках с голокриновым типом секреции. Некоторые данные свидетельствуют о том, что нейтрофилы выделяют во внеклеточную среду свой секрет путем экзоцитоза и без разрушения клеток, т. е. до некоторого момента секреция не сопровождается разрывами клеточной мембраны -происходит секреция по мерокриновому типу (Nabokina S. М. et al., 1997).
Накопленный экспериментальный материал обобщен в модели слияния мембран - SNARE гипотезы (Т. A. Sollner, 1993). Эта гипотеза, впервые предложенная для экзоцитоза синаптических пузырьков, по-видимому, носит общебиологический характер и справедлива как для конститутивного, так и регулируемого слияния мембран. Известно, что слияние клеточных мембран может происходить постоянно, например, при перемещении транспортных везикул из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи, и такой процесс носит название конститутивной секреции. Напротив, при экзоцитозе слияние мембран строго регулируется, и мембрана секреторной везикулы сливается с плазмалеммой только при получении определенного сигнала.
SNARE гипотеза основана на взаимодействии цитозольных белков NSF (N-ethylmaleimide-sensitive factor) и SNAP (soluble NSF attachment protein) с их рецепторами, названными SNARE (от сочетания английских слов SNAP RECEPTOR). Под термином SNARE традиционно объединяют три группы белков: синтаксины, синаптобревины/VAMP (vesicle-assciated membrane protein) и SNAP-25 (synaptosome-assciated protein of 25 kDa) (Schiavo G. et al., 1995; 1997).
Комбинация методов субклеточного фракционирования и иммуно-цитохимических методов позволила установить наличие VAMP-иммуно-реактивных белков в гранулах различных клеток с регулируемым типом секреции. Эти белки идентифицированы в специфических гранулах нейтро-филов человека (Brumell J. Н. et al., 1995; McMahon H. Т. et al., 1993; Chin A. C. et al., 1993). В нейтрофилах человека обнаружено два представителя белкового семейства VAMP: VAMP-1 и VAMP-2.
VAMP-1 присутствует, главным образом, в мембранах пероксидаза-негативных гранул, легко мобилизуемых при стимуляции нейтрофила к секреции, и в незначительных минорных количествах в крайне слабо мобилизуемой популяции азурофильных гранул (Набокина С. М., 2001). Результаты определения внутриклеточной локализации VAMP-1 в нейтрофилах человека позволяют предположить, что этот белок участвует в процессах регулируемого экзоцитоза в нейтрофилах, в частности в секреции желатиназных специфических гранул. Присутствующая в нейтрофилах человека VAMP-2 ассоциирована, главным образом, с внутриклеточными гранулами, способными к регулируемому экзоцитозу.
Известно, что нейтрофилы являются короткоживущими клетками, продолжительность жизни которых еще более укорачивается при активации к секреции (Sengelov Н. et al., 1995). В такой ситуации круговорот внутриклеточных гранул посредством эндоцитоза не требуется и, следовательно, нет необходимости и в присутствии селлюбревина, белка, опосредующего эндоцитоз. В нейтрофилах человека был идентифицирован представитель семейства синтаксинов - синтаксин 4 (Brumell J. Н. et al., 1995).
В клетках, способных к регулируемому экзоцитозу, синтаксины, как правило, ассоциированы с плазматической мембраной. Результаты исследования показали, что нейтрофилы человека экспрессируют широкий набор различных синтаксинов, а именно синтаксины 1А, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11 и 16 (Whiteheart S. W., Kubalek Е. М., 1995; Martin-Martin В. et al., 1999).
Предполагается, что SNAP-25 участвует в транслокации GLUT4 по типу регулируемого экзоцитоза. С. М. Набокиной удалось обнаружить SNAP-25-иммунореактивную полосу во фракции, содержащей мембраны внутриклеточных гранул нейтрофилов (Nabokina S. М. et al., 1997). В нейтрофилах, индуцированных к экзоцитозу, наблюдается существенное перераспределение SNAP-25 между мембранными структурами клетки. При этом белок появляется во фракциях, соответствующих плазмалемме, в то время как его уровень во фракциях, обогащенных пероксидаза-негативными гранулами, снижается (Mollinedo F. et al., 1991; Tagaya M. et al., 1995).
Активация носит сложный характер, так как большинство раздражителей возбуждают клетку по разным каналам, запуская несколько реакций. Этим, например, объясняется то, что хемотаксису сопутствуют активация кислородного метаболизма, секреторная дегрануляция, усиление адгезии, хотя каждый из этих феноменов можно воспроизвести автономно (Маянский А. Н., Галиуллин А. Н., 1984).
Из многообразия лигандных молекул, воспринимаемых фагоцитами и обеспечивающими их подключение к реакциям иммунитета, в первую очередь, относят IgG и производные комплемента, которые создают условия для опсонической кооперации, повышая эффективность фагоцитоза. В связи с этим не случайно, что фагоциты располагают набором рецепторов для производных различных компонентов комплемента (С1, СЗ, С5, Н), реагируя на малейшие сдвиги в этой важнейшей медиаторной системе (Hoogerwerf М. etaL, 1990).
Изменение реактивности нейтрофилов под влиянием эндотоксинов при бронхолегочных заболеваниях
Процесс перехода клетки из одного состояния в другое (покой -возбуждение - покой) сопровождается изменением электролитного баланса. Изменение содержания воды и объема клетки всегда противоположно по направлению изменения трансмембранной разности электрических потенциалов. Содержание воды в клетке и ее объем увеличиваются, если разность потенциалов (потенциал покоя) уменьшается, и, наоборот, уменьшаются при увеличении разности потенциалов. Изменение электрического заряда всегда ведет к одинаковым по направлению изменениям объема клетки и трансмембранной разности потенциалов.
Транспорт ионов осуществляется натриевым, кальциевым, протонным и анионным насосами (Мартиросов С. М., 1981; Трошин А. С, 1985; Болдырев А. А., 1990; Бессонов Б. И., Буцук С. В., 1991).
Натриевый, или Na-K-АТФ-азный насос обеспечивает откачивание трех ионов Na+ из клетки взамен на поступающие в нее два иона К+; при этом затрачивается энергия гидролиза одной молекулы АТФ. Na-K-АТФ-аза является мембрано-связанным ферментом и рассматривается как составная часть натрий-калиевого насоса.
Более устоявшиеся представления о долгосрочных механизмах регуляции мембранных ферментов связывают характер их функционирования с микровязкостью липидного окружения и значит, с липидным и жирнокис-лотным составом клеточных мембран. В связи со сложными механизмами компенсации жидкостности липидного окружения, наличием противоположно направленных факторов (например, содержание холестерина, индексом ненасыщенности жирнокислотных цепей в составе мембранных липи-дов) проще бывает оценить состояние мембраны по упорядоченности мембранного бислоя. Как правило, отмечается явная обратная корреляция между микровязкостью мембранных структур и активностью Na-K-АТФ-азы, входящей в их состав (Орлов С. Н., Гурло Т. Г., 1991; Болдырев А. А., 1992).
А. А. Верениновым и соавторами (1991) установлены некоторые зависимости: 1) увеличение константы скорости переноса калия и натрия noNa-К-АТФ-азному тракту при прочих равных условиях увеличивает отношение K+/Na+, разность электрических потенциалов на мембране уменьшает объем клетки (содержание воды) и суммарное содержание калия и натрия; 2) увеличение константы скорости переноса натрия по градиенту электрохимического потенциала, т. е. увеличение коэффициента проницаемости мембраны для Na+, изменяет перечисленные показатели в противоположном направлении; 3) изменением транспорта ионов через мембрану нельзя поднять разность потенциалов на мембране выше определенного значения, величина которого определяется доннановскими факторами: величиной внутриклеточного электрического заряда, приходящегося на единицу осмотической активности внутриклеточного материала, и ионным составом окружающей клетку среды; 4) существуют условия, при которых разность потенциалов на мембране и объем клетки сильно зависят от транспорта ионов через мембрану, и условия, при которых изменение кинетических параметров мало влияет на разность потенциалов; 5) активный транспорт всегда "электрогенен", если иметь ввиду его влияние на разность потенциалов в условиях стационарного распределения ионов. При изменении кинетических параметров в рассматриваемой модели увеличению разности потенциалов всегда сопутствует уменьшение объема клетки, и наоборот. Обмен клеточного калия на натрий среды наблюдается лишь при повреждении клеток (Орлов и соавт., 1992).
Свободный Са является регулятором разнообразных внутриклеточных процессов. Стимуляция респираторного взрыва в нейтрофильных гранулоцитах приводит к перераспределению внутриклеточного Са2+ с увеличением содержания свободного катиона (Левицкий Д. О., 1990).
В бактерицидной функции нейтрофильных гранулоцитов принципиаль 35 ное значение имеет внутриклеточное распределение ионов кальция. Продукция нейтрофильными гранулоцитами бактерицидных веществ может быть опосредована способностью адениловых нуклеотидов (АТФ, АДФ) модифицировать уровень внутриклеточного Са (Асланиди К. Б. и соавт., 1997). Перераспределение кальция в нейтрофильных гранулоцитах способствует усилению продукции супероксида в ответ на воздействие арахидоновой кислоты. Однако внеклеточный кальций не участвует в высвобождении продуктов перекисного окисления липидов. Присутствие внеклеточного кальция необходимо для выполнения клеткой экзоцитоза, однако в этом случае дефицит Са может быть возмещен ионами магния, бария, стронция.
Клетки, обладающие высокой скоростью обновления молекул, характеризуются высокой степенью фагоцитоза. Нейтрофилы в процессе фагоцитоза не снижают способности транспортировать аминокислоты и нуклео-тиды, даже при условии, когда 50 % клеточной поверхности интернированы внутрь клетки (Болдырев А. А., 1992).
Влияние эндотоксинов на фагоцитарные реакции при бронхолегочных заболеваниях
Световая микроскопия Определение жизнеспособности клеток (Меньшиков В. В., 1987). В
иммунологических реакциях участвуют только живые клетки. В пробирку вносили 0,1 мл взвеси нейтрофилов (2 106 клеток в 1 мл), добавляли 1 каплю 0,2 % раствора трипанового синего. Суспензию оставляли на 30 сек при комнатной температуре, затем под микроскопом в камере Горяева учитывали результат. Живые нейтрофилы остаются бесцветными, а погибшие клетки окрашиваются. Жизнеспособность клеточной суспензии, используемой в эксперименте, составила 95 - 98 %.
Электронная микроскопия. Ультраструктуру лейкоцитов и процесс фагоцитоза исследовали на электронограммах, полученных на электронных микроскопах ЭМВ-ЮОБ и ЭМ-125 в лаборатории электронной микроскопии. Препараты для электронного микроскопирования готовили по традиционной методике: к суспензии отмытых клеток добавляли взвесь бактерий Staphilococcus aureus в концентрации 5 млрд. микробных клеток в 1 мл. После совместной инкубации в течение 60 мин 0,5 мл клеточной суспензии заливали 2 мл 3 % глутарового альдегида, приготовленного на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4). Фиксацию проводили в пластмассовых пробирках диаметром 0,7 см на холоде с последующим хранением в течение 12 часов (t + 4С).
По окончании фиксации взвесь центрифугировали до получения плотного осадка при 1740 об/мин в течение 10 мин. Затем удаляли надосадочную жидкость и промывали клеточный осадок в 0,15 М фосфатном буфере (рН 7,4) 3 раза по 30 мин на холоде. Дофиксация проводилась в 1 % растворе осмиевой кислоты на 0,2 М фосфатном буфере в течение 1 часа. Материал обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации (50 %, 70 %, 96 %, 100 %), а затем в ацетоне и заливали в эпон-аралдит по общепринятой методике. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме Ultracut и контрастировали цитратом свинца и уранилацетатом. Полученный материал просматривали в электронный микроскоп ЭМ-125.
Гистохимические методы исследования
Определение фагоцитарной активности нейтрофилов (Медведев А. Н., Чаленко В. В., 1991). Исследование фагоцитарной активности нейтрофилов проводили по традиционной технике, основанной на определении с помощью светового микроскопа положительной и переваривающей способности нейтрофилов крови по отношению к микробной тест-культуре после их совместной инкубации.
Для приготовления микробной взвеси с косого агара с суточной культуры стафилококка физиологическим раствором (4-5 мл) смывали колонии микробов и разводили микробную взвесь 1 млрд. микробных клеток в 1 мл (10 микробов на 1 мл). Взвесь убитой культуры стафилококка стандартизировали на ФЭКе при зеленом светофильтре в кюветах с толщиной 1 см.
Лейкоцитарную взвесь (0,3 мл) соединяли с микробной взвесью (0,1 мл) и инкубировали в течение 30 мин в термостате при температуре 37С. По окончании инкубации содержимое пробирки центрифугировали и из осадка готовили мазки, которые высушивали на воздухе при комнатной температуре, фиксировали метанолом 3 мин и окрашивали по Романовскому-Гимзе азур-эозином 45-50 мин, ополаскивали в проточной воде. Полученные препараты микроскопировали под иммерсией с увеличением 10x90. Микробы окрашивались в темно-малиновый цвет и хорошо контурировались.
При анализе данных учитывали процент фагоцитирующих нейтрофилов: фагоцитарный индекс (ФИ) по Гамбургеру - процент клеток, вступивших в фагоцитоз, от общего их числа; фагоцитарное число (ФЧ) по Райту - общее количество захваченных микробов, деленное на число фагоцитирующих клеток.
Определение функциональной активности нейтрофилов по НСТ-тесту (Park В. Н. et al., 1968). Принцип метода основан на восстановлении поглощенного фагоцитом растворимого красителя нитросинего тетразолия (НСТ) в нерастворимый диформазан. НСТ-тест характеризует кислород-зависимые антиинфекционные системы фагоцитоза. В центрифужные пробирки, содержащие 0,05 мл раствора гепарина, вносили 0,1 мл крови и после перемешивания добавляли 0,05 мл продигиозона для стимуляции клеток. Затем вносили 0,05 мл раствора НСТ и инкубировали 30 мин при 37С, повторяя перемешивание каждые 5 мин. После инкубации пробирки центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, осадок ресуспендировали в остатке жидкости, готовили мазки, которые после высушивания на воздухе, фиксировали метанолом 5 мин. Окраску проводили нанося на стекла 5-7 капель красителя для НСТ-теста и после выдерживания в течение 5 мин добавляли такое же количество дистиллированной воды, после чего выдерживали в течение 30 мин, промывали, высушивали и микроскопировали. Полученные препараты просматривали в световом микроскопе с иммерсией (ув. 900).
