Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Культивирование кератиноцитов
1.2. Дифференцировка кератиноцитов .
1.3. Эпителиально-мезенхимные отношения
1.4. Факторы роста
1.5. Стволовые клетки эпидермиса
1.6. Процесс восстановления кожного покрова
1.7. Трансплантация выращенных в культуре кератиноцитов .
1.8. Реконструкция кожного покрова .
ГЛАВА 2. Материалы и методы
Глава 3. Моделирование механизмов раневого заживления in vitro
3.1. Закономерности культивирования эпидермальных кератиноцитов кожи человека
3.2. Миграция колоний эпидермальных кератиноцитов в культуре
3.3. Взаимодействие эпидермальных кератиноцитов и фибробластов в живом эквиваленте кожи in vitro
3.4. Разработка модели регенерации эпидермиса in vitro и изучение клеточных субпопуляций кератиноцитов .
3.5. Заключение .
ГЛАВА 4. Восстановление кожных покровов с использованием аллогенных клеточных трансплантатов
4.1. Разработка метода культивирования и трансплантации клеток кожи на поверхности микроносителей .
4.2. Клиническая оценка эффективности применения модифицированного дермального эквивалента
4.3. Применение выращенных аллогенных эпидермальных пластов для реконструкции кожных покровов .
4.4. Иммуногистохимическое исследование механизмов репарации ран под влиянием аллогенных эпидермальных трансплантатов .
ГЛАВА 5 Восстановление дефектов роговицы с использованием аллогенных клеточных трансплантатов 189
5.1. Изучение возможностей культивирования клеток эпителия роговицы различных животных 189
5.2 Сравнительные результаты динамики заживления ожогового дефекта роговицы при трансплантации СЭ в ранние сроки после травмы 194
5.3. Сравнительные результаты динамики заживления при трансплантации СЭ на сформировавшуюся десцеметоцеле и язву роговицы 203
5.4. Морфологическое изучение репарации ожогового дефекта роговицы после трансплантации стромального эквивалента 211
5.5. Иммуногистохимическое изучение репаративной регенерации ожогового дефекта роговицы после трансплантации стромального эквивалента 226
5.6. Обсуждение результатов иммуногистохимического анализа 236
5.7.Эффективность применения клеточных трансплантатов в лечениии больных с дефектами роговицы различной этиологии 242
ГЛАВА 6 Разработка методов восстановления объемных тканевых дефектов с использованием живого эквивалента кожи (на примере гортани) 247
Заключение 251
Выводы 265
Список
Литературы 267
- Дифференцировка кератиноцитов
- Миграция колоний эпидермальных кератиноцитов в культуре
- Клиническая оценка эффективности применения модифицированного дермального эквивалента
- Сравнительные результаты динамики заживления при трансплантации СЭ на сформировавшуюся десцеметоцеле и язву роговицы
Введение к работе
Бурное развитие клеточной биологии открывает возможности для объяснения закономерностей многих физиологических процессов, в частности репарации утраченных структур или функций. Одновременно, накопленные экспериментальные данные и методические приемы позволяют перейти к использованию клеток как трансплантатов и разработать эффективные технологии для клинического применения.
Именно с развитием клеточных технологий связывают сегодня надежды на решение многих актуальных проблем медицины.
Восстановление эпителиальных и мезенхимных дефектов кожи, было, пожалуй, первым успешным опытом применения клеток и клеточных конструкций. Именно тогда было положено начало новому синтетическому направлению в биомедицине, называемому тканевой или клеточной инженерией. Клеточная и тканевая инженерия, предполагающая конструирование in vitro аналогов тканей и органов с последующей трансплантацией в организм является, своего рода, технологической реализацией достижений клеточной биологии как научной дисциплины. Несмотря на более чем двадцатилетний опыт и триумфальное шествие по всему миру возможности применения клеточных технологий далеко не исчерпаны. Более того, открываются новые перспективные направления исследований и разработок.
Одним из таких направлений является моделирование in vitro различных клеточных процессов. Такое моделирование позволяет конструировать в культуре гистотипические аналоги тканевых структур, моделировать межклеточные взаимодействия, вычленять воздействия растворимых факторов или взаимодействие клеток с внеклеточным матриксом. Перспектива такого подхода для исследований. клеточных механизмов раневого заживления очевидна, поскольку позволяет использовать клетки человека, что повышает адекватность экспериментальных моделей. Общепризнанными являются модели миграции, регенерации эпидермиса, образования рубца. Фактически любую из стадий раневого заживления, не исключая стадию воспаления можно моделировать и исследовать в культуре (Grinnell,1994, Moll et al., 1998).
Созданные in vitro гистотипические тканевые конструкции могут быть с успехом применены и для замещения тканевых дефектов, существенно повышая эффективность лечения целого ряда заболеваний.
Технология восстановления кожных покровов основана на ряде фундаментальных свойств клеток и физиологических процессов:
Дезагрегированные эпидермальные клетки легко прикрепляются к субстрату и восстанавливают свою полярность в условиях in vitro,
В условиях культуры эпидермальные кератиноциты способны к гистогенной агрегации и образованию гистотипических структур, пригодных для трансплантаций на раневую поверхность,
ЭКЦ в культуре сохраняют способность к дифференцировке и морфогенезу, даже если, при этом, нет условий для реализации полной программы дифференцировки,
4. В процессе культивирования ЭКЦ не малигнизируются и сохраняют
' нормальный фенотип,
После перенесения на раневую поверхность устанавливается тесный контакт с подлежащими тканями,
После перенесения эпителиального пласта на раневую поверхность происходит образование базальной мембраны, что необходимо для нормального развития эпидермиса (Терских, Васильев, 1995),
Накопленный опыт восстановления дефектов кожи позволяет расширить рамки исследований и попытаться применить клеточные трансплантаты для восстановления целостности других тканей.
Исторически клеточные технологии ориентировались на собственные клетки
пациентов, рассматривая их как объект культивирования и
аутотрансплантации. Лишь самое последнее время исследователи обратились
к аллогенным клеточным трансплантатам как перспективному
технологическому решению. Опыт аллогенных трансплантаций неожиданно отрыл новые возможности данного подхода. Клеточные аллогенные трансплантаты, более эффективные в сравнении с аллогенными органными трансплантатами, при временном приживлении оказывались способными к значительной гистотипической стимуляции регенерации собственных тканей. Важно, что даже при кратковременном приживлении аллогенных трансплантатов они встраиваются в метаболитические и регуляторные системы
организма. Так достигается специфическое воздействие на патологические процессы. Использование клеточных трансплантатов оказывается более точным и эффективным, чем иные подходы к репарации.
Несмотря на растущее число наблюдений, механизмы данного феномена изучены недостаточно, что объективно сдерживает распространение такого подхода. Для системного применения клеточных трансплантатов для восстановления структур и функций разных тканей и органов необходима концепция аллогенных трансплантаций.
Другой важной проблемой клеточной биологии, неразрывно связанной с тканевой и клеточной инженерией является проблема стволовых клеток. Более того, интерес к клеточной и тканевой инженерии во многом стимулирован успехами в изучении стволовых клеток. Сегодня интерес закономерно смещается к исследованиям постнатальных стволовых клеток. Несмотря на значительные результаты в исследованиях стволовых клеток костного мозга, нейральный и м'езенхимных стволовых клеток, эпителиальные клетки изучены явно недостаточно. Так, до сих пор остается открытым вопрос об их сохранении при длительном культивировании, пластических возможностях. Уже сегодня утвердительно говорят о нейрональной трансдифференцировке лимбальных эпителиальных клеток (Seigel et al., 2003). Существуют предположения, что эпидермальные стволовые клетки в своих потенциях также могут проявлять высокую степень пластичности.
Все указанные проблемы стали предметом настоящего исследования.
Цель работы - изучение механизмов репарации тканей под воздействием аллогенных тканевых и клеточных трансплантатов
Задачи исследования:
-исследование закономерностей культивирования ЭКЦ кожи человека, -разработка эффективной технологии культивирования, трансплантации и хранения клеток кожи,
-моделирование и исследование в культуре различных стадий раневого заживления - миграции эпидермиса, регенерации эпидермиса, взаимодействия ЭКЦ и Фб в процессе контракции (процесс образования рубца), -сравнительное исследование механизмов восстановления эпителиальных и мезенхимных тканей под действием аллогенных клеточных трансплантатов, -разработка аллогенных клеточных и тканевых трансплантатов, для восстановления тканевых повреждений, в т.ч. глубоких ожогов кожи и роговицы, длительно незаживающих ран, язв различной этиологии, объемных тканевых дефектов,
-поиск и идентификация стволовых и прогениторных эпидермальных клеток в культурах ЭКЦ человека, -изучение влияния эпидермального фактора роста на культуру ЭКЦ,
Работа проводились на основании:
Постановление Правительства РФ №1314-68 от 21 декабря 1993г. Постановление Правительства РФ № 525-20 от 5 мая 1997г. Постановление Правительства РФ № 145-14 от 22 февраля 2000г. Постановление Правительства РФ № 35-2 от 22 января 2003 г. Исследования были поддержаны Российским Фондом Фундаментальных Исследований, Программой Президиума РАН «Фундаментальные науки-меди ци не»,
Программой Президиума РАН «Физико-химическая биология», Проект «Механизмы пролиферации и дифференцировки эмбриональных и тканеспецифичных стволовых клеток».
Работа полностью выполнена в Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова Российской академии наук, директор- академик РАН Н.Г.Хрущов.
Автор считает своим приятным долгом выразить глубокую благодарность учителю и научному консультанту работ, заведующему лабораторией проблем клеточной пролиферации, профессору, д.б.н. Василию Васильевичу Терских за всемерную поддержку и доброе отношение.
Данное исследование не могло состояться без участия и значительной помощи сотрудников лаборатории к.б.н. Е. А. Воротеляк, к.м.н. И. В. Киселева, А. П. Евсиковой, О. С. Роговой. Автор искренне благодарит своих коллег за многолетнюю совместную творческую деятельность.
Кроме того, Е. А. Воротеляк и И. В. Киселев оказали большую помощь при подготовке диссертации.
Автор глубоко благодарит за сотрудничество, помощь и доброе отношение сотрудников ММА им. И.Сеченова д.м.н. А. А. Иванова, к.б.н.О.П.Гладских, к.м.н. Д.Н.Федорова.
Данная работа выполнялась при творческом участии сотрудников многих клинических учреждений. Автор выражает благодарность проф., д.м.н. СВ. Смирнову и к.м.н. Л. П. Логинову (НИИ скорой помощи им.Н.В.Склифосовского ), проф., д.м.н. Р.А. Гундоровой и д.м.н. П. В. Макарову (НИИ глазных болезней им.Г.Гельмгольца), проф., д.м.н. В. И. Хрупкину и к.м.н. С.В.Леонову (Гос.Институт усовершенствования врачей МО РФ), д.м.н. -И. В. Решетову и Е. В. Батухтиной (МНИИ онкологии им. П.А. Герцена), проф., д.м.н.С.Ф.Малахову (Воєнно медицинская академия, Г.С.Петербург), к.м.н. И. И. Ермолинскому (ГВКГ им. Н. Бурденко) за активное участие в работе.
Особенную благодарность автор выражает полковнику А.В.Емельянову за понимание и поддержку данного направления.
Дифференцировка кератиноцитов
При культивировании эпидермальных кератиноцитов In vitro в условиях физиологического содержания Са 2+ в среде (около 1 мМ), также как и в организме, одновременно происходят два взаимосвязанных процесса: функциональная дифференцировка клеток и морфогенез (стратификация культуры). Эпидермис представляет собой многослойный сквамозный эпителий, в нижних слоях которого клетки синтезируют ДНК и вступают в митоз. Под действием пока еще невыясненного триггера базальные клетки вступают на путь дифференцировки и переходят в вышележащие слои. В процессе миграции клетки претерпевают морфологические и биохимические изменения, в результате которых образуются мертвые плоские чешуйки, слущивающиеся с поверхности эпидермиса. Строгая координация процессов дифференциации и морфогенеза не является исключительной особенностью эпидермальных кератиноцитов. Такое же явление характеризует поведение и других клеточных систем (Mizuno, Yasugi, 1990).
Дифференциация кератиноцитов in vivo характеризуется появлением ряда маркеров. Одним из важных маркеров являются кератины, принадлежащие к белкам промежуточных филаментов и экспрессирующиеся специфически в эпителиях. Известно около 30 генов, ответственных за синтез кератинов, которые делят на два типа. К І типу (К9-К20) относят мелкие кератины (40-56.6 kDa), являющиеся кислыми белками. Ко II типу (К1-К8) относят более крупные нейтральные или щелочные белки с мол массой 53-67 kDa (Fuchs, Weber, 1994). В процессе формирования промежуточных филаментов кератины образуют гетеротипичные комплексы. In vitro любой кератин первого типа может образовать комплекс с любым кератином второго типа, однако в эпителиальных тканях образуются специфические пары, характерные для определенного пути дифференциации (Quinlan et al., 1985).
Для эпидермальных кератиноцитов базального слоя характерно присутствие кератинов К5 и К14 (58 и 50 kD) (Nelson, Sun, 1983) и кератина К15 (Waseem et al., 1999). Характерным признаком базальных клеток, а также клеток шиповатого слоя, является наличие десмосом, объединяющих клетки в трехмерные структуры эпидермиса (Franke et al. 1987). Для кератиноцитов шиповатого слоя маркерами является синтез кератинов К1 и К10 (67 KD И 56,5 kD), агрегация кератиновых филаментов в тонофиламенты, кроме того, синтезируются белки оболочки, в частности инволюкрин, который откладывается в клетках с внутренней стороны плазматической мембраны (Rice, Green, 1979). В эти же сроки образуются окруженные мембранами гранулы, которые позднее сливаются с плазматическими мембранами клеток и выделяют липиды (Swartzendruber et al., 1989). В зернистом слое синтезируется филаггрин, из тонофиламентов образуются макрофибриллы (Fleckman et al.,1985), липиды заполняют межклеточные пространства (Simon, 1994; Eckert et al. 1997). В это же время продуцируется белок лорикрин - другой мажорный компонент ороговевающей оболочки (Mehrel et al., 1990). При дальнейшей дифференциации клетки становятся проницаемыми и в них поступает кальций, активирующий трансглутаминазу, которая катализирует поперечные сшивки белков оболочки (Rice, Green, 1979). Затем происходит лизис клеток, в результате чего остаются сплющенные чешуйки, заполненные кератиновыми макрофибриллами.
В ороговевающем слое терминально дифференцированные нежизнеспособные кератиноциты склеены липидами в непроницаемые нерастворимые чешуйки, которые защищают организм от микроорганизмов и потери жидкости.Одним из характерных признаков дифференциации кератиноцитов является увеличение размеров клеток (Green, 1980). За время перехода базальных клеток в грануляционный слой их размер может увеличиться до 30 раз. При этом клетки активно синтезируют белок и продуцируют рибосомы. Высокий пролиферативный потенциал сохраняют самые мелкие базальные кератиноциты диаметром около 10-11 мкм. У клеток, комитированных к терминальной дифференциации вместе с увеличением размера теряется способность к делению, а позднее в них наступает апоптоз. В клетках диаметром 27 мкм уже практически не отмечается синтез ДНК, а у клеток крупнее 22 мкм образуется оболочка из поперечно-сшитого инволюкрина, препятствующая в дальнейшем нормальному метаболизму.
Дифференциации кератиноцитов способствует широкий круг факторов: ионы Са (Hennings et al.,1980), парциальное давление кислорода и СО (Pentland et al., 1986), трансформирующий фактор роста бета, митоген 8-бром-сАМР (Tong, Marcelo, 1983), витамин A (Fuchs, Green, 1980), взаимодействие с мезенхимными клетками (Bohnertet al., 1986), механическое воздействие на клетки (Gormaret al., 1990) и другие.Первичные кератиноциты мыши активно пролиферируют при низком (менее 0.1 тМ) содержании кальция в среде, при этом они редко и спонтанно дифференцируются. При увеличении концентрации кальция в среде кератиноциты прекращают пролиферировать и переходят к терминальной дифференциации (Hennings et al., 1980; Воусе, Ham, 1985; Yuspa et al., 1989).
Использование внутриклеточного хелата ВАРТА показало, что подавление экспрессии маркеров дифференциации происходит в результате истощения внутриклеточных пулов кальция (Li et al., 1995). По-видимому, сигналы, вызывающие дифференцировку, сначала приводят к усилению пролиферации, например при воздействии 8-бром-сАМР (Tong, Marcelo, 1983), или добавлении Са2+ к культурам, растущим при низком содержании этого иона (Reiss, Zhou, 1989). Однако эти процессы могут быть диссоциированы как в культуре кератиноцитов, так и в других системах, например, в клетках щитовидной железы (Waters etal., 1987).В условиях культивирования кератиноциты сохраняют основной дифференцированный фенотип, но пути дифференцировки претерпевают некоторые изменения в зависимости от особенностей микроокружения. Обычные условия культивирования кератиноцитов в погруженном состоянии не обеспечивают полной экспрессии программы дифференциации. При выращивании ЭКЦ в погруженном состоянии дифференциация кератиноцитов происходит менее полно, чем на границе среды и воздуха (Regnier et а.,1986а).
В культуре кератиноцитов крысы было показано, что самые мелкие слабо дифференцированные базальные кератиноциты (предположительно стволовые клетки) не содержат особый связывающий Са белок (12 кДа), который появляется как один из ранних показателей комитирования клеток к дифференциации с увеличением размеров клеток и повышением количества РНК и белка. На более поздней стадии дифференцировки в супрабазальных кератиноцитах, этот белок уже не экспрессируется (Rizk-Rabin, Pavlovitch, 1993).В кератиноцитах синтезируется растворимый инволюкрин, который может составлять до 5- 10 % от общего растворимого белка и имеет необычный аминокислотный состав - 40% остатков глицина. У клеток размером меньше ЛА мкм инволюкрин практически отсутствует, а у подавляющей части клеток с диаметром больше17 мкм он уже присутствует (Watt, Green, 1981). Он локализуется в цитоплазме, но при определенном сигнале концентрируется на периферии клетки, где сшивается под действием трансглутаминазы с образованием нерастворимой оболочки. Сигналом для этого процесса является нарушение проницаемости клеточной мембраны, в результате чего ионы Са становятся доступными для трансглутаминазы (Rice, Green, 1979). Ионы Са2+ являются одним из путей передачи сигнала для наступления апоптоза (McConkey, Orrenius,1994). Как показали исследования Ватт и Грина (Watt, Green, 1982), начало синтеза инволюкрина в клетках не совпадает с их переходом в супрабазальное положение. И в стратифицированных культурах, растущих в
Миграция колоний эпидермальных кератиноцитов в культуре
Культивирование ЭЩ по методу Рейнвальда и Грина начинается с выделения и посева суспензии ферментативно дезагрегированных клеток в смеси сред flMEM:F12 в культуральный сосуд, поверхность которого ранее засеяна фидерными фибробластами. Мы модифицировали метод, предложив использовать культуральные флаконы, поверхность которых покрыта сорбированным коллагеном 1 типа. Прикрепившиеся ЭКЦ сначала образуют мелкие колонии, которые со временем увеличиваются в размерах, сливаются и образуют многослойный эпителиальный пласт. К 7-10 суткам культивирования образуются уже достаточно крупные колонии, содержащие от нескольких тысяч до сотен тысяч клеток. На определенном этапе культивирования колонии приобретают асимметричную форму, что позволило предположить их способность к направленному движению (миграции). Типичные колонии на этой стадии роста имели выгнутый (ведущий) и вогнутый (ведомый) края (Рис. 4). При культивировании ЭКЦ с фидерными клетками ведущий край колонии находился в контакте с валиком из фидерных клеток, оттесненных мигрирующей колонией, тогда как за вогнутым краем колонии оставался «след», свободный от фидерных клеток, но содержавший отставшие фибробластоподобные клетки, вытянутые в направлении миграции колоний. Отмеченное поведение колоний соответствует описанию вытеснения фибробластов эпителиальными клетками. (Ю.М.Васильев и др., 1991). Ведущий край колонии образован мелкими плотно расположенными клетками, которые интенсивно окрашивались гематоксилином, эозином и флуоресцеином.
Противоположный край колонии состоял из крупных слабо окрашенных клеток, расположенных в один слой. Центр колоний был образован, как правило, разнородными клетками: кластеры мелких плотно расположенных интенсивно окрашенных клеток чередовались с крупными бледно окрашенными клетками. По нашим наблюдениям, очень мелкие колонии, содержавшие не более ста клеток, не были способны к активной миграции. Хорошо выраженное перемещение колоний отмечалось тогда, когда они состояли уже из нескольких тысяч клеток. При дальнейшем увеличении размеров колоний их способность к миграции снижалась. Скорость движения колоний ЭКЦ на 7-е сутки роста культур составляла, в среднем, 20 мкм/ч, однако она могла изменяться в зависимости от размера колоний и присутствия фидерных клеток. Найденная скорость хорошо согласуется с данными Ю.М.Васильева и соавторов относительно миграции эпителиальных пластов при совместном культивировании клеток разных типов.
Возможно, большая скорость миграции колоний ЭКЦ зависела от использования в качестве субстрата культурального пластика, поскольку было показано, что максимальная скорость перемещения кератиноцитов человека наблюдалась на пластике, причем она увеличивалась к 7 суткам культивирования. По нашим наблюдениям, именно к этому сроку формируются колонии, обладающие максимальной подвижностью. Можно предположить, что скорость миграции целой колонии зависит от способности к миграции составляющих ее клеток. С веже выделенные ЭКЦ, обладают незначительной подвижностью. Способность к миграции у них усиливается постепенно и, возможно, это связано с тем, что ЭКЦ начинают синтезировать коллаген, фибронектин компоненты базальной мембраны и у них появляются рецепторы к фибронектину. Направление движения колоний представляется случайным. Они способны даже подниматься по вертикальной стенке чашки Петри. За время менее 6 часов колонии могут изменить направление движения на 45. В процессе движения отдельные колонии сливаются с образованием мегаколоний. Во всех случаях колонии перемещались как единое целое и их движение не сопровождалось быстрым изменением относительного расположения клеток за время наблюдения. Таким образом, отмеченная нами миграция колоний ЭКЦ отличается от центробежной миграции краевых клеток в колониях ЭКЦ под влиянием факторов роста.(Barrandon Y., Green Н. , 1985) В указанной работе изучались колонии большего размера, когда, по нашим наблюдениям, их миграция останавливается. Следует отметить, что миграция краевых клеток коррелировала с их способностью к пролиферации. Ниже мы приводим результаты опытов, показывающие, что и миграция колоний кератиноцитов также коррелирует с их пролиферативным потенциалом. С этой целью мы блокировали пролиферацию с помощью митомицина С путем добавления в питательную среду холодного тимидина и инкубированием колоний ЭКЦ в среде без Са2+ и сыворотки. Поляризованные колонии ЭКЦ инкубировали в питательной среде с добавлением митомицина С (10 мкг/мл, «Sigma») в течение 2 ч. при 37С, затем среду с митомицином заменяли на свежую. После такой обработки скорость движения колоний снижалась, и через 24 ч движение полностью прекращалось. Поляризованные колонии при этом становились округлыми (Рис.6) и деление клеток в них не наблюдалось. Добавление тимидина (10 4М) приводило к замедлению движения колоний к концу вторых суток, а на третьи сутки движение прекращалось и колонии приобретали округлую форму. Снятие тимидинового блока приводило к возобновлению движения, при этом направление движения часто отличалось от первоначального.
Удаление Са2+ из питательной среды приводило к дезагрегации пласта ЭКЦ и обособлению отдельных клеток (Jensen and, Bolund ,1988). Мы нашли, что смена питательной среды со стандартным содержанием Саг на среду без Са2+ и сыворотки приводила к остановке миграции колоний, разъединению кератиноцитов и потере колониями асимметричной формы в течение суток. Дезагрегированные клетки колоний теряли способность к направленной миграции. Следует отметить, что миграция ЭКЦ в область искусственно созданного дефекта из эксплантатов кожи in virto происходит со скорость, около 10 мкм/час, однако обработка эксплантатов митомицином С не приводит к полной остановке миграции, а лишь замедляет ее на 52 и 17% на 1 или 3 дни после обработки, соответственно (Mazzalupo et al., 2002). Связь между пролиферацией ЭКЦ и миграцией колоний, возможно, заключается в том, что повышение плотности популяции клеток способствует их миграции, вследствие чего колонии становятся очень подвижными, а при увеличении размеров колонии темп пролиферации клеток снижается, поскольку пролиферирующие клетки располагаются главным образом в узкой зоне по периферии колонии. Возможно, именно поэтому движение колоний замедляется, а в дальнейшем, при формировании мегаколоний практически прекращается. Результаты проведенных экспериментов указывают на связь между пролиферацией клеток и миграцией колоний и наличием характерной асимметричной формы.
Поскольку движение колоний, вероятно, обусловлено суммарной активностью составляющих их клеток, мы предположили, что направленность движения и асимметричность колоний могут быть обусловлены неравномерностью распределения делящихся клеток. С этой целью мы в течение 6ч инкубировали движущиеся колонии с 3Н-тимидином (1 мкКи/мл, 38.6 Ки/ммоль). После этого колонии фиксировали и проводили радиоавтографическое определение индекса меченых клеток. На полученных препаратах были исследованы 22 мигрирующие колонии, выращенные в присутствии фидерных клеток, и 10 колоний, выращенных без фидерных клеток на пластике, покрытом сорбированным коллагеном. Анализ распределения меченых кератиноцитов не выявил статистически значимых различий между ведущим и ведомыми краями колоний. В присутствии фидерных клеток индекс меченых клеток составлял в среднем 30,4% на ведущем крае и 31,3% на ведомом. Для колоний, растущих без фидерных клеток, эти величины составляли соответственно 21,0 и 23,7 %. Однако следует отметить, что в отдельных случаях были значительные
Клиническая оценка эффективности применения модифицированного дермального эквивалента
Изучение эффективности использования аллогенного дермального эквивалента (ДЭ) проводили у больных, у которых патогенетическим фактором, приведшим к образованию кожных дефектов, явилось нарушение кровообращения вследствие хронической венной, артериальной недостаточности или диабетической ангиопа-тии нижних конечностей. Всего в основной группе сданной патологией было 19 (76,0%) больных. Из них мужчин было 7 человек, женщин - 12.
Возраст больных от 28 до 72 лет. Длительность существования кожного дефекта колебалась от трех месяцев до 15 лет. Среди сопутствующих заболеваний у 14 больных была ишемическая болезнь сердца с умеренно выраженной гипертонией, атеросклеротический кардиосклероз, атеросклероз мозговых сосудов. Возраст этих пациентов был старше 50 лет. У пяти больных диагностирован хронический холецистопанкреатит, у семи - язвенная болезнь желудка и 12-ти перстной кишки в стадии ремиссии. В 13 (68,4%) наблюдениях трофические язвы сопровождались мокнущими параязвенными экземами. При определении микрофлоры язв в 78,4% выделен стафилококк в сочетании со стрептококком, устойчивый ко многим антибиотикам, в 13,6% выделен вульгарный протей и в 8,3% - синегнойная палочка. У 3 больных (15,7%) при локализации язв на передней поверхности голени с длительностью существования язвенного дефекта более шести лет при рентгенологическом исследовании обнаружены репаративные процессы в костях голени в виде оссифицирующего периостита и остеопороза без изменений со стороны костномозгового канала. У 6 больных ранее были выполнены реконструктивные операции на магистральных сосудах нижних конечностей, однако язвы у них в послеоперационном периоде не зажили. У подавляющего большинства больных (16) трофические язвы локализовались в нижней трети голени, при этом чаще поражались передняя и внутренняя её поверхности. У 3 пациентов язвенный дефект располагался на тыльной поверхности одной из стоп. У 16 (84,2%) больных язвы были одиночными. Размеры кожного дефекта колебались от шести до 100 см2, в среднем - 37,5 см2. Края язв у большинства больных были неправильных очертаний, плотные. Дно выполнено гнойно-некротическими массами или бледными, вялыми грануляциями. Кожа вокруг язвы синюшная, отёчная, на ощупь несколько теплее окружающих тканей. Она малоподвижна или фиксирована глубжележащими тканями, покрыта папулёзно-везикулёзными высыпаниями, местами мацерирована.
Болезнь сопровождалась зудом, чувством жжения, болями в ноге. Контрольную группу составили 69 человек сопоставимых по возрасту, полу, характеру патологического процесса . Все больные обеих групп были консультированы сосудистым хирургом. 7 пациентам ранее были выполнены оперативные вмешательства на сосудах нижних конечностей: 5 их них выполнялась флебэктомия, 2 - шунтирование подвздошно-бедренного сегментов артерий конечностей. Проводилась комплексная консервативная терапия, включавшая, как общее лечение, так местное применение современных лекарственных препаратов, перевязочных материалов и методов физического воздействия на язвенную поверхность. У 8 (11,6%) пациентов контрольной группы, для закрытия язвенной поверхности, была применена аутодермопластика перфорированным кожным лоскутом. Показанием к применению трансплантации культуры аллогенных фибробластов и аутодермопластики служило отсутствие репаративных процессов в очищенной, гранулирующей ране в течение 2-х недель и более, отсутствие эффекта от проводимого оперативного лечения, невозможность оперативного лечения из-за тяжести состояния пациента. При этом готовность раны к оперативным вмешательствам оценивалась, используя обычно применяемые критерии: красные мелкозернистые грануляции, отсутствие признаков воспаления, наличие "отпечатка сетки" на ране, высокая адгезивность раны, краевая эпителизация, наличие микробного числа менее 105 в 1 г ткани. В результате лечения с применением модифицированного ДЭ из 19 больных у 17 (89,5%) наступило полное закрытие язвенного дефекта в период до 5 недель с момента первой трансплантации. У 2 больных полного закрытия ран не наступило, однако они уменьшились в размерах более чем на 60%. Больных контрольной группы с такой же площадью поражения было 31 человек. Как видно из рисунка репаративные процессы у них шли значительно медленнее. Через 4 недели размеры ран сократились менее чем на 40%. В 14% наблюдений полной эпитализации не наступило и в более поздние сроки. Планиметрия ран этой категории больных показана в таблице. Первоначальная средняя площадь кожного дефекта в основной группе составила 28,6+0,8 см2, в контрольной -30,3+0,5 см2. Рис.28
Скорость закрытия раневых дефектов площадью до 50 см2 в основной и контрольной группах. После переноса культуры ДЭ на гранулирующую раневую поверхность краевая эпителизация наблюдалась уже при первой перевязке на 3 сутки с момента пересадки ДЭ и скорость ее составляла 3,1 - 3,9% в сутки на протяжении всего периода репарации. При использовании традиционных методов лечения у тех больных, у которых появлялась тенденция к заживлению трофической язвы скорость заживления была ниже и составляла 0,4 - 1,1% в сутки в первые 3-4 недели, увеличиваясь до 1,6 - 2,3% в более поздние сроки. Вторую часть основной группы составили 12 больных, дефект кожного покрова у которых превышал 50 см2 (в среднем 68,4+10,1 см2). В контрольной группе было 30 человек. Средний размер раны составил 76,9+4,9 см2. В этой группе заживление язв протекало более медленно, причем в большинстве случаев, у 10 пациентов, потребовалось от 2 до 4 пересадок культуры ДЭ. Наиболее медленно процесс заживления проходил у больных, у которых трофические язвы сформировались на фоне артериальной недостаточности и с сопутствующим сахарным диабетом. У двух больных полного заживления не произошло в течение периода наблюдения. Особенностью течения репаративного процесса явилось то, что хотя после трансплантации культуры ДЭ и появилась эпителизация, но скорость ее была сравнительно низкой, не превышая 1,5% в сутки.
Сравнительные результаты динамики заживления при трансплантации СЭ на сформировавшуюся десцеметоцеле и язву роговицы
Из графика видно, что трансплантация вызывает выраженную, но короткую по времени воспалительную реакцию. Как известно, воспаление является адекватной реакцией организма на травму и обязательным условием начала регенерации. Учитывая этот факт, развитие воспалительной реакции после трансплантации СЭ в раннем периоде можно расценивать как положительный эффект метода лечения. Положительный эффект трансплантации выявлялся и при анализе динамики восстановления ожогового дефекта роговицы. Так, если в контроле, на 7 сутки, десцеметоцеле и перфорации развивались в 55,5% случаев (в том числе 20% - перфорации) и сохранялись к 30 дню после травмы на 28,9% глаз в виде стромальных дефектов, то в опытной группе глаз глубокие дефекты формировались в 3 раза реже. К концу срока наблюдения в опыте в 91,1% случаев эпителизация завершалась (8,9% случаев персистирующих эрозий). Существенная разница между контрольной и опытной группой выявляется при анализе степени интенсивности помутнения роговицы - 7 баллов в опыте и 10 баллов в контроле в среднем. На большинстве опытных глаз помутнение ограничивалось пределами ожогового дефекта, а в контроле оно распространялась за зону повреждения в среднем на 1-2 мм.
Разница в степени выраженности новообразованных сосудов между группами проявлялась с 14 дня после трансплантации (3 балла в контроле и 2 балла в опыте), а к концу эксперимента степень васкуляризации в опытной группе глаз была значительно ниже (1 балл) по сравнению с контрольной группой (3 балла). Таким образом, результаты проведенного экспериментального исследования подтверждают положительное воздействие трансплантации на клинические проявления ожоговой болезни. Обращает внимание значительное ускорение регенерации эпителия, стромы, {сокращение сроков заживления эпителиальных и стромальных дефектов роговицы), что позволило снизить частоту случаев с перфорацией роговицы, получить бельмо меньшей интенсивности и площади по сравнению с контролем. Активной и короткой по продолжительности воспалительной реакцией и более коротким сроком сохранения дефектов роговицы можно объяснить сравнительно меньшую степень васкуляризации в опыте, чем в контрольной группе глаз. 203 5.3.
Сравнительные результаты клинической оценки процессов репарации ожогового дефекта роговицы, при трансплантации СЭ на сформировавшемся десцеметоцеле (стромальный дефект роговицы) и язве роговицы II серию экспериментальных исследований проводили на 75 кроликах (150 глаз) породы Шиншилла. Через 14 дней после нанесения тяжелого щелочного ожога роговицы на 56 глазах (37,3%) наблюдалась примерно одинаковая клиническая картина: смешанная инъекция конъюнктивы, слизисто-гнойное отделяемое, отек окружающей ткани роговицы (воспалительная реакция соответствовала 2 баллам). На 20 глазах сформировалось десцеметоцеле (3 балла), на 36 -язвенный дефект стромы (2 балла). Средняя площадь дефекта в диаметре составляла 6мм. Васкуляризация 204 На всех глазах проводили хирургическую некрэктомию. С помощью лезвия и скарификатора удаляли некротически измененную ткань на 1-2 мм по окружности образовавшейся язвы или десцеметоцеле. Непосредственно после проведения некрэктомии в опытной группе в дефект роговицы помещапи трансплантат и фиксировали МКЛ диаметром 18мм. Для фиксации трансплантата веки зашивали. На контрольных глазах также использовали МКЛ и накладывали временный шов. Клиническое наблюдение за состоянием глаз осуществляли с помощью фокального и бокового освещения, биомикроскопии с флюоресцеиновой пробой и фоторегистрацией. Критерии оценки клинического состояния глаз описаны выше. Гистологические исследования проводили на 7, 14, 22 сутки после трансплантации. Через 7 дней после проведения трансплантации (21 после ожога) на опытных глазах (п-28) воспалительная реакция соответствовала 3 баллам, длина новообразованных сосудов составляла 2,4 мм в среднем (2 балла). Произошла перфорация на 1 глазу (4 балла), десцеметоцеле сохранялось на 8 глазах (3 балла), диаметр которого не превышал 4 мм (2 балла) в среднем, а на 19 глазах наблюдался язвенный дефект роговицы (2 балла). В большинстве случаев диаметр эпителиального дефекта был в пределах 4,5 мм. В контрольных глазах к этому сроку (п=28) наблюдалась воспалительная реакция соответствующая 2 баллам в среднем. Имела место перфорация на 7 глазах (4 балла), на 14 глазах сохранялось десцеметоцеле (3 балла), площадь которого составляла 5мм в среднем (3 балла), и в 7 случаях наблюдалась язва роговицы. Диаметр эпителиального дефекта был в пределах 5,7мм в среднем, длина новообразованных сосудов - 3,5мм (2 балла). Таким образом, на 7 день после проведения трансплантации обращает внимание одинаковая степень выраженности воспалительной реакции в опытной группе глаз, однако, при этом, глубокие дефекты роговицы наблюдались в 2,5 раза реже и преобладали случаи с поверхностными стромальными дефектами.
Площадь стромальных дефектов в опыте не превышала 1 балла, в то время как в контроле она соответствовала 3 баллам. Длина новообразованных сосудов была одинаковая в обеих группах (2 балла в среднем). На 14 сутки после проведения трансплантации на 21 опытном глазу сформировалось помутнение роговицы, степень интенсивности которого составляла 7 баллов в среднем по шкале Войно-Ясенецкого. Следует отметить, что границы помутнения держались в пределах ожогового повреждения в большинстве случаев (8 глаз), и лишь в одном случае распространялись за его пределами на 1 мм. В 6 случаях сохранялся поверхностный стромальный дефект, занимающий не больше 2 мм в диаметре в среднем. На одном глазу наблюдалась персистирующая эрозия роговицы, диаметр которой составлял 2,4 мм. Новообразованные сосуды достигали до 4,5 мм в среднем (3 балла). В глазах контрольной группы, в 2 случаях, в эти сроки сохранялся поверхностный дефект стромы, в 5 случаях сформировалось помутнение и в трех случаях наблюдалась персистирующая эрозия роговицы, диаметр которой составлял 4,3мм в среднем. Интенсивность помутнения в большинстве случаев соответствовала 10 баллам по шкале, а васкуляризация роговицы - 3 баллам (4,8мм). Воспалительная реакция держалась на уровне 2 баллов в среднем. Итак, на 14 сутки после проведения трансплантации в опытной группе глаз в большинстве случаев (75%) сформировалось помутнение роговицы, в то время как в опытной группе в 53,6% случаев сохранялись дефекты роговицы, из которых 42,9% составляли стромальные дефекты. Диаметр эпителиального дефекта в опытной группе глаз также был меньше (почти в 2 раза). Между тем, длина новообразованных сосудов была равна 2 баллам, как в опыте, так и в контроле. На 22 сутки после трансплантации на всех глазах в опытной группе сформировалось помутнение роговицы, не превышающее 7 баллов по шкале Войно-Ясенецкого. Площадь образованного помутнения в среднем составляла в среднем 6 мм в диаметре. Васкуляризация роговицы соответствовала 3 баллам (до 5,8мм в длину). Результаты проведенного экспериментального исследованияподтверждают положительное воздействие трансплантации на течение ожоговой болезни. Наиболее показательными являются данные, отображающие динамику заживления дефекта стромы и эпителия, степень интенсивности и размеры помутнения.
Результаты проведенного экспериментального исследования подтверждают положительное воздействие трансплантации на течение ожоговой болезни. Наиболее показательными являются данные, отображающие динамику заживления дефекта стромы и эпителия, степень интенсивности и размеры помутнения. С 7 дня после проведения трансплантации наблюдалось уменьшение размеров площади стромального и эпителиального дефектов на опытных глазах. Глубокие дефекты роговицы равнялись 32,2% в опыте, среди которых перфорация занимала 11,1%, в то время как в контроле отмечалось увеличение площади и глубины дефектов: глубокие дефекты роговицы в 4 и 3 балла составляли 75% глаз и сохранялись до конца эксперимента в виде эпителиальных дефектов. В опыте же к концу эксперимента на всех глазах наступила полная эпителизация роговицы, с формированием бельма меньшей интенсивности (в среднем 7 баллов в опыте и 10 баллов - в контроле). Необходимо отметить также, что диаметр бельма в опытной группе глаз была меньше диаметра очага поражения в среднем на 2 мм, а в контроле - выходила за пределы ожогового повреждения в среднем на 2-4 мм. Динамика степени интенсивности воспалительного процесса В течение первых 7 дней после трансплантации разницы между контролем и опытом в степени выраженности воспалительной не отмечалось, но уже с 14 дня после трансплантации и до окончания эксперимента прослеживалось ее закономерное. снижение в опытной группе глаз. К концу эксперимента констатировалось полное купирование воспалительных процессов в опыте. Между тем, в контроле отмечалась воспалительная реакция в 2 балла на протяжении всего эксперимента, и лишь к 36 суткам после ожога она снизилась до 1 балла. Очевидно, сохранение воспалительной реакции было связано наличием эпителиального дефекта на контрольных глазах.
