Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Введение 9
Глава 2. Обзор литературных данных
2.1. Экспериментальные подходы к моделированию ишемического повреждения нейронов головного мозга 20
2.1.1. Моделирование ишемии in vivo 21
2.1.2. Моделирование ишемии in vitro 24
2.2. Развитие ишемического повреждения нейронов головного мозга 26
2.2.1. Нейроцитотоксический эффект глутамата и роль митохондрий в его развитии 31
2.2.2. Депривация по глюкозе 36
2.2.3. Свободнорадикальное повреждение нейронов 45
2.2.4. Нарушение кислотно-щелочного равновесия
2.3. Роль глутамина в выживании и гибели нейронов 58
2.4. Фармакологическая защита нейронов от ишемического повреждения...66
2.5. Защита нейронов головного мозга от ишемического повреждения путем воздействия на эндогенные нейропротекторные системы 73
Глава 3. Материал и методы исследования
3.1. Объект исследования 76
3.2. Получение диссоциированных монослойных культур 76
3.3. Приготовление субстратов для культивирования 79
3.4. Схемы экспериментальных воздействий 79
3.4.1. Моделирование факторов ишемического повреждения нейронов in vitro 79
3.5. Приготовление препаратов для световой микроскопии 81
3.6. Методы количественного анализа культур и оценки выживаемости 82
3.7. Флуресцентная микроскопия
3.7.1. Определение внутриклеточных концентраций Са2+ и Zn2+ 84
3.7.2. Определение мембранного потенциала митохондрий с помощью родамина 84
3.7.3. Определение активных форм кислорода гидроэтидином 85
3.8. Электронная микроскопия 85
3.9. Количественное определение мРНК к ASICla методом ПЦР.
3.10. Фотоиндуцированный тромбоз 86
3.11. Фокальная компрессионная ишемия 87
3.12. Измерение объема очага ишемического повреждения 89
3.13. Условный рефлекс пассивного избегания 91
Глава 4. Результаты исследования
4.1. Морфология культивированных зернистых нейронов мозжечка 92
4.2. Цитотоксическое действие глутамата 95
4.2.1. Сравнительный анализ цитотоксического действия глутамата на зернистые нейроны в различные сроки культивирования 95
4.3. Нейродеструктивное действие глюкозной депривации 102
4.3.1. Жизнеспособность нейронов при глюкозной депривации 102
4.3.2. Изменения внутриклеточной концентрации ионов Са2+ ([Са2+],) и мембранного потенциала митохондрий при глюкозной депривации 103
4.3.3. Возрастание продукции активных форм кислорода в
культивированных зернистых нейронах при глюкозной депривации 104
4.3.4. Влияние митохондриальных ингибиторов на [Ca2+]i и продукцию активных форм кислорода при глюкозной депривации 105
4.3.5. Влияние рутениевого красного и пиру вата на изменение мембранного потенциала митохондрий при глюкозной депривации 107
4.3.6. Зависимость действия глюкозной депривации от степени морфохимической дифференцировки культивированных зернистых нейронов in vitro. Обратимость эффекта глюкозной депривации 108
4.4. Окислительный стресс 113
4.4.1. Цитотоксическое действие параквата на нейрохимически зрелые и незрелые культивированные зернистые нейроны и значение глутамина для развития цитотоксичности 113
4.4.2. Антиоксидантный статус культивированных зернистых нейронов в различные сроки культивирования 115
4.4.3. Влияние предобработки уабаином зрелых и незрелых культивированных зернистых нейронов на окислительный стресс и нейрональный апоптоз 116
4.5. Ацидоз 119
4.5.1. Влияние ацидоза на жизнеспособность нейронов 119
4.5.2. Механизмы действия ацидоза на незрелые культивированные зернистые нейроны 122
4.5.3. Исследование механизма защитного действия менадиона 127
4.6. Особенности действия глутамина на культивированные зернистые нейроны 129
4.6.1 Влияние глутамина на мембранный потенциал митохондрий зрелых культивированных зернистых нейронов при глюкозной депривации...129
4.6.2. Влияние глутамина на жизнеспособность зрелых культивированных зернистых нейронов в норме и условиях глюкозной депривации 130
4.6.3. Влияние пирувата на жизнеспособность культивированных зернистых нейронов при глюкозной депривации 132
4.6.4. Влияние глутамина на жизнеспособность зрелых культивированных зернистых нейронов при химической гипоксии, индуцированной ротеноном 132
4.6.5. Влияние глутамина на выживаемость и [Са2+]! незрелых культивированных зернистых нейронов при действии ротенона 134
4.6.6. Влияние глутамина на выживаемость и [Са2+], в незрелых культивированных зернистых нейронах при ингибированиии Na+/K+-АТРазы уабаином 136
4.6.7. Влияние глутамина на выживаемость, [Са2+], и мембранный
потенциал митохондрий незрелых культивированных зернистых нейронов при гиперстимуляции NMDA-рецепторов 138
4.6.8. Влияние глутамина на гибель культивированных нейронов коры головного мозга при ишемии, гипоксии, глюкозной депривации 141
4.7. Совместное действие повреждающих факторов ишемии 144
4.7.1. Паракват потенцирует токсическое действие глутамата в незрелых культивированных зернистых нейронах 144
4.7.2. Совместное действие ацидоза и параквата 145
4.7.3. Совместное действие стауроспорина и умеренного ацидоза 147
4.8. Защита нейронов от повреждения с применением нейропротекторов...148
4.8.1. Фармакологическая коррекция повреждения культивированных зернистых нейронов препаратами семейства SkQ in vitro 148
4.8.2. Влияние SkQRl на объем очага повреждения коры головного мозга крысы, индуцированного компрессионной ишемией 154
4.8.3. Фармакологическая коррекция повреждения культивированных зернистых нейронов при моделировании ишемии in vitro с помощью препарата целлекс 156
4.8.4. Изменение объема ишемического очага, индуцированного фототромбозом, при действии целлекса 159
4.8.5. Фармакологическая коррекция повреждения культивированных зернистых нейронов с помощью препарата ГК-2 162
4.8.6. Изменение объема очага ишемического повреждения фотоиндуцированным тромбозом при действии ГК-2 163
Глава 5. Обсуждение результатов
5.1. Диссоциированные культуры клеток головного мозга как объект исследования механизмов ишемического повреждения нейронов 168
5.2. Исследование механизмов патологических процессов, вызываемых ишемическим повреждением культивированных нейронов 171
5.2.1. Механизмы цитотоксического повреждения нейронов, вызываемого глутаматом 171
5.2.2. Механизмы повреждения нейронов при глюкозной недостаточности 176
5.2.3. Обратимость морфофункциональных изменений
культивированных зернистых нейронов при глюкозной депривации...180
5.2.4. Ацидоз 182
5.2.5. Окислительный стресс 186
5.2.6. Влияние глутамина на повреждение нейронов
5.3. Сравнение токсического воздействия на зернистые нейроны различных сроков культивирования 192
5.4. Заключение по разделу 196
5.5. Защита головного мозга от ишемического повреждения 198
5.5.1. Индукция неиропротекции транзиторным снижением активности Ыа+/К+-АТРазы 198
5.5.2. Использование новых препаратов для защиты нейронов от ишемического повреждения 199
5.6. Заключение 207
6. Выводы 212
7. Список цитированной литературы
- Развитие ишемического повреждения нейронов головного мозга
- Получение диссоциированных монослойных культур
- Сравнительный анализ цитотоксического действия глутамата на зернистые нейроны в различные сроки культивирования
- Влияние глутамина на выживаемость и [Са2+]! незрелых культивированных зернистых нейронов при действии ротенона
Введение к работе
Актуальность темы
Рост распространенности сосудистых заболеваний привел к увеличению частоты нарушений мозгового кровообращения, являющихся причиной смертности и инвалидизации трудоспособного населения (Суслина, Пирадов, 2008). Один из путей решения проблемы снижения повреждений и смертности от инсультов - изучение механизмов ишемии с помощью моделирования ее повреждающих факторов на животных и культивированных нейронах.
При нарушении кровоснабжения головного мозга возникает одновременный дефицит глюкозы и кислорода. Истощение запасов глюкозы ведет к снижению скорости гликолиза и, как следствие, к уменьшению поступления пирувата в цикл трикарбоновых кислот, протекающий в митохондриях, и к снижению генерации ими АТР. В результате кислородного голодания митохондрии клеток мозга в процессе окислительного фосфорилирования не могут эффективно использовать имеющиеся запасы энергетических субстратов, что ведет к накоплению лактата и развитию ацидоза (Katsura, et al., 1992), который является одним из факторов, повреждающих нейроны (Yermolaieva et al., 2004; Xiang et al., 2004; Xiong et al., 2004). Однако полной ясности в вопросе о характере влияния ацидоза на развитие гибели нейронов при ишемии пока нет.
В многочисленных исследованиях показано, что одним из важных патогенетических факторов повреждения нейронов при энергетическом дефиците является гиперстимуляция глутаматных рецепторов, связанная с внеклеточным накоплением глутамата, происходящим в результате нарушения энергозависимого обратного захвата глутамата нервными и глиальными клетками, а также активации митохондриальной глутаминазы (Huang and Hertz, 1994; Lipton, 1999; Guo et al., 2009). Гиперактивированные глутаматные рецепторы длительно удерживают в открытом состоянии управляемые ими ионные каналы, через которые в нейрон начинают избыточно поступать ионы Na+ и Са2+ и выходить в межклеточное пространство ионы К+. Деполяризация мембраны приводит к открытию потенциал-зависимых Са2+-каналов. Именно повышение внутриклеточной концентрации Са2+ запускает сложный каскад процессов, повреждающих нейроны при ряде патологических состояний головного мозга (Matute, 2010) и, в частности, в результате цитотоксического действия возбуждающих аминокислот (Choi, 1985). Избыток Са2+ накапливается в митохондриях, нарушая их нормальное функционирование (Isaev et al., 1994; Dirnagl et al., 1999; Kunz et al., 2010). Деструктивный эффект при нарушении ионного баланса в клетках и межклеточной среде в периоды кислородо-глюкозного дефицита и реперфузии усугубляется тем, что во время ишемии и в постишемический период снижается активность Na7K+-ATPa3bi - важнейшей системы поддержания в клетках ионного гомеостаза (Kaur and Arora, 1994;
Mrsic-Pelcic et al., 2004). Исходя из этого, мы предположили возможность индукции толерантности нейронов к составляющим ишемического повреждения - апоптотическому стимулу и окислительному стрессу -транзиторным ингибированием Na+/K+-ATPa3bi.
Как глюкозная, так и кислородо-глюкозная депривация сопровождаются снижением активности антиоксидантных систем (Homi et al., 2002; Singh et al., 2004; Jung et al., 2009), что в период реперфузии приводит к повышению образования свободных радикалов (Dirnagl et al., 1995; McGowan et al., 2006; Hernandez-Fonseca et al., 2008) и развитию окислительного стресса, который является важным патогенетическим фактором, усиливающим ишемическое повреждение нейронов. Известно, что митохондриальная цепь транспорта электронов является основным источником активных форм кислорода (АФК), которые даже в условиях нормального метаболизма генерируются митохондриями, а при кальциевой перегрузке, вызываемой ишемией и гипогликемией, их образование может значительно возрастать в результате снижения активности митохондриальных антиоксидантов (Homi et al., 2002, Singh et al., 2004; Jung et al., 2009). Поэтому исследование роли митохондрий в развитии окислительного стресса и защите от него в периоды кислородного и глюкозного дефицита, а также при реперфузии является особо актуальным. Особое внимание необходимо уделить поиску и тестированию антиоксидантов, направленных в митохондрии для удаления избытка свободных радикалов.
Важным направлением в исследовании ишемического и гипогликемического повреждения нейронов является изучение возможности использования нейронами отличных от глюкозы энергетических субстратов и в первую очередь глутамина, так как его концентрация, по сравнению с другими аминокислотами, в головном мозге довольно высока (Ашмарин с соавт. 1999), и он способен утилизироваться митохондриями (Peng et al., 2007). В настоящее время значение альтернативных глюкозе и пирувату энергетических субстратов в поддержании ионного баланса нейронов в патологических условиях мало изучено, а сохранение функциональной активности (мембранного потенциала) митохондрий с помощью глутамина до наших исследований прямо показано не было. Этот пробел был в значительной степени восполнен данной диссертационной работой. Таким образом, выяснение значения митохондрий, кальциевой перегрузки нейронов при патологических состояниях головного мозга, их взаимосвязи и взаимозависимости является актуальным направлением исследования и требует использования различных экспериментальных моделей. Это позволит выделить ключевые звенья в механизмах повреждения нейронов и прогнозировать возможности фармакологической коррекции ишемических нейродеструктивных процессов.
Наряду с исследованием патогенетических процессов во взрослом организме, связанных с энергетическим дефицитом, для развивающегося мозга существует такая проблема, как пренатальная гипоксия. Нейроны развивающегося мозга значительно отличаются от зрелых нейронов
отсутствием или низкой экспрессией рецепторов к возбуждающим медиаторам, а также незрелостью систем антиоксидантной защиты и поддержания ионного гомеостаза. Механизмы развития повреждений в зрелых и незрелых нейронах также могут существенно различаться. Так, при гипоксии/ишемии мозга новорожденных крыс апоптотическая гибель нейронов происходит в значительной степени с участием апоптоз-индуцирующего фактора, тогда как у взрослых животных апоптоз развивается по пути, связанному с активацией каспаз (Zhu et al., 2003). Однако знания о чувствительности нейронов различной нейрохимической зрелости к повреждающим факторам ишемии были отрывочны и фрагментарны, что требовало дальнейшего исследования.
Особый интерес представляет вопрос сопоставления морфологических и функциональных изменений митохондрий, а также их обратимости при энергетическом голодании.
Исходя из многоплановости повреждения нейронов при ишемии, ясно, что нельзя создать универсальный нейропротектор, поэтому поиск новых веществ с нейропротекторной активностью, которая реализуется в основных звеньях каскада повреждения нейронов (окислительный стресс, глутаматная токсичность, повреждение митохондрий), особо актуален. В работе исследовалось нескольких потенциальных нейропротекторов с сопоставлением их влияния на выживаемость нейронов при моделировании повреждающих факторов ишемии in vitro и in vivo.
Целью исследования явилось изучение внутриклеточных механизмов ишемических неиродеструктивных процессов, выяснение роли митохондрий, ионов кальция и цинка, глутамина, снижения активности Na+/K+-ATPa3bi и проверка возможности эффективной защиты нейронов с помощью белково-пептидных комплексов и матохондриально-адресованных антиоксидантов.
Задачи исследования
1. Изучить и сопоставить морфологические ультраструктурные
изменения митохондрий с их функциональным состоянием в культивированных
зернистых нейронах мозжечка крыс при глюкозной депривации.
-
Выявить зависимость выживаемости зернистых нейронов мозжечка при действии глутамата, глюкозной депривации, окислительного стресса и ацидоза от сроков культивирования.
-
Исследовать роль митохондрий в изменении концентрации свободного внутриклеточного кальция при глюкозной депривации.
4. Выявить в культивированных нейронах механизм инициации
окислительного стресса, вызванного паракватом (ингибиторный анализ).
5. Выяснить механизм гибели зернистых нейронов при закислении среды
культивирования (ацидозе) путем сопоставления изменения уровня
внутриклеточного кальция, цинка, функциональной активности митохондрий и
экспрессии кислоточувствительных каналов, проницаемых для ионов Са2+ .
-
Исследовать роль глутамина в гибели нейронов, вызванной глюкозной депривацией, ацидозом, окислительным стрессом, а также митохондриальными ингибиторами (химическая гипоксия).
-
Изучить влияние умеренной транзиторной блокады Na+/K+-ATPa3bi на выживаемость нейронов при действии окислительного стресса и индуктора апоптоза стауроспорина.
8. Исследовать внутриклеточную локализацию нового класса
антиоксидантов и влияние предполагаемых нейропротекторов на выживаемость
нейронов при действии повреждающих факторов ишемии in vitro
(окислительный стресс и глутаматная токсичность) и на объем зоны
повреждения при моделировании ишемии in vivo (фотоиндуцированный
тромбоз или компрессионная ишемия).
Научная новизна исследования. Изучены внутриклеточные механизмы, ведущие к гибели нейронов при ишемии, на основе моделирования в глионейрональных культурах ее повреждающих факторов: цитотоксичности глутамата, ацидоза, окислительного стресса, глюкозной депривации, выявлении роли митохондрий, глутамина, ионов кальция и цинка и сопоставлении полученных данных in vitro и in vivo.
В результате работы получены новые фундаментальные данные, раскрывающие механизмы ишемических неиродеструктивных процессов и свидетельствующие об их тесной взаимосвязи с дисфункцией митохондрий и нарушением ионного баланса нейронов.
Впервые установлено, что глутамат и глюкозная депривация культивированных зернистых нейронов мозжечка ведут к кальцийзависимому падению мембранного потенциала митохондрий этих клеток, которое при часовой глюкозной депривации было обратимым.
При сопоставлении функциональной активности и ультраструктуры митохондрий нейронов впервые выявлено, что часовая глюкозная депривация ведет к снижению мембранного потенциала у всей популяции митохондрий, однако их морфология варьирует от полностью интактных до органелл с конденсированным матриксом или с локальными набуханиями и потерей крист.
Впервые показано, что кальциевая перегрузка и снижение мембранного потенциала митохондрий при глюкозной депривации более выражено в зрелых зернистых нейронах, культивированных 7 суток.
Обнаружено, что ингибирование митохондриальных функций (белковых комплексов цепи переноса электронов или АТРсинтазы, разобщение дыхания и фосфорилирования) в период глюкозной депривации увеличивает кальциевую перегрузку цитоплазмы, но снижает уровень АФК культивированных нейронов.
Выявлено, что в условиях глюкозной депривации глутамин поддерживает мембранный потенциал митохондрий нейронов и препятствует клеточной гибели, но потенцирует ее, если причиной повреждения нейронов является нарушение функционирования митохондрий.
Открыт новый механизм гибели нейронов при закислении среды
культивирования. Незрелые зернистые нейроны мозжечка in vitro характеризуются низким уровнем экспрессии кислоточувствительных каналов (ASIC la), поэтому внеклеточный ацидоз сопровождается не повышением уровня внутриклеточного кальция в этих клетках, а его снижением. Токсическое действие ацидоза на такие культуры обусловлено повышением в цитоплазме нейронов уровня свободного цинка, что вызывает ингибирование первого комплекса дыхательной цепи митохондрий и развитие окислительного стресса.
Впервые показано, что шунтирование первого комплекса цепи переноса электронов митохондрий менадионом при действии параквата оказывает нейропротекторный эффект.
Фармакологическое прекондиционирование (умеренная транзиторная блокада Na7K+-ATPa3bi) препятствует гибели нейронов, вызванной окислительным стрессом и индуктором апоптоза стауроспорином;
Белковый комплекс целлекс, аналог фактора роста нервов ГК-2 и новый класс митохондриально-адресованных антиоксиданов SkQ проявляют выраженные нейропротекторные свойства при моделировании ишемии in vitro и in vivo, повышая выживаемость культур и уменьшая объем зоны повреждения головного мозга.
Научно-практическое значение работы
Представленные данные оригинальны и приоритетны, они расширяют представления фундаментальной нейробиологии как о внутриклеточных механизмах ишемического повреждения мозга, так и возможностях повышения ишемической толерантности ЦНС. В ходе работы обнаружен новый механизм развития гибели незрелых нейронов, вызванной внеклеточным ацидозом, показана возможность обратимости процесса деэнергизации митохондрий при глюкозной депривации. Полученные в работе экспериментальные данные и теоретические выводы могут быть использованы в курсах лекций по клеточной биологии, цитологии, патофизиологии при обучении студентов биологических и медицинских специальностей.
Показанная эффективная коррекция ишемических повреждений белковым комплексом целлекс, пептидным аналогом фактора роста нервов ГК-2, митохондриально-аднесованными антиоксидантами семейства SkQ является экспериментальным обоснованием возможности практического применения исследованных нейропротекторов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Выживаемость зернистых нейронов при моделировании повреждающих факторов ишемии in vitro зависит от сроков культивирования: при глюкозной депривации и токсическом действии, опосредованном гиперактивацией глутаматных рецепторов, гибнет больший процент зрелых клеток-зерен, а при окислительном стрессе и ацидозе — незрелых.
2. При глюкозной депривации в культивированных зернистых нейронах
мозжечка происходит увеличение внутриклеточной концентрации ионов
кальция и падение мембранного потенциала митохондрий, которое не всегда
сопровождается необратимым изменением их ультраструктуры. Деэнергизация
большинства митохондрий является обратимой при короткой (1ч) глюкозной
депривации. Ингибирование комплексов цепи переноса электронов
митохондрий в период глюкозной депривации увеличивает кальциевую
перегрузку цитоплазмы нейронов. Глутамин в условиях глюкозной депривации
поддерживает мембранный потенциал митохондрий нейронов и препятствует
их гибели, но потенцирует ее при нарушении функционирования митохондрий.
3. Нейроцитотоксическое действие ацидоза и параквата на
культивированные зернистые нейроны мозжечка происходит с нарушением
функционирования комплекса 1 цепи переноса электронов митохондрий,
которое может корректироваться шунтированием этого комплекса менадионом.
Гибель зернистых нейронов мозжечка при ацидозе происходит в результате
повышения уровня цитоплазматического цинка.
4. Повысить выживаемость нейронов можно путем применения
нейропротекторов - аналогов факторов роста или митохондриально-
адресованными антиоксидантами, которые действуют на такие повреждающие
факторы ишемии, как глутаматная токсичность или окислительный стресс.
Апробация диссертационного материала
Основные положения диссертации были представлены на 2м съезде биохимического общества РАН (Пущино, 1997), Зй международной конференции «Колосовские чтения 97» (Санкт-Петербург, 1997), 33м международном конгрессе физиологических наук (Санкт-Петербург, 1997), Международной конференции «Функциональная нейроморфология. Фундаментальные и прикладные исследования» (Минск, 2001), 2й - 6й Всероссийских конференциях с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация коррекция» (Москва, 1997, 2002, 2005, 2008, 2011), на 2м и Зм конгрессах по патофизиологии (Москва, 2000, 2004), Конференции «Пластичность и структурно-функциональная взаимосвязь коры и подкорковых образований мозга» (Москва, 2003), Конференции по проблеме «Механизмы синаптической передачи» (Москва, 2004), Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2005), Всероссийских научных конференциях с международным участием НИИ мозга и НЦН РАМН по проблеме «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» (Москва, 1999, 2000, 2005, 2006, 2007, 2008, 2010), 5й Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения - 2006» (Санкт-Петербург, 2006), XX и XXI съездах физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007; Калуга, 2010), Научном конгрессе «Бехтерев - основоположник нейронаук: творческое наследие, история и современность» (Казань, 2007), Конференции с
международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008), 2м международном форуме по нанотехнологиям, научно-техническая секция "Нанотехнологии в медицине: иммунологичекие препараты и адресная доставка лекарств" (Москва, 2009), VI и VII Международных междисциплинарных конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2010, 2011), X конгрессе международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010), межлабораторной конференции отдела исследований мозга НЦН РАМН (2009, 2011), научной конференции НЦН РАМН (2010), семинаре кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (2012).
Внедрение в практику
Результаты исследования используются в учебном процессе при чтении лекций на кафедре клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, научно-исследовательской работе и при обучении студентов и аспирантов в лаборатории структуры и функции митохондрий НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, внедрены в практику исследований лаборатории ишемических повреждений мозга ФГБУ «НИИ общей патологии и патофизиологии» РАМН.
Конкретное личное участие автора в получении результатов
Автору принадлежит определяющая роль в выработке цели исследования, постановке задач и обосновании путей их достижения, проведен анализ 535 источников литературы. Основная часть экспериментов, анализ и статистическая обработка результатов и формулировка на их основе выводов о механизмах повреждения нейронов выполнены лично автором.
По теме диссертации опубликовано 73 работы, в том числе 27 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ (15 в отечественных и 12 в зарубежных).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 280 страницах, построена по традиционному плану и состоит из 7 глав: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение, выводы и список литературы, включающий 535 источников. Работа иллюстрирована 87 рисунками: диаграммами, фотографиями, схемами.
Развитие ишемического повреждения нейронов головного мозга
Представленные данные оригинальны и приоритетны, они расширяют представления фундаментальной нейробиологии как о внутриклеточных механизмах ишемического повреждения мозга, так и возможностях повышения ишемической толерантности ЦНС. В ходе работы обнаружен новый механизм развития гибели незрелых нейронов, вызванной внеклеточным ацидозом, показана возможность обратимости процесса деэнергизации митохондрий при глюкозной депривации. Полученные в работе экспериментальные данные и теоретические выводы могут быть использованы в курсах лекций по клеточной биологии, цитологии, патофизиологии при обучении студентов биологических и медицинских специальностей.
Показанная эффективная коррекция ишемических повреждений белковым комплексом целлекс, пептидным аналогом фактора роста нервов ГК-2, митохондриально-аднесованными антиоксидантами семейства SkQ является экспериментальным обоснованием возможности практического применения исследованных нейропротекторов.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Выживаемость зернистых нейронов при моделировании повреждающих факторов ишемии in vitro зависит от сроков культивирования: при глюкозной депривации и токсическом действии, опосредованном гиперактивацией глутаматных рецепторов, гибнет больший процент зрелых клеток-зерен, а при окислительном стрессе и ацидозе — незрелых. 2. При глюкозной депривации в культивированных зернистых нейронах мозжечка происходит увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция и падение мембранного потенциала митохондрий, которое не всегда сопровождается необратимым изменением их ультраструктуры. Деэнергизация большинства митохондрий является обратимой при короткой (1 ч) глюкозной депривации. Ингибирование комплексов цепи переноса электронов митохондрий в период глюкозной депривации увеличивает кальциевую перегрузку цитоплазмы нейронов. Глутамин в условиях глюкозной депривации поддерживает мембранный потенциал митохондрий нейронов и препятствует их гибели, но потенцирует ее при нарушении функционирования митохондрий. 3. Нейроцитотоксическое действие ацидоза и параквата на культивированные зернистые нейроны мозжечка происходит с нарушением функционирования комплекса 1 цепи переноса электронов митохондрий, которое может корректироваться шунтированием этого комплекса менадионом. Гибель зернистых нейронов мозжечка при ацидозе происходит в результате повышения уровня цитоплазматического цинка. 4. Повысить выживаемость нейронов можно путем применения нейропротекторов - аналогов факторов роста или митохондриально адресованными антиоксидантами, которые действуют на такие повреждающие факторы ишемии, как глутаматная токсичность или окислительный стресс. Апробация диссертационного материала
Основные положения диссертации были представлены на 2м съезде биохимического общества РАН (Пущино, 1997), Зй международной конференции «Колосовские чтения 97» (Санкт-Петербург, 1997), 33м международном конгрессе физиологических наук (Санкт-Петербург, 1997), Международной конференции «Функциональная нейроморфология. Фундаментальные и прикладные исследования» (Минск, 2001), 2й - 6й Всероссийских конференциях с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация коррекция» (Москва, 1997, 2002, 2005, 2008, 2011), на 2м и Зм конгрессах по патофизиологии (Москва, 2000, 2004), Конференции «Пластичность и структурно-функциональная взаимосвязь коры и подкорковых образований мозга» (Москва, 2003), Конференции по проблеме «Механизмы синаптической передачи» (Москва, 2004), Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2005), Всероссийских научных конференциях с международным участием НИИ мозга и НЦН РАМН по проблеме «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» (Москва, 1999, 2000, 2005, 2006, 2007, 2008, 2010), 5й Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения -2006» (Санкт-Петербург, 2006), XX и XXI съездах физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007; Калуга, 2010), Научном конгрессе «Бехтерев - основоположник нейронаук: творческое наследие, история и современность» (Казань, 2007), Конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008), 2м международном форуме по нанотехнологиям, научно-техническая секция "Нанотехнологии в медицине: иммунологичекие препараты и адресная доставка лекарств" (Москва, 2009), VI и VII Международных междисциплинарных конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2010, 2011), X конгрессе международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010), межлабораторной конференции отдела исследований мозга НЦН РАМН (2009, 2011), научной конференции НЦН РАМН (2010), семинаре кафедры клеточной биологии и гистологии
Получение диссоциированных монослойных культур
Основными патогенетическими составляющими ишемического повреждения ткани головного мозга, связанного с нарушением его кровоснабжения, являются гипогликемия, обусловленная дефицитом глюкозы, и гипоксия, возникающая в результате кислородной недостаточности. Ишемический инсульт чаще всего происходит при тромбозе кровеносных сосудов головного мозга, снабжающих те или иные его структуры (фокальная ишемия) или прекращающем кровоснабжение всего головного мозга (глобальная ишемия). В индустриально развитых странах острые нарушения мозгового кровообращения являются причиной смерти почти 30% всех умерших. Поэтому изучение механизмов ишемического повреждения нейронов и поиск эффективных способов его коррекции является одной из актуальных задач современной клинической и экспериментальной неврологии и на протяжении многих лет привлекает внимание многочисленных отечественных и зарубежных исследователей.
Повреждающими факторами ишемии головного мозга, помимо энергетического дефицита, являются тесно связанные с ним глутаматная цитотоксичность, окислительный стресс, повышение уровня оксида азота (N0), кальциевый дисбаланс, дисфункция эндоплазматического ретикулума и митохондрий, ацидоз (Lipton, 1999; Guo et al., 2009). Изучать механизмы повреждающего действия этих факторов на клиническом материале очень сложно, а порой и невозможно. Поэтому одним из путей решения этой задачи является экспериментальное моделирование церебральной ишемии как на целом животном (in vivo), так и на культурах клеток головного мозга (in vitro).
В экспериментах in vivo можно моделировать как глобальную, так и фокальную ишемию. Глобальная ишемия достигается окклюзией сонных артерий в сочетании со снижением системного кровяного давления до 40 мм рт. ст., что вызывает развитие комплекса патоморфологических изменений во всем бассейне кровоснабжения перекрытых артерий, в том числе, в гиппокампе, стриатуме, новой коре (Eklof, Siesjo, 1972; Колтовер с соавт., 1975; Ганнушкина, 1977; Pulsinelli et al., 1982; Pulsinelli and Buchan, 1988; Hossmann et al., 1985, 1988). Наиболее часто используется двухсосудистая и четырехсосудистая окклюзия у крыс и двухсосудистая у монгольских песчанок (Lipton, 1999). Полная глобальная ишемия достигается при остановке сердца (Crumrine and Lamanna, 1991; Ekholm et al., 1992) и закупорке или пережатии всех отходящих от него артерий (Pluta et al., 1991; Kawaietal., 1992).
При моделировании фокальной ишемии прерывают кровоток в определенной области сосудов, преимущественно в бассейне средней мозговой артерии, что ведет к формированию очага инфаркта (Tamura et al., 1981; Watson et al., 1985; Dietrich et al., 1986; Ginsberg and Busto, 1989; Garcia et al., 1995). Наиболее известны модели перевязки средней мозговой артерии у крыс (Tamura et al., 1981) и перекрытия ветви средней мозговой артерии с помощью капроновой нити (Longa et al., 1989; Hunter et al. 1995. Силачев с соавт., 2009), однако эти методы сопряжены с рядом технических сложностей. Менее сложны модели эмболизации сосудистого русла с помощью микросфер или кровяных сгустков (Fieschi et al., 1978; Kudo et al., 1982; Futrell et al., 1991, 1993; Longa et al., 1989), однако у таких моделей высока вариабельность локализации ишемического очага.
Наименее инвазивной признана модель фотоиндуцированного тромбоза (Watson et al., 1985, 1987), поскольку она не требует трепанации черепа и основана на том, что при действии света с длиной волны 560 нм на введенный в кровоток фотосенсибилизированный краситель бенгальский розовый образуются активные формы кислорода, под влиянием которых возрастает адгезивность клеток эндотелия и тромбоцитов и формируются тромбы, закрывающие просвет сосудов, с последующей ишемизацией снабжаемых ими тканей. Следует отметить, что повреждение эндотелия происходит лишь в тех сосудах, до которых доходит возбуждающий свет, при этом площадь ишемического очага определяется размерами освещаемого участка. Таким образом в определённой области коры мозга создается постоянный по объему и локализации очаг ишемического повреждения и окружающая очаг область перифокального повреждения (так называемая пенумбра от лат. penumbra - полутень), где находятся погибшие, ишемизированные (гиперхромные) и неповреждённые нейроны (Astrup et al., 1981). Данный метод воспроизведения ишемической патологии может служить достоверным экспериментальным аналогом тромбоза сосудов головного мозга в неврологической клинике. (Барсков, 2000).
Патологические изменения в ткани мозга начинаются с первых минут после ишемии (рис. 1), что выражается в отечности, появлении клеток с гиперхромными ядрами и ацидофильной цитоплазмой (Попова с соавт., 1976; Lauersen et al., 1993), а уже через сутки начинает формироваться очаг некроза (Scholz, 1957). Вокруг ишемического очага располагается переходная зона (пенумбра), где присутствуют как погибшие, так и интактные нейроны, а также гиперхромные клетки, которые в дальнейшем могут либо дегенерировать, либо восстановиться (Боголепов, 1979; Astrup et al., 1981; Kunz A. et al., 2010). На 7й день отек мозга спадает, а на месте некроза происходят процессы формирования глио-мезодермального рубца и уменьшения пенумбры, которые заканчиваются к 20у дню (Колтовер с соавт., 1975; Барсков, 2000). Таким образом, создается постоянный по объему и локализации очаг ишемического повреждения в определенной области коры мозга.
Сравнительный анализ цитотоксического действия глутамата на зернистые нейроны в различные сроки культивирования
Одним из важных свидетельств участия эндогенных медиаторных возбуждающих аминокислот в развитии острых патологических состояний ЦНС является резкое повышение в ткани мозга внеклеточных концентраций глутамата и аспартата (Benveniste, et al., 1984; Choi, 1988), что, по мнению ряда авторов, является результатом как их усиленного выброса из нервных окончаний, так и нарушения функционирования АТР-зависимых систем их обратного захвата (Silverstein et al., 1986).
При исследовании гипогликемии на различных моделях было показано изменение содержания возбуждающих нейромедиаторов и их предшественников в нервной ткани. Независимо от типа модели, при гипогликемии происходило увеличение внеклеточного аспартата, а при инсулин-индуцированной коме обнаружено накопление хинолиновой кислоты в стриатуме крыс (Westerberg et al., 1990; Heyes et al., 1990). Оба эти вещества являются агонистами NMDA-подтипа ионотропных Glu-рецепторов. Данные по содержанию глутамата в ткани мозга при гипогликемии несколько противоречивы. Накопление Glu было показано в коре 1-2-недельных поросят при инсулин-индуцированной коме (Ichord, 2001), в цереброспинальной жидкости гипогликемических новорожденных (Aral et al., 1998) и в культуре ткани гиппокампа, где метаболизм глюкозы был ингибирован иодацетатом (Hernandez-Fonseca and Massieu, 2005, 2008). В других же работах показано снижение уровня Glu или глутамина при глюкозной депривации в культурах клеток переднего мозга, сетчатки, гиппокампа, стриатума (Madl and Royer, 1999; Zeevalk and Nicklas, 2000; Gundersen et al., 2001; Honegger et al., 2002, Rao et al, 2010). Авторы связывают эти изменения с тем, что глюкозный дефицит усиливает в нейронах расход аминокислот в реакции дезаминирования с последующей их утилизацией в цикле трикарбоновых кислот (Zeevalk, Nicklas, 2000; Honegger et al., 2002) Следует отметить, что понижение глюкозы в среде культивирования увеличивает чувствительность нейронов к токсическому действию Glu (Ioudina et al., 2004). Эта гиперчувствительность сохраняется длительное время после восстановления доступа глюкозы в гликолитический процесс (Vergun et al., 2003), вероятно, в результате активации при гипогликемии поли(АДФ-рибоза)полимеразы 1 (PARP-1). PARP-1 в катализе потребляет цитозольный NAD, который является кофактором гликолиза, поэтому вызванная гипогликемией активация PARP-1 может ингибировать гликолиз, даже когда содержание глюкозы в клетке восстановлено (Suh et al., 2003, 2005).
Еще одним доказательством участия гиперактивации Glu-рецепторов в нейродегенеративных процессах при гипогликемии ЦНС является тот факт, что антагонисты NMDA-рецепторов in vivo и in vitro защищают нейроны от гипогликемического повреждения. Так, 2-амино-7-фосфоногептановая кислота препятствовала повреждению нейронов головного мозга при инсулин-индуцированной коме in vivo (Wieloch, 1985; Simon et al., 1986; Papagapiou and Auer, 1990) и при глюкозной депривации in vitro (Pelligrino et al., 1981; Rego et al., 1999; Patockova et al., 2003; Chinopoulos and Adam-Vizi, 2006). Ряд авторов отмечает, что ингибирование других подтипов Glu рецепторов не предупреждает гибель нейронов при гипогликемии (Мопуег et al., 1989; Facci et al., 1990; Tasker et al., 1992).
Данные, полученные при моделировании гипогликемии путем блокады гликолиза иодацетатом, не столь однозначны. В культуре клеток гиппокампа блокада NMDA-рецепторов предотвращала гибель нейронов, индуцированную иодацетатом (Hernandez-Fonseca and Massieu, 2005, 2008), тогда как при ингибировании гликолиза иодацетатом в культурах сетчатки блокада NMDA-рецепторов не оказывала защитного эффекта (Rego et al., 1999). Показано, что NMD А подтип Glu-рецепторов не вносят существенного вклада в деполяризацию нейронов при гипогликемии (Zhang et al., 1990). При глюкозной депривации удаление глутамина из среды культивирования усиливало повреждение нейронов и снижало защитное действие антагонистов NMDA подтипа Glu-рецепторов (Monyer and Choi, 1990). Исходя из приведенных данных, можно заключить, что, несмотря на значительные достижения в исследовании роли Glu-рецепторов в механизмах развития повреждений нейронов при гипогликемии, этот вопрос требует дальнейшего изучения.
Полученные в настоящее время данные ряда авторов свидетельствуют о том, что при гипогликемии мозга происходит массивная деполяризация с выходом ионов К+ из клеток и быстрым снижением концентрации внеклеточного кальция ([Са2+]е). Уже через 0,2 минуты гипогликемической комы у крыс происходило снижение [Са2+]е с 1,2 до 0,07 мМ, а через 15 мин -до 0,02 мМ (Kristian et al., 1993). В то же время, уровень внеклеточного К+ ([К+]е) повышался с 3,2 до 55 мМ (Zhang et al., 1990). Эти нарушения внеклеточного ионного баланса обратимы, поскольку уровень [К+]е возвращался к норме уже через 5 минут после прекращения комы введением животным глюкозы, тогда как [Са2+]е нормализовалась медленнее, восстанавливаясь через 5 минут после прекращения комы до 27% а через 15 мин - до 76% от исходного уровня (Kristian et al., 1993). Следует отметить, что блокада NMDA-рецепторов не предотвращает изменения межклеточного ионного баланса при гипогликемии. Поэтому полагают, что активация NMDA-рецепторов не имеет решающего значения для возникновения гипогликемической деполяризации (Zhang et al., 1990).
Влияние глутамина на выживаемость и [Са2+]! незрелых культивированных зернистых нейронов при действии ротенона
Определение внутриклеточных концентраций Са2+ и Zn2+ проводили при помощи флуоресцентных красителей Fluo-З или 4 AM и FluoZin-3 AM, соответственно (Molecular Probes). Для этого клетки инкубировали в минимальной среде Игла с при различных рН или СРС при других экспериментальных воздействиях и в последние 30 минут инкубации добавляли 5 мкМ красителя, затем двукратно промывали СРС.
Для анализа функционального состояния митохондрий клетки после повреждающего воздействия Glu окрашивали родамином 123 (Р123), растворенном в СРС (5 мкг/мл, 10 минут) или же эфиром тетраметил родамина (ТМРЭ, 0,1-0,2 мкМ, 15 мин) и отмывали 2 мин в СРС. Данная методика позволяет визуально определить наличие потенциала на митохондриальной мембране (A\/m) (Johnson et al., 1981). Флуоресценцию окрашенных клеток наблюдали с помощью микроскопа "МБИ-15" или "Olympus", при облучении синим светом с длиной волны 450-490 нм для Р123 или зеленым с длиной волны 530/640 нм для ТМРЭ. В качестве независимого от потенциала маркера митохондрий использовали митотрекер зеленый (0,2 мкМ, 30 мин).
Для определения продукции супероксида клетки инкубировали с гидроэтидином (1 мкМ 40 мин.), и наблюдали свечение при возбуждении светом с длиной волны 530 нм и эмиссии 640 нм (Nicholls and Budd, 2000).
Электронная микроскопия проводилась совместно с Р.Э. Узбековым из Отдела клеточной биологии и электронной микроскопии медицинского факультета университета (Тур, Франция). Покровные стекла с КЗН мозжечка после экспериментального воздействия (15-минутной обработки Glu или 1 ч глюкозной депривации) или инкубированные такое же время в СРС, промывали СРС и фиксировали в течение 1 часа при 4 С в 2,5% растворе глутарового альдегида, приготовленного на фосфатном буфере (рН 7,2). После 2-кратного отмывания (по 10 минут) фосфатным буфером с добавлением глюкозы клеточный монослой дополнительно фиксировали 1% раствором Os04 в течение 30 минут, затем промывали трижды фосфатным буфером, контрастировали уранилацетатом, обезвоживали в спиртах восходящих концентраций и заключали в эпон-812 по стандартной методике (Боголепов, 1976; Скибо, 1988). Покровные стекла от эпоновых капсул отделяли с помощью жидкого азота. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме "LKB-3", монтировали на бленды, покрытые формваровой пленкой. Полученные препараты в течение 5 минут контрастировали уранилацетатом и окрашивали цитратом свинца по Рейнольдсу в течение 10 минут. Срезы просматривали и фотографировали на электронном микроскопе "HU-11" при ускоряющем напряжении 75 кВ или на JEOL 1011 (Япония). Для электронномикроскопического исследования было использовано 30 культур.
Количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (niJP,_Quantitative realime PCR) проводилась совместно с Д. Фрайер и Ф. Мергенталер из отдела экспериментальной неврологии Центра исследования инсульта Берлинского университета. Анализ экспрессии мРНК ASICla проводили в первичных культурах зернистых нейронов мозжечка и коры больших полушарий мозга, как описано в статье Прусса с соавторами (Pmss et all, 2008). Относительные уровни экспрессии продуктов реакции амплификации, полученных с помощью обратной транскриптазы на РНК-матрице, сравнивали с экспрессией b-актина с помощью стандартного набора реактивов (LightCycler System and FastStart DNA-Master SYBR-Green-I Kit, Roche Molecular Biochemicals). Условия проведения реакций были: 95С, 10 мин; 30 циклов: 95С, 15 с, 63С, 10 с, 72С, 15 с; обнаружение амплификатов в 86С. Использовались специфические последовательности (Eurofms MWG Operon) для b-актина: FWD 5 -АСССА CACTGTGCCCATCTA-3 , REV 5 -GCCACAGGATT ССАТАСССА-3 и для ASICla: FWD 5 -CCAAGTAC CTGGCCAAGAAGTTC-3 , REV 5 -GGCACTTTCCA CGTCTGCAC-3 .
Двусторонний фокальный ишемический инфаркт префронтальной коры головного мозга крыс (поля Frl и Fr2 согласно стереотаксическому атласу (Paxinos and Watson, 1986) создавали методом фотоиндуцируемого тромбоза (Watson et al., 1985) в совместных исследованиях с д.б.н. Г.А. Романовой. Животных наркотизировали хлоралгидратом (300 мг/кг, в/б). Фотосенсибилизируемый краситель бенгальский розовый (Sigma Chem.Co.) вводили в яремную вену (3% раствор, 40 мг/кг). Голову животного фиксировали в стереотаксисе и после продольного разреза кожи удаляли надкостницу. Световод (диаметр светового пучка на выходе 3 мм) устанавливали на расстоянии 1 мм от поверхности черепа по координатам: 2 мм ростральнее брегмы и 2 мм латеральнее сагиттального шва (рис. 9). Облучение холодным светом - = 560 нм (источник - лампа 24 В мощностью 250 Вт, охлаждаемая вмонтированным в установку вентилятором) проводили в течение 20 мин с каждой стороны. Ложнооперированные животные подвергались тем же процедурам, за исключением введения бенгальского розового.
