Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Медико-биологические эффекты тритерпеноидов 17
1.1. Органотоксические и системные побочные эффекты основных групп противоопухолевых препаратов 17
1.2. Модификаторы биологических реакций как средства дополнительной противоопухолевой терапии 25
1.3. Фармакологические свойства лупановых тритерпеноидов 35
1.4. Молекулярные и клеточные механизмы действия тритерпеноидов 50
1.5. Резюме 57
Собственные исследования
Глава 2. Материал и методы исследования 59
2.1. Общая характеристика химических соединений, используемых моделей и экспериментальных групп 59
2.2. Методы морфологического анализа 63
Глава 3. Скрининг гепатопротекторнои, антиоксидант ной, противовоспалительной и противоопухолевой активности лупановых тритерпеноидов 66
Глава 4. Морфологический анализ и клеточные механизмы политаргентных эффектов тритерпеноидов в условиях изолированного и комбинированного введения с противоопухолевыми препаратами 80
4.1. Исследование клеточных механизмов коррекции бетулоновой кислотой и ее Р-аланиламидом цитотоксических эффектов циклофосфана у интактных животных 80
4.2. Морфологические изменения печени после введения животным циклофосфана и тритерпеноидов
4.3. Морфологические изменения миокарда после введения животным циклофосфана и тритерпеноидов 133
4.4. Исследование клеточных механизмов коррекции бетулоновой кислотой и ее р-аланиламидом цитотоксических эффектов доксорубицина у интактных животных 147
4.5. Морфологические изменения печени после введения животным доксорубицина и тритерпеноидов 150
4.6. Морфологические изменения миокарда после введения животным доксорубицинаи тритерпеноидов 164
Глава 5. Исследование коррекции бетулоновой кислотой и ее производными цитотоксических эффектов комбинированного введения цитоста-тиков по схеме chop у интактньгх животных .. 176
5.1. Модулирующее влияние тритерпеноидов на показатели периферической крови и костного мозга в постцитостатическом периоде 176
5.2. Структурная организация почек в постцитостатическом периоде на фоне применения тритерпеноидов 182
5.3. Структурная реорганизация печени в постцитостатическом периоде на фоне применения тритерпеноидов 183
Глава 6. Оценка политаргетного действия тритерпеноидов в условиях цитостатической полихимиотерапии chop у животных с перевиваемыми опухолями 188
6.1. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию печени мышей с перевитой карциномой легких Льюис на фоне полихимиотерапии 188
6.2. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию печени мышей с перевитой лимфомой RLS 195
6.3. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию почек мышей с перевитой карциномой легких Льюис 197
6.4. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию почек мышей с перевитой лимфомой RLS 199
6.5. Влияние тритерпеноидов на показатели белой крови и костного мозга у мышей с перевиваемыми опухолями 201
6.6. Антиоксидантное действие тритерпеноидов на фоне полихимиотерапии 206
6.7. Влияние лупановых тритерпеноидов на противоопухолевый эффект полихимиотерапии 208
6.8. Влияние тритерпеноидов на антиметастатический эффект полихимиотерапии 210
Заключение 213
Выводы 224
Список литературы
- Модификаторы биологических реакций как средства дополнительной противоопухолевой терапии
- Методы морфологического анализа
- Морфологические изменения печени после введения животным циклофосфана и тритерпеноидов
- Структурная организация почек в постцитостатическом периоде на фоне применения тритерпеноидов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Совершенствование схем полихимиотерапии злокачественных опухолей является одной из актуальных проблем практической онкологии. Наряду с разработкой препаратов, обладающих высокой цитостатической активностью, в последнее время также развивается направление, связанное с поиском агентов – модификаторов биологических реакций, повышающих переносимость традиционной противоопухолевой терапии. (Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000; Трещалина Е.М., 2005; Pucheault M., 2008). Основными требованиями к агенту-кандидату являются низкая токсичность, отсутствие стимулирующего влияние на опухоль и ее метастазы, усиление противоопухолевого иммунитета, повышение морфо-функционального статуса здоровых клеток и тканей.
Большинство применяемых в клинической практике препаратов-модификаторов является иммуномодуляторами белковой природы: БСЖ, препараты тимуса (Т-активин, тималин), полипептиды (бестатин, циклоспорин А), цитокины и факторы роста, стимуляторы гемопоэза (колониестимулирующие факторы) и др. Побочными эффектами данных биогенных стимуляторов являются нежелательные иммунологические реакции (выработка нейтрализующих антител, сенсибилизация), а также способность стимулировать в определенных условиях рост первичного узла или метастазов опухоли (Трещалина Е.М., 2005; Корман Д.Б., 2006). Этих недостатков лишены препараты растительного происхождения, обладающие противоопухолевыми и антиметастатическими свойствами. В лечении злокачественных новообразований показана высокая эффективность экстрактов шлемника байкальского, элеутерококка, подорожника, побегов и листьев облепихи и др. (Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000; Амосова Е.Н. и др., 2003). Поскольку растительные соединения обычно обладают комплексной активностью (гепатопротекторной, антиоксидантной, противовоспалительной и иммуномодулирующей) и лучше переносятся организмом, то они остаются в фокусе внимания при отборе корректоров химиотерапии.
В настоящее время поиск перспективных растительных корректоров цитостатиков ведется среди соединений различных классов: алкалоидов, сапонинов, флавоноидов, кумаринов, полисахаридов, терпеноидов и др (Жанатаев А.К. и др., 2004; Разина Т.Г. и др., 2006). В этом ряду особое значение имеют пентациклические тритерпеноиды лупанового типа – легкодоступные вторичные растительные метаболиты. В экспериментах in vitro установлено, что бетулин, лупеол, бетулиновая кислота и их производные проявляют противовоспалительную, противоопухолевую, противовирусную, антимикробную активность (Chartulvedula V.P. et al., 2003; Mutai C. et al., 2004; et al., 2006). В опытах на животных было показано, что эти агенты могут использоваться для профилактики и лечения злокачественных опухолей. Уникальным свойством данных соединений является сочетание цитотоксического действия на опухолевые клетки и низкой токсичности в отношении нетрансформированных клеток (Eiznhamer D.A., Ze-Qi Hu, 2004; Chaturvedy P.K. et al., 2008). В настоящее время бетулиновая кислота проходит клинические испытания за рубежом в качестве препарата для профилактики и лечения меланомы и диспластического невуса (Fulda S. et al., 2009). Синтетические трансформации тритерпеноидов лупанового ряда рассматриваются как современный и перспективный подход к получению нового поколения препаратов с противоопухолевыми и химиопревентивными свойствами (Baglin I. et al., 2003, Cichewicz R.H., Kouzi S.A., 2004).
Другой многообещающей лупановой платформой можно считать бетулоновую кислоту (БК), получаемую путем одностадийного окисления бетулина. Несмотря на то, что БК является близким структурным аналогом бетулиновой, ее синтетические превращения и фармакологические свойства, в отличие от последней, до сих пор широко не изучены. По имеющимся данным, полученным на культурах опухолевых клеток человека (миеломы, лимфомы, карциномы молочной железы и яичника и др.), цитотоксическая активность БК в 2 – 19 раз выше, чем у бетулиновой (Ле Банг Шон и др., 2004; Шинтяпина Ф.Б. и др., 2008).
Результаты исследований, проведенных за последние 10 лет, выявили молекулярные мишени тритерпеноидных соединений в клетке, что позволило обосновать политаргетный механизм их действия. Показано, что взаимодействуя с белком KEAP1, тритерпеноиды активируют гены сигнального пути Nrf2, кодирующие семейство цитопротекторных белков, включая ферменты синтеза глутатиона, хинонредуктазу, каталазу, супероксиддисмутазу, гемоксигеназу, тиоредоксин, а также подавляют индукцию ЦОГ2 и NO-синтазы (Liby K.T. et al., 2007; Chaturvedy P.K. et al., 2008). Противовоспалительная активность агентов также связана с ингибированием белков сигнального пути NFB, регулирующего процессы воспаления, апоптоза и дифференцировки (Shishodia S. et al., 2006; Fulda S. et al., 2009). Противоопухолевое действие тритерпеноидов может реализовываться через индукцию ими внутреннего митохондриального пути апоптоза, не зависящего от внешнего, связанного с экспрессией р53 и CD95/FasL, что характерно для большинства противоопухолевых препаратов (Zarec J. et al., 2003; Eiznhamer D.A., Ze-Qi Hu, 2004). Последнее обстоятельство повышает интерес к тритерпеноидам, как агентам, способным преодолевать лекарственную устойчивость к традиционной химиотерапии. В доказательство этой способности в экспериментах на культурах опухолевых клеток был установлен синергический эффект бетулиновой кислоты с различными химиопрепаратами (доксорубицином, этопозидом, цисплатином, таксолом, актиномицином D), направленный на повышение апоптоза и подавление клоногенного окружения клеток опухоли (Fulda S. et al., 2005). Бетулиновая кислота также усиливает цитотоксический эффект винкристина на клетки меланомы (Sawada N. et al., 2005), повышает апоптотическую активность индуктора внешнего пути апоптоза TRAIL (Fulda S. et al., 2004).
Приведенные данные свидетельствуют о том, что лупановые соединения могут потенциально являться эффективными средствами дополнительной противоопухолевой терапии. Однако до настоящего времени интересы исследователей фокусировались в основном на изучении противоопухолевой активности тритерпеноидов, в то время как их свойства как модификаторов биологических эффектов цитостатической химиотерапии оставались за рамками внимания. В частности, практически не исследовано протекторное действие лупанов в тканях животных на фоне цитотоксических полиорганных эффектов традиционных противоопухолевых препаратов. Отчасти это связано с тем, что основные результаты были получены в экспериментах на культурах клеток, в то время как системных исследований in vivo не проводилось.
Таким образом, актуальность изучения лупановых тритерпеноидов в качестве потенциальных модификаторов цитостатической химиотерапии не вызывает сомнений. Решение данной проблемы связано, прежде всего, с исследованием не изученных ранее клеточных механизмов протекторного действия тритерпеноидов в условиях полиорганных цитотоксических эффектов как индивидуальных противоопухолевых препаратов, так и комбинированных схем полихимиотерапии.
Цель исследования – выявить среди тритерпеноидов ряда лупана соединения с комплексной протекторной и противоопухолевой активностью и изучить клеточные механизмы коррекции цитотоксических повреждений разных тканей при комбинированном и изолированном введении противоопухолевых препаратов, исследовать влияние лупановых тритерпеноидов на противоопухолевую и антиметастатическую эффективность цитостатический полихимиотерапии.
Задачи исследования:
-
Провести широкий скрининг фармакологических свойств соединений ряда лупана и выявить среди них агенты с гепатопротекторной, кардиопротекторной, нефропротекторной, антиоксидантной и противовоспалительной активностью. Изучить противоопухолевую активность и антиметастатический эффект лупановых тритерпеноидов.
-
Изучить особенности морфологических изменений печени и миокарда при изолированном применении бетулоновой кислоты и ее производных и при их сочетаниях с цитостатиками (циклофосфамидом и доксорубицином).
-
Изучить особенности внутриклеточной реорганизации гепатоцитов и кардиомиоцитов при изолированном применении бетулоновой кислоты и ее производных и при их сочетаниях с цитостатиками (циклофосфамидом и доксорубицином) с оценкой цитопротекторных и цитотоксических свойств исследуемых агентов.
-
Изучить особенности коррекции бетулоновой кислотой и ее производными токсических эффектов полихимиотерапии СНОР у интактных животных
-
Изучить характер влияния отобранных соединений на морфологию и лейкоцитарный профиль периферической крови, клеточный состав костного мозга, уровень перекисного окисления липидов в условиях полихимиотерапии СНОР у животных с перевиваемыми опухолями.
-
Установить характер морфологических изменений печени и почек в условиях комбинированного воздействия цитостатической полихимиотерапии СНОР и лупановых тритерпеноидов.
-
Оценить влияние различных лупановых тритерпеноидов на противоопухолевую и антиметастатическую эффективность цитостатической полихимиотерапии СНОР у мышей с перевиваемыми опухолями – карциномой легких Льюис и злокачественной лимфомой RLS, резистентной к циклофосфамиду.
Научная новизна. Впервые в результате комплексного морфологического исследования изучен характер модифицирующего влияния бетулоновой кислоты и ее производных на действие цитостатических препаратов в различных тканях интактных животных и у животных с перевиваемыми опухолями. Впервые установлены in vivo фармакологические свойства широкого спектра лупановых соединений. Выделены наиболее эффективные тритерпеноидные агенты для включения их в схемы противоопухолевой терапии.
Впервые установлены особенности ремоделирования печени, сердца и почек, отражающие коррекцию тритерпеноидами повреждений, вызванных противоопухолевыми препаратами. Показано, что применение тритерпеноидов после моделирования противоопухолевой химиотерапии способствует снижению выраженности дистрофических и некробиотических изменений паренхиматозных клеток без значимого влияния на цитостатические свойства противоопухолевых препаратов.
Впервые выявлены особенности ультраструктурной перестройки основных внутриклеточных компартментов гепатоцитов и кардиомиоцитов под действием цитостатиков и тритерпеноидов. Показано, что бетулоновая кислота и ее -аланиламид при изолированном введении интактным животным оказывают одновременно умеренное цитотоксическое и стимулирующее действие на клеточные популяции печени (гепатоциты, эндотелиоциты синусоидов, клетки Купфера) и миокарда (кардиомиоциты, эндотелиоциты). Впервые исследованы общецитологические особенности цитопротекторных и цитотоксических эффектов бетулоновой кислоты и ее -аланиламида, представлены их ультраструктурные эквиваленты.
Впервые показано, что бетулоновая кислота и ее -аланиламид, вводимые на фоне цитостатиков (циклофосфамида и доксорубицина), проявляют политаргетное действие на клеточные популяции печени и миокарда, потенцируя цитотоксическое действие цитостатиков в отношении одних клеток и стимулируя регенераторные реакции – в других. Восстановление ультраструктуры гепатоцитов и кардиомиоцитов при комбинированном применении цитостатиков и тритерпеноидов происходит быстрее. Установлено, что оба тритерпеноида не ингибируют клеточные формы регенерации гепатоцитов и кардиомиоцитов.
Получены доказательства иммуномодулирующей и противовоспалительной активности аланиламидов бетулоновой кислоты, лежащей в основе их системных эффектов и клеточных механизмов коррекции цитотоксического воздействия. Впервые проведено комплексное исследование протекторных свойств широкого ряда новых соединений лупанового типа, позволившее выявить перспективные агенты с антиоксидантной, гепатопротекторной и противовоспалительной активностью.
Теоретическая и практическая значимость. Впервые получены фундаментальные знания о фармакологической активности нового класса корректоров токсических эффектов цитостатической химиотерапии. Получены новые знания о характере тканевой и внутриклеточной реорганизации печени, почек, сердца и тимуса в условиях комбинированного и изолированного действия цитостатических противоопухолевых препаратов и тритерпеноидов лупанового типа.
Показана высокая перспективность бетулоновой кислоты как новой тритерпеноидной платформы для получения агентов с широким спектром фармакологической активности. На основании результатов исследования 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота рекомендована для доклинических испытаний в качестве препарата-модификатора цитостатической полихимиотерапии. Результаты исследования и методические подходы, разработанные в диссертации, могут быть использованы при подготовке материалов доклинических испытаний.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Тритерпеноиды лупанового ряда – новый класс модификаторов биологических реакций, оказывающих антиоксидантное, противовоспалительное и цитопротекторное действие при токсическом и лекарственном поражении. Аланиламидные производные бетулоновой кислоты в условиях цитостатической гемодепрессии модулируют содержание нейтрофилов и мононуклеаров в периферической крови.
-
К общецитологическим цитопротекторным свойствам бетулоновой кислоты и ее -аланиламида как при изолированном, так и комбинированным с цитостатиками применении относится их способность усиливать эндоцитозную (пиноцитозную) активность клеток и стимулировать в них процессы внутриклеточной регенерации. Оба агента не подавляют клеточные формы регенерации гепатоцитов и кардиомиоцитов.
-
К общецитологическим цитотоксическим свойствам обоих тритерпеноидов относится их способность вызывать умеренные литические изменения цитоплазматического матрикса, деструктивные изменения органелл и усиление аутофагических процессов. При комбинированном применении с цитостатиками бетулоновая кислота и ее производные способствуют более быстрому восстановлению ультраструктуры гепатоцитов и кардиомиоцитов, уменьшают степень выраженности дистрофических изменений эпителиоцитов почечных канальцев.
-
Введение БК и ее производных мышам-опухоленосителям понижает интенсивность перекисного окисления липидов и повышает противоопухолевый эффект цитостатической полихимиотерапии СНОР. В то же время бетулоновая кислота и ее -аланиламид уменьшают выраженность дистрофических и некробиотических изменений гепатоцитов, обусловленных неопластическим процессом и полихимиотерапией.
Апробация работы. Результаты исследования доложены на 2-м съезде Российского научного общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии» (Москва, 2003), XII Международной конференции «Медицина XXI века» (Словакия, Низкие Татры, 2004), Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Саратов, 2004), Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Ялта-Гурзуф, 2004), Научно-практической конференции с международным. участием «Медицина и образование в XXI веке» (Новосибирск, 2004), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Клинико-морфологические аспекты общепатологических процессов при социально значимых заболеваниях» (Новосибирск, 2004), Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), Научной конференции «Перспективы развития биотехнологии в России» (Пущино, 2005), III Всероссийской научной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007), III International Сonference «Basic science for Medicine» (Novosibirsk, 2007), III Съезде фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007), II Международной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Казахстан, Алматы, 2007), EHRLICH II, 2nd World Conference on Magic Bullets (Nurnberg, Germany, 2008), 2nd Annual Russian-Korean Conference «Current issue of natural products chemistry and biotechnology» (Novosibirsk, 2010), ученом совете в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 64 работы, из них 21 – в рецензируемых журналах по списку ВАК, получено 6 патентов.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 232 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 5 глав с результатами собственных исследований, обсуждения, выводов; иллюстрирована 33 таблицами, 56 микрофотографиями. Список использованной литературы включает 348 работ отечественных и иностранных авторов.
Модификаторы биологических реакций как средства дополнительной противоопухолевой терапии
К характерным морфологическим симптомам при циклофосфановом поражения печени относятся расширение синусоидов, пелиоз, вено-окклю-зионная болезнь [DeLeve L.D., 1996; Arndt C.et al., 2004]. Вено-окклюзион-ный синдром характеризуется повреждением, в первую очередь, мелких печеночных вен III зоны, которые особенно чувствительны к токсическим агентам. Клинически данный тип поражения печени характеризуется ее увеличением, болезненностью и асцитом. Развитие вено-окклюзионного синдрома часто сопровождается симптомами острого гепатита, который сопровождается ахолией, потемнением мочи, гепатомегалией, коррелирующей с повышением трансаминаз [Никитин И.Г. и др., 2002].
Другим часто встречающимся осложнением при лечении циклофосфа-ном является поражение почек, мочеточников и геморрагический цистит. Нефротоксичность препарата связана с его метаболитом акролеином, выделяющимся в неизмененном виде через почки [Гилман А.Г., 2006]. Морфологически геморрагический цистит характеризуется развитием некротических изменений в стенке мочевого пузыря и изъязвлением мембраны слизистой с отеком подслизистого слоя [Корман Д.Б., 2006]. Введение циклофосфана в высоких дозах приводит также к выраженным изменениям слизистой желудочно-кишечного тракта, в том числе к поражению эпителия пищевода и кишечника. При этом морфофункциональные нарушения проявляются в виде гиперкератоза эпителиоцитов, нарушения ядерно-цитоплазматического отношения в клетках разных слоев, увеличения зоны межклеточных промежутков, интерстициального отека, появления клеток с нетипичными ядрами [Исеева Е.А., Быков В.Л., 2006]. Циклофосфан также обладает кардиотоксическими свойствами. При его применении в терапевтических дозах у больных отмечались обратимые нарушения систолической функции сердца [Schimmel KJ.M. et al., 2004] и сердечная недостаточность [Ayash L.J. et al., 1992]. При введении препарата в дозах свыше 240 мг/кг имело место нарушение сердечной деятельности, которое сопровождалось повреждентем эндотелия и геморрагическим миокардитом [Basser R.L. et al., 1999]. Однократное введения циклофосфана крысам в дозе 125 мг/кг приводит к снижению массы сердца, уменьшению диаметра кардиомиоцитов, развитию контрактурных и литических повреждений кар-диомиоцитов, что сопровождается нарушениями гемодинамики [Лушникова Е.Л. и др., 2009]. Считается, что основной вклад в развитие кардиомиопатии вносит акролеин, вызывающий селективное повреждение миофиламентов путем химической модификации сократительных белков и белков цитоскеле-та [Luo J. et al., 2007]. К системным расстройствам при приеме циклофосфа-мида относится его иммуносупрессивное действие, влияние на репродуктивную функцию и риск вторичных лейкозов [Levine E.G. et al., 1992]. Еще одно осложнение - синдром гиперсекреции АДГ, возникающий при дозах свыше 50 мг/кг [DeFronzo R.A. et al., 1973].
Хлорметин (эмбихин) обладает более сильным некрозогенным действием, а также более выраженным угнетением кроветворения, чем циклофос-фамид. Менее токсичны в этом отношении мелфалан и хлорамбуцил.
Бусульфан вызывает стойкую тромбоцитопению, а также увеличивает риск вторичных лейкозов. Лечение бусульфаном обычно сопровождается ги-перурикемией, способствующей отложению уратов в канальцах почек. Специфическими осложнениями препарата являются катаракта, гинекомастия, хейлит, ангидроз и пигментация кожи [Tew К. et al., 2001].
Производные нитрозомочевины с успехом используются в терапии опухолей мозга, так как хорошо проникают через ГЭБ. Однако их применение ограничивает выраженная гематотоксичность, канцерогенность и высокий риск почечной недостаточности. Характерными побочными эффектами кармустина являются вено-окклюзионная болезнь печени, пневмосклероз, почечная недостаточность и вторичные лейкозы [Tew К. et al., 2001]. Менее токсичны гликозилированные производные нитрозомочевины - стрептозо-цин, хлорозотоцин [Гилман А.Г., 2006]. Противоопухолевые антибиотики. Обычными осложнениями терапии антрациклиновыми препаратами являются угнетение кроветворения, стоматит, алопеция, поражение ЖКТ и кожи. Специфическое осложнение -их кардиотоксичность. Применение доксорубицина, даунорубицина и ида-рубицина приводит к развитию дилатационной кардиомиопатии. Как у детей, так и у взрослых может развиваться отсроченная кардиомиопатия с развитием сердечной недостаточности через несколько лет после химиотерапии [Lipschultz S.E. et al., 1991]. Для острой формы поражения миокарда доксору-бицином характерны отклонения на ЭКГ, включая аритмии. В тяжелых случаях развивается миокардит с выраженными нарушениями проводимости и сердечной недостаточностью, часто в сочетании с перикардиальным выпотом. Хроническое кумулятивное поражении миокарда проявляется сердечной недостаточностью и обычно возникает при общей дозе доксорубицина 550 мг/м и более. Летальность превышает 50% [Гилман А.Г., 2006].
У животных в течение 30 суток после введения сублетальной дозы доксорубицина развивается застойная сердечная недостаточность за счет дилатационной кардиомиопатии с характерными изменениями коронарных артерий и дилатацией сосудов микроциркуляторного русла. В ранние сроки после введения наблюдается снижение массы миокарда за счет снижения общего количества кардиомиоцитов, которое восстанавливается к 14-м суткам.
Морфологическое исследование показало, что основные события, определяющие ремоделирование сердца, начинают происходить на 20-е сутки и состоят в необратимом повреждении части кардиомиоцитов с их последующей элиминацией и кардиосклерозом. При этом повреждение носит мозаичный (диффузный) характер, что в условиях гемодинамической нагрузки способствует эксцентричному смещению сохранившихся мышечных волокон. Установлено, что данные изменения связаны с апоптотической гибелью кардиомиоцитов и изменениями физико-химических свойств компонентов внеклеточного матрикса [Лушникова Е.Л. и др., 2004].
Методы морфологического анализа
В последние десятилетия достигнут значительный прогресс в изучении молекулярных мишений пентациклических тритерпеноидов в клетке. Установлено, что эти соединения взаимодействуют с различными киназами, вовлеченными в сигнальную трансдукцию, и, таким образом, могут модулировать активность транскрипционных факторов. Благодаря этим исследованиям стало понятно, каким образом высшие тритерпеноиды способны регулировать широкий спектр важнейших метаболических путей в предраковых и раковых клетках [Liby К.Т. et al, 2007, Sporn М.В. et al., 2007].
Установлено, что в основе молекулярного механизма действия тритерпеноидов лежит их способность взаимодействовать с клеточными нуклеофи-лами, такими как SH-группы цистеиновых остатков в целевых протеинах [Couch R.D. et al., 2005]. Это взаимодействие описывается как реакция присоединения Михаэля [Dinkova-Kostova А.Т. et al, 2001]. При этом локализация мест связывания зависит как от конформационной доступности SH-rpynn белков, так и от структуры самого агента. Например высокая противоопухолевая активность производного олеаноловой кислоты CDDO связана с наличием двух енольных группировок в кольцах А и Е [Sporn М.В. et al., 2007]. Его метиловый эфир CDDO-Me является мощным ингибитором медиаторов воспаления (iNOS и СОХ-2) и индуктором антиоксидантных ферментов [Honda Т. et al., 2000; Liby К.Т., 2005]. Наличие цианоенольной функции в кольце А усиливает противовоспалительную активность бетулиновой кислоты, а ее замена на метоксикарбонильную группу повышает противоопухолевые свойства соединения [Liby К.Т. et al, 2007].
Структурные особенности тритерпеноидов определяют селективность молекулы при высокоаффинном взаимодействии с мишенями. Необходимо подчеркнуть, что образующиеся аддукты с белками являются нестабильными, т.е. имеют временный характер, однако это взаимодействие является достаточным для передачи сигнала другим участникам сети, которые непосредственно вызывают биологический ответ. Таким образом, тритерпеноиды выступают как триггеры в каскадах сигнальной трансдукции и при этом не имеют непосредственной связи с отдаленной мишенью. В настоящее время считаются точно установленными три непосредственные молекулярные мишени пентациклических тритерпеноидов, которые определяют их противовоспалительное, цитопротекторное, индуцирующее дифференцировку, анти-пролиферативное и апоптоз-стимулирующее действие. Первая из них - КЕАР1 - является супрессором каскада реакций второй фазы метаболизма ксенобиотиков, участвующих в подавлении образования свободных радикалов. В состоянии покоя, этот белок находится в комплексе с транскрипционным фактором NRF2, инактивируя его.
Под действием реактивных форм кислорода происходит ращепление комплекса KEAP1-NRF2, в результате чего NRF2 транслоцируется в ядро, где он активирует элемент антиоксидантного ответа (ARE) на промоторном участке генов, кодирующих семейство цитопротекторных белков [Sporn М.В., 2005]. Это семейство включает ферменты синтеза и переноса глутатио-на, NADPH хиноноксидоредуктазу (NQ01), тиоредоксин, каталазу, суперок-сиддисмутазу (SOD), гемоксигеназу (НО) [Talalay P. et al., 2003; Eggler A.L.et al., 2005; Kobayashi M. et al., 2006]. Белок KEAP1 содержит в своем составе 25 цистеиновых остатков, два из которых являются высокореактивными и ответственны за диссоциацию комплекса тритерпеноидами [Zhang D.D. et al., 2003]. В работе [Couch R.D. et al., 2005] показано взаимодействие производных олеановой кислоты с реактивными цистеиновыми участками Keapl с последующей активацией NRF2, в то же время при использовании данных соединений в культуре клеток с мутантным генотипом КеарГ7", индукции ре-паративных ферментов не происходит [Dinkova-Kostova А.Т. et al., 2005].
Помимо описанного выше механизма активации антиоксидантных ферментов, тритерпеноиды могут непосредственно инактивировать индуци-бельные синтазу окиси азота (iNOS) и циклоокигеназу-2 (СОХ-2). В исследо-ваних in vitro и in vivo установлено, что производные олеаноловой и бетули-новой кислот подавляют активность обоих ферментов в макрофагах, стимулированных про-воспалительными агентами (интерферон у, интерлейкин-1(3, липополисахарид) [Honda Т. et al., 1998; Suh N. et al., 2003; Place A.E. et al., 2003; Zdzisinska B. et al., 2003]. При этом полумаксимальная константа инги-бирования iNOS у производного олеаноловой кислоты CDDO составляет 0.4 нМ [Honda Т. et al., 1998]. CDDO блокирует de novo синтез СОХ-2 в миофиб-робластах прямой кишки, стимулированных интерлейкином-1(3 [Suh N. et al., 1998].
Олеаноловые производные CDDO-Im и Di-CDDO подавляют активность этих ферментов в пико-молярных концентрациях [Honda Т. et al., 2002]. Производные бетулиновой кислоты с циано-группой в кольце А и различными заместителями в С-28 подавляют продукцию iNOS в первичных мышиных макрофагах, стимулированных интерфероном у, с эффективностью 1С5о-1,0 нМ/л [Liby К.Т. et al., 2007]. Лупеол также показал себя индуктором глу-татиона, супероксиддисмутазы и каталазы в условиях оксидативного стресса в печени, вызванного введением афлатоксина [Prasad S. et al., 2007].
Одним из последствий активации цитопротекторных ферментов 2-й фазы превращений является уменьшение реактивных кислородных частиц (ROS). Снижение ROS отмечалось после обработки клеток CDDO-Im в концентрации 1 - 1000 нм. Однако дальнейшее повышение концентрации того же тритерпеноида значительно увеличивают оксидативныи стресс и может приводить к апоптотозу [Ikeda Т. et al., 2003; Ikeda Т. et al., 2004; Samudio I. et al., 2005].
Другой установленной внутриклеточной мишенью тритерпеноидов является ядерный фактор NFKB, контролирующий работу генов, ответственных за клеточный цикл, воспаление, дифференцировку и апоптоз [Капп М. et al., 2005; Luo J.L. et al., 2005]. Активация NFKB происходит под воздействием про-воспалительных цитокинов, опухолевых промоторов, индукторов оксидативного стресса и канцерогенов. Тритерпеноиды подавляют конститутивную и индуцированную активность NFKB, взаимодействуя либо непосредственно с ним, либо с его супрессором - ІкВ киназой (IKK), активация которой приводит к фосфорилированию и деградации субъединицы ГкВа и последующей транслокации гетеродимеров р50 и р65 в ядро [Suh N. et al., 1998; StadheimT.A.,2002].
Показано, что Цистеин 179 в поли пептидной цепи 1КК взаимодействует с производным олеановой кислоты, содержащим в С28 имидазолиновую группу (CDDO-Im) [Yore М. М. Et al., 2006]. В экспериментах на животных с мутантным геном IKKJ3, в котором цистеин 179 был заменен на аланин, NFKB продолжал индуцироваться, не смотря на воздействие тритерпеноида [Ahmad R. et al., 2006]. NFKB является первым сигнальным звеном в каскаде запуска клеточного ответа на провоспалительные цитокины. В результате его актива 53
ции происходит транскрипция генов NO-синтазы и циклооксигеназы 2, а также матриксных металлопротеиназ. Кроме того, в иммунокомпетентных клетках он является фактором транскрипции генов цитокинов, таких как ФНОа, ИЛ6, ИЛ8, а так же участвует в образовании реактивных форм кислорода [Liby К.Т. et al., 2007].
Тритерпеноиды являются эффективными ингибиторами сигнального пути, контролируемого NFKB, однако для этого требуются их более высокие концентрации, чем при активации цитопротекторного пути NRF2. Показано, что олеаноловые тритерпеноиды подавляют активность iNOS и СОХ-2, вызванную NFKB В культуре макрофагов, в диапазоне концентраций 500 - 1000 нМ, тогда как инактивация тех же ферментов de novo присходит при более низком уровне олеанолов - 10 - 100 нМ [Liby К.Т. et al., 2007].
Важное значение в цитопротекторном и противовоспалительном действии тритерпеноидов имеет одновременная инактивация NFKB и активация NRF2 сигнальных путей с последующим запуском каскада второй фазы метаболизма, что способствует более эффективной утилизации реактивных форм кислорода. Показано, что активированные липополисахаридом ней-трофилы, с нокаутным геном Nrf2 A под воздействием имидазольного производного олеановой кислоты (CDDO-Im) продолжают экспрессировать цито-кины и продуцировать реактивные формы кислорода. В Nrf2+/+ клетках CDDO-Im индуцировал антиоксидантный каскад генов и ингибировал индукцию липополисахаридом комплекса реакций, связанных с NFKB [Zdzisin-ska В. et al., 2003; Thimmulappa R.K. et al., 2006]. Подобный механизм действия, при котором не происходит ингибирования активации NFKB, но и не происходит транскрипции подчиненных ему генов, был показан для сескви-терпеновых лактонов [Garcfa-Pineres A.J. et al., 2001] и сульфурофана [Heiss Е. et al., 2001]. Сообщалось, что бетулиновая кислота способна дестабилизировать мРНК транскрипты генов, активируемых NFKB [Shishodia S. et al., 2006].
Морфологические изменения печени после введения животным циклофосфана и тритерпеноидов
В то же время при действии обоих тритерпеноидов отмечался некроз и некробиоз отдельных гепатоцитов и эндотелиоцитов, преимущественно в пе-рицентральной зоне, формирование пррютеночных скоплений клеточного детрита.
Через 14 сут после введения БК и ее амида ультраструктура гепатоцитов была близка к норме. Хорошо была развита гладкая цитоплазматическая сеть, везикулы которой встречались как билиарном, так и на синусоидальном полюсах (рис. 23). В гепатоцитах присутствовали небольшие поля гликогена, отмечалась его умеренная секвестрация. В некоторых клетках отмечалось неравномерное расширение профилей гранулярной цитоплазматической сети и межмембранного околоядерного пространства (рис. 24).
Во всех гепатоцитах сохранялась выраженная эндоцитозная активность синусоидальной плазмалеммы (рис. 25). Появление в субплазмалеммальных зонах гепатоцитов везикул агранулярной цитоплазматической сети и выраженная эндоцитозная активность мембран способствовали тому, что суб-плазмалеммальные зоны гепатоцитов приобретали «пенистый» вид.
Через 14 сут после действия амида БК ультраструктура гепатоцитов в основном соответствовала норме (рис. 26), однако имелись и определенные отличия. В гепатоцитах хорошо ба развита гранулярная и агранулярная цитоплазматическая сеть, везикулы последней часто локализовались на синусоидальном полюсе (рис. 27). На билиарных полюсах гепатоцитов всегда присутствовали структурные элементы пластинчатого комплекса Гольджи, гранулярной и агранулярной цитоплазматической сети, первичные и вторичные лизосомы с характерной осмиофильной зернистостью (см. рис. 26).
Для амида БК характерным было появление в некоторых гепатоцитах митохондрий с просветленным матриксом и разреженными кристами (рис. 28); отмечался полиморфизм митохондрий. В таких гепатоцитах часто наблюдалось неравномерное расширение профилей гранулярной цитоплазматической сети, как правило, хорошо была развита агранулярная цитоплазматическая сеть.
Анализируя особенности тонкого строения гепатоцитов при действии амида БК, следует отметить в ряде гепатоцитов значительные изменения комплекса Гольджи. Концевые отделы диктиосом комплекса Гольджи были значительно расширены, содержали хлопьевидную субстанцию умеренной электронной плотности (рис. 29). Отмечалось отшнуровывание концевых отделов диктиосом с образованием первичных лизосом.
Эндотелий синусоидов был представлен в основном активированными формами, но после введения амида БК отмечалось появление некротизиро-ванных эндотелиоцитов. В обоих случаях наблюдалась значительная обтура-ция просветов синусоидов мононуклерами. Следует отметить, что в макрофагах (клетках Купфера), которые располагались в пространствах Диссе часто наблюдались такие же изменения тонкой структуры митохондрий, как в гепатоцитах - эти органеллы характеризовались выраженным полиморфизмом, матрикс их был значительно просветлен, кристы разрежены (рис. 30).
Через 3 сут после введения ЦФ и БК ультраструктура гепатоцитов была сходна с таковой после введения только одного ЦФ. В гепатоцитах присутствовало большое количество гликогена, который был подвержен лизису и секвестрации с образованием миелиноподобных структур (рис. 31), субплазма-леммально локализовались липидные включения и вакуоли с осмиофильным содержимым. Профили гранулярной цитоплазматической сети были неравномерно расширены, частично дегранулированы (рис. 32), гладкая цитоплаз-матическая сеть сильно редуцирована. Изменения тонкой структуры митохондрий касались частичной редукции крист.
В некоторых гепатоцитах следует отметить появление вакуолеобраз-ных расширений, вероятно, профилей гранулярной цитоплазматической сети, которые были заполнены хлопьевидным содержимым (рис. 33). Такие вакуо-леобразные структуры локализовались в основном в околоядерной зоне. На билиарном полюсе часто регистрировались вторичные лизосомы и остаточные тельца с мелкой осмиофильной зернистостью. В отличие от введения только одного ЦФ в данном случае отмечалась выраженная эндоцитозная активность синусоидальной плазмалеммы гепатоцитов (см. рис. 33).
В этот срок эксперимента в просветах синусоидов и перисинусоидаль-но располагалось большое количество клеток Купфера с многочисленными фагосомами с мелкой осмиофильной зернистостью (рис. 34). Такая осмио 119
Клетка Купфера с фагосомами с мелкой осмиофильной зернистостью через 3 сут после введения циклофосфана и бетулоновой кислоты. Ув. 20 000. фильная зернистость наблюдалась не только в фагосомах, но также в диф-фузно - в цитоплазме макрофагов и в цитоплазме эндотелиоцитов (рис. 35). Эти данные электронно-микроскопического анализа свидетельствуют о том, что бетулоновая кислота активно поглащается из кровотока разными типами клеток.
Через 3 сут после введения ЦФ и амида БК ультраструктура гепатоцитов была близка к норме. Отмечался выраженный полиморфизм митохондрий, которые представлены часто крупными формами с разрыхленным мат-риксом (рис. 36). В гепатоцитах часто выявлялись везикулы гладкой цито-плазматической сети (рис. 37), чаще на билиарном полюсе. Отмечались гиперплазия и гипертрофия структурных элементов комплекса Гольджи (рис. 38). Желчные капилляры, как правило, были расширенными и содержали ос-миофильную субстанцию. Отмечалась высокая эндоцитозная активность гепатоцитов и клеток Купфера.
Через 14 сут после введения ЦФ и БК отмечалась нормализация ультраструктуры одних гепатоцитов и усиление повреждения - других. В первых при этом сохранялись изменения тонкой структуры митохондрий, но появлялись везикулы гладкой цитоплазматической сети, отмечалась умеренная секвестрация гликогена (рис. 39). Во вторых отмечались субплазмалеммальные скопления вакуолеобразных остаточных телец и выраженная секвестрация гликогена. Наблюдался некроз отдельных гепатоцитов. В некоторых случаях регистрировалось нарушение плотных контактов между соседними гепато-цитами, формирование апоптотических телец, которые попадали в просветы синусоидов, где резорбировались макрофагами. В просветах синусоидов и в пространстве Диссе часто встречались активные формы макрофагов (рис. 40).
Через 14 сут после введения ЦФ и амида БК ультраструктура гепатоцитов была близка к норме. Отличительной чертой ультраструктурной организации гепатоцитов при действии амида БК было присутствие большого количества крупных митохондрий с неравномерно расширенными кристами (рис. 41). В некоторых митохондриях отмечалось формирование кристаллических структур. Биологические эффекты обоих тритерпеноидов проявлялись в усилении эндоцитозной активности как гепатоцитов, так и эндотелиоцитов и клеток Купфера. В обоих случаях сохранялся тромбоз части синусоидов мо-нонуклеарами.
Структурная организация почек в постцитостатическом периоде на фоне применения тритерпеноидов
Абсолютная численность кардиомиоцитов через 3 сут после введения ЦФ существенно не изменялась (11,607±1,199 х 10б, в контроле - 12,316 ±0,252 х 106), что свидетельствует о сохранении клеточной формы регенерации кардиомиоцитов. В миокарде крыс в этот срок эксперимента появлялись кардиомиоциты, в которых происходило митотическое деление ядер (рис. 43, а). В то же время следует отметить заметное уменьшение (на 31%) доли одноядерных кардиомиоцитов и увеличение (на 10%) доли двуядерных клеток.
Введение ЦФ вызывало нарушения гемодинамики, которые сохранялись на протяжении всего эксперимента: практически у всех животных кровеносные сосуды и капилляры кроме форменных элементов крови содержали плазму, наблюдались явления плазморрагии, регистрировался отек интерсти-циальной ткани (рис. 43, б). Общее число кардиомиоцитов через 14 сут после введения ЦФ возрастало на 50%, при этом доля одноядерных клеток также возрастала, но оставалась уменьшенной (на 13%) по сравнению с контролем.
При введении ЦФ и БК в миокарде животных через 3 сут более выраженной была мозаичность повреждений кардиомиоцитов, чем при введении только ЦФ (рис. 44, а). Возрастало количество клеток с контрактурными повреждениями, но одновременно отмечено поялвение популяции «малых» кардиомиоцитов. Как и при введении ЦФ, отмечались выраженные нарушения гемодинамики. Через 14 сут сохранялась мозаичность повреждений миокарда. Возрастало количество кардиомиоцитов с литическими изменениями цитоплазмы (у некоторых животных их доля составляла 30 - 40%). Сохранялись выраженные нарушения кровообращения: полнокровие сосудов и значительный интерстициальный отек (рис. 44, б).
Количественные изменения популяции кардиомиоцитов через 3 сут после введения ЦФ и последующего введения БК были такими же, как и после введения ЦФ (общее число кардиомиоцитов в сердце составляло 11,276 ± 1,085 х 10б). Отмечено снижение (на 32%) доли одноядерных кардиомиоцитов и увеличение доли двуядерных (на 10%). Через 14 сут эксперимента общая численность кардиомиоцитов существенно не отличалась от контроля. Оставалась уменьшенной доля одноядерных клеток (на 41%), доля двуядерных кардиомиоцитов была увеличена по сравнению с контролем на 20%. Уменьшение доли двуядерных клеток может быть обусловлено стимуляцией процесса кариокинеза без цитокинеза.
При введении ЦФ и амида БК через 3 сут эксперимента также манифестировали контрактурные и литические повреждения кардиомиоцитов (рис. 45, а). Одновременно присутствовали кардиомиоциты, в саркоплазме которых наблюдались многочисленные вакуолеобразные расширения (рис. 45, б). Через 14 сут усиливались проявления некробиоза и атрофии одних кардиомиоцитов и гипертрофия других; сохранялась мозаичность повреждения мышечных сегментов. Нарушения гемодинамики манифестировали, выраженность отека стромы варьировала. Наблюдалась диффузная инфильтрация стромы мононуклеарами, количество которых возрастало также в адвентиции интрамуральных артерий.
При комбинированном введении ЦФ и амида БК выявлено уменьшение общей численности кардиомиоцитов (на 26% - до 9,145±1,296 х 106 клеток) через 3 сут эксперимента при сохранении соотношения одно- и двуядерных клеток. К 14-м суткам эксперимента происходило восстановление общей численности кардиомиоцитов в сердце, но при этом уменьшалась (на 35%) доля одноядерных клеток и возрастала (на 19%) доля двуядерных клеток.
В группе с изолированным введением БК и амида БК через 3 сут наблюдались сходные изменения кардиомиоцитов: сочетание контрактурных и литических повреждений (рис. 46, а). Через 14 сут в миокарде животных, получавших БК, отмечено увеличение количества атрофированных и некробио-тически измененных кардиомиоцитов при одновременном увеличении количества гипертрофированных клеток. Гемодинамические нарушения сопровождались умеренной диффузной инфильтрацией стромы миокарда мононуклеарами; у некоторых животных отмечался мелкоочаговый кардиосклероз.
У животных, получавших амид БК, уже через 3 сут появлялись небольшие очаги кардиосклероза (рис. 46, б). Через 14 сут происходило усиление литических повреждений отдельных кардиомиоцитов. Отмечалось развитие диффузного и мелкоочагового кардиосклероза. Введение крысам БК и ее аланинового амида не вызывало заметного изменения общей численности кардиомиоцитов в сердце во все сроки эксперимента. Однако через 3 сут после введения амида БК выявлено увеличение на 92% доли одноядерных кардиомиоцитов и уменьшение доли дву- и многоядерных клеток. Через 14 сут после введения БК и ее амида происходило достоверное уменьшение доли одноядерных кардиомиоцитов соответственно на 39 и 28%.
По данным электронно-микроскопического анализа, введение ЦФ вызывало через 3 сут эксперимента умеренно выраженный преимущественно очаговый лизис миофибриллярных пучков (рис. 47, а), расширение везикул гранулярной и агранулярной саркоплазматической сети и деструкцию митохондрий с образованием миелиноподобных остаточных телец. При действии ЦФ в кардиомиоцитах сохранялось большое количество гликогена, наблюдалась его секвестрация (рис. 47, б). Ультраструктурные изменения ядер кар-диомиоцитов проявляются преимущественно в изменении их формы, значительных инвагинациях ядерной оболочки и транслокации в субсарколеммаль-ную зону. Через 14 сут после однократного введения ЦФ происходило восстановление ультраструктуры большинства кардиомиоцитов, однако в некоторых клетках сохранялись очаговые литические изменения миофибрилл и расширения межмембранного околоядерного пространства.
БК и ее амид при изолированном введении вызывали сходные с ЦФ, но менее выраженные изменения ультраструктуры кардиомиоцитов. К наиболее значимым повреждениям ультраструктуры относились лизис саркоплазмати-ческого матрикса и формирование миелиноподобных остаточных телец, особенно в околоядерной зоне, умеренный лизис миофибриллярных пучков, расширения везикул агранулярной саркоплазматической сети (рис. 48, а). Литические изменения миофибриллярных пучков были незначительными, в этих участках всегда локализовались полисомы, наблюдалось новообразование миофиламентов. Важно отметить, что при действии БК отмечалось формирование эндоцитозных (пиноцитозных везикул) и кавеол (рис. 48, б).
БК и ее амид в меньшей степени, чем ЦФ, вызывали в некоторых кардиомиоцитах расширения межмембранного околоядерного пространства (рис. 49). К особенностям амида БК относится его способность вызывать в некоторых клетках значительные повреждения тонкой структуры митохондрий (диффузный лизис митохондриального матрикса, редукцию крист и нарушение их упаковки), которые манифестировали на протяжении всего эксперимента. В некоторых кардиомиоцитах деструктивные изменения митохондрий были значительными, наблюдалось повреждение целостности их наружной и внутренней мембран; вблизи митохондрий часто обнаруживались скопления миелиноподобных структур.
