Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы.. 8
2.1. Идентификация фаз митоза 8
2.2. Генетический контроль митоза 10
2.3. Влияние физиологически активных веществ 14
2.4. Действие токсических и других соединений 18
2.5. Эффекты физических факторов 20
2.6. Воздействие онкогенной трансформации 25
3. Результаты 28
3.1. Методы и материал исследования 28
3.2. Изменчивость хромосомной композиции культуры при факторных изменениях среды 39
3.3. Кинетика митоза культивируемых клеток при изменениях плоидности и состава среды . 61
4. Обсуждение 96
5. Выводы 116
6. Литература 118
- Генетический контроль митоза
- Влияние физиологически активных веществ
- Изменчивость хромосомной композиции культуры при факторных изменениях среды
- Кинетика митоза культивируемых клеток при изменениях плоидности и состава среды
Введение к работе
Наиболее крупное достижение разработки проблемы клеточной репродукции во второй половине XX в. - учение о митотическом цикле / Заварзин, 1967, 1976; Prescott, 1968; MitcMson, 1973 ; Епифанова, 1973; Иванов, 1974; Конюхов, 1977; Бродский, Урываева, 1981; stubbiefieid,i98i; Заварзин, Харазова, 1982; Полуновский, 1983/. Результаты изучения морфологической, физиологической и биохимической организации митоза чрезвычайно обширны, но в кинетическом отношении клеточное деление до настоящего времени остается исследованным слабо. Лишь в самые последние годы стали появляться и накапливаться сведения о генах, контролирующих события митоза. Информация же о факторах, детерминирующих кинетику митоза и отдельных его фаз почти полностью отсутствует. Остается все еще не ясной роль дозы гена (полиплоидии) в контроле кинетики митоза. Что же касается управления кинетикой этого важнейшего биологического процесса, то до сих пор этот вопрос планомерному изучению не подвергался. Между тем актуальность изучения клеточной репродукции определяется ее значением для нормального и опухолевого роста, регенерации и дифференциации. Особый практический интерес представляет рассматриваемая проблема и для развития современных концепций (схем) оптимизации различных биотехнологических процессов - культивирование в промышленных условиях клеток растений и микроорганизмов.
Учитывая изложенные выше факты, а также принимая во внимание многочисленные свидетельства о том, что разнообразные физические и химические факторы могут препятствовать вступлению клетки в митоз, или задерживать ее переход из какой-либо одной его фазы в другую, мы предположили, что I) кинетика митоза доступна управлению на основе факторных изменений среды; 2) зависимость кинетики митоза от изменений среды определяется плоидностью клетки.
Цель исследования - экспериментальная проверка этих предположений с тем, чтобы в первом приближении оценить возможности управления кинетикой митоза посредством изменений окружающей клетку среды. Очевидно, лучшие условия для этого предоставляет перевивная суспендиальная культура растительных клеток. Вычленением из организма и переносом клеток в искусственно созданные условия устраняется влияние тканевых, органных и организменных регуляторных систем на клеточную репродукцию, что существенно упрощает ее анализ. В суспендиальной культуре практически каждая клетка - мишень непосредственного воздействия измененного окружения. Клетки растений, в отличие от их аналогов животного происхождения, можно выращивать на простых, химически определенных средах /Бутенко, 1981/, поэтому влияние на митоз не только среды в целом, но и каждого ее компонента в отдельности и во взаимодействии с остальными становиться доступным строгому количественному учету. Наконец, генетическая композиция перевивных линий растительных клеток поддается направленной и эффективной коррекции перенесением культуры на среду модифицированного состава /см.: Малюк и др., 1975 а,б/. Эта возможность использована и в диссертационной работе для дифференцированного анализа кинетики митоза в широком спектре кратных и некратных изменений хромосомного числа с выходом на выводы, доступные статистической оценке. Указанными соображениями продиктован
Выбор перевивной миксопдоидной культуры клеток Haplopappus gra cilis /Nutt/ Grey A. /2n=4/ в качестве объекта настоящего исследования.
До последнего времени в исследованиях воздействий физических и химических агентов на культивируемые клетки доминирует однофак-торный анализ. Между тем принцип последовательных изменений содержания в среде какого-либо одного из ее компонентов при постоянном уровне всех остальных чреват значительными потерями времени. Указанный принцип требует многократного повторения опытов для достижения даже небольшого, но статистически значимого эффекта. Наконец, подобный экспериментальный подход вообще не позволяет учесть межфакторные взаимодействия исследуемого компонента среды с остальными. Методологически более перспективен переход на использование идей, разработок и обобщений теории математического планирования уже апробированных исследованиями на микроорганизмах и на отдельных клеточных и тканевых культурах растительного происхождения /Вутенко, 1964, 1979, 1981; Максимов и Федоров, 1969; Финни, 1970; Малюк и др., 1975 а,б; Лысенков, 1979; Плескунин, Воронина, 1979; Максимов, 1980/.
Планирование экспериментов в настоящей работе осуществлено по полной многофакторной схеме. Это позволяло количественно оценить влияние одновременно всех компонентов питательной среды и их взаимодействий на хромосомную композицию перевивной популяции, митотическую активность и кинетические отношения в фазах митоза культивируемых клеток.
Научная новизна. На примере перевивной миксоплоидной популяции растительных клеток впервые получены доказательства того, что кинетика митоза доступна управлению на основе спланированных факторных изменений питательной среды. Собранный материал позволил количественно оценить эффективность и избирательность воздействий измененной среды и отдельных ее компонентов на уровень митотичес-кой активности культивируемых клеток и на отношения между фазами митоза. Определены также принципиальные ограничения, накладываемые на предложенный подход корреляционными отношениями в начальных фазах митоза и полиплоидией.
Представлены первые свидетельства значения полиплоидии для стабилизации кинетики деления клетки в измененном окружении. Стабилизирующий эффект умножения хромосомного числа зафиксирован по всем параметрам кинетики митоза. Умножение хромосомного набора способствует, таким образом, усилению резистентности вычлененной из организма тканевой клетки к воздействиям окружающей среды. В этом случае полиплоидия выступает как эволюционная стратегия.
Для культивируемых клеток высших растений впервые показана зависимость кинетики митоза от плоидности и установлены направления и пределы изменений относительной продолжительности его фаз при переходах с диплоидного на более высокие хромосомные числа. Полученные данные указывают, что умножение в клетке числа хромосом, по-видимому, сочетается с изменениями их структуры, усилением асинхронности их конденсации и конгрессии в митозе, или общим замедлением этих процессов. Анализ кинетики митоза в спектре кратных и некратных изменений числа хромосом позволил впервые доказать, что процесс анафазного расхождения дочерних хромосом по продолжительности варьирует независимым образом и от митотической конден-сации-конгрессии, и от статичного равновесия метафазных хромосом в экваториальной плоскости веретена. Этот факт согласуется с концепцией пофазной полигенной регуляции митоза и указывает, что экспрессия генов, ответственных за осуществление митотической конденсации-конгрессии, и генов, контролирующих расхождение хро - 7 мосом, затрагиваются полиплоидией неодинаково.
Практическая ценность положений и выводов диссертационной работы в том, что они включены кафедрой общей и молекулярной генетики КГУ им. Т.Г.Шевченко в курсы лекций для студентов биологического факультета. Выдвинутые и обоснованные в диссертации принципы управления кинетикой митоза на основе факторных изменений среды могут быть использованы для изучения репродукции и эволюции хромосомных наборов тканевых клеток в изолированных культурах, а также для оптимизации технологии выращивания растительных клеток в промышленных условиях. Предложенную конструкцию "ламинар-бокса" на базе серийных аэрозольных фильтров "Лаик" с электроподогревом воздушного потока на входе можно применять в работе с клеточными и тканевыми культурами.
Структура диссертации соответствует в целом общепринятым требованиям к научным квалификационным работам.
Генетический контроль митоза
Накопленный в литературе огромный материал представляет убедительные доказательства того, что скорость митотического деления клеток у разных видов различна /Мэзия, 1963; Алов, 1972; Гриф и Иванов, 1975/. В целом этот материал можно рассматривать как косвенное указание на то, что регистрируемые в скорости митоза различия наследственно предопределены. Здесь нет возможности детально обсуждать соответствующие данные. Отметим лишь, что в растительных клетках митоз, как правило, протекает медленнее , чем в клетках животного происхождения, что ставится в связь с большей длительностью профазы и стадии реконструкции дочерних ядер /Алов, 1972; Шестопалова, 1981/.
Значение функции генома в контроле клеточного цикла и митоза у высших организмов получило косвенное подтверждение в данных ин-гибиторного анализа. В клеточном цикле удалось выделить два периода, для которых необходим синтез специфических мРНК. Такими периодами оказались s и М . Транскрипция необходимых для их инициации иРНК осуществляется во время прохождения клетками более ранних этапов митотического цикла /обзоры: Епифанова, 1973, 1979; Полу-новский, 1982/. Был выделен и особый класс белков, получивших название "белков деления" / Prescott , 1968; Епифанова, 1973; Mitchison , 197і ; Sachsenmaier , 1980/. Не все из них идентифицированы, но биологическое действие многих установлено вполне определенно. В настоящее время известно уже около десяти белков, специфических для периода &2 Они определяют вступление клетки в митоз и его течение / Lasselain et all, 1978/.
Прямые доказательства существования генов, контролирующих события митоза, начали накапливаться лишь в последнее время. Они получены, в частности, на температурочувствительных / ts / цикло-специфических мутантах. Клетки этих мутантов нормально размножаются при "разрешающей" /пермиссивной/ температуре и задерживаются в специфических позициях процесса деления при ограничивающих /не-пермиссивных/ температурах. Первые сведения собраны на ts -мутантах дрожжей / Culotti, Hartwell, 1971; Hartwell, 1971; Hartwell etaL 1970, I97V. Детальный анализ последующих сообщений представлен В ряде СВОДОК /Hartwell et al., 1974; Hereford, Hartwell, 197 ; Hartwell, 1978; Nurse et al., 1976; Melero, 1979; Oonkie et al., 1980; Thuriaux, Nurse, 1980; Nurse, 1981/. У мутантнОЙ ЛИНИИ ОДНОГО из видов нематод обнаружено в постэмбриональном развитии пре крашение деления ядер и клеток После нормальных превращений в метафазе хромосомы не соединяются с нитями веретена и не расходятся к полюсам. Ядро вступает затем в интерфазную реконструкцию. Поскольку клетки мутантов, как и нормальных животных, проходят через несколько циклов репродукции с соответствующими попытками митотического деления, в итоге формируются крупные клетки с полиплоидными ядрами / Albertson et al. , 1978/. Известна мутация ау-тосомного рецессивного гена, контролирующего структуру и функционирование митотического аппарата и центриолей /Bloom et al., 1970; Bloom, Searle , 1973/. Другие мутации, нарушающие ахрома-тиновый аппарат веретена, приведены в сводке Шаминой и Голубов-ской /1981/. Обнаружены-также температурочувствительные мутации, затрагивающие у дрозофилы метафазное сокращение хромосом / Smith et al. , 1980/.
Еще одну группу доказательств представили исследования ts-мутантных культивируемых клеток млекопитающих. Начало работ в этой области, по-видимому, было положено описанием клеток РНК сирийского хомячка с ts -дефектом, препятствующим цитокинезу / Smith, Wigglesworth , 1972/. Впоследствии были получены и изучены ts -мутанты, дефектные по способности к репликации ДНК и к митозу. Эти мутации для большинства случаев оказались рецессивными. Их частота в гетероплоидных клеточных линиях, как правило, была выше, чем в диплоидных, вследствие частичной гемизиготности гетероплоидных клеток / Wang, 1974» 1976, 1978 а,Ъ;обзоры: simo novitch, Thompson, 1978; Conkie et al., 1980/.
Совокупность приведенных данных склоняет к мысли о том, что синтез факторов, определяющих подготовку к митотическому делению и его осуществление, вероятно, имеет индуцибельный характер. Од нако, собранных данных пока недостаточно для обоснованного суждения о том, каким образом осуществляется контроль длительности митоза и отдельных его фаз. Поэтому параллельно разрабатывается еще одно направление исследований, предусматривающее анализ влияния полиплоидии /дозы гена/ на кинетику митоза. Роль полиплоидии.
Результаты работ в данном направлении критически и всесторонне обсуждены Бродским и Урываевой /1981/. Это позволяет ограничиться лишь самыми общими положениями и выводами, которые могут быть отнесены к числу наиболее существенных и твердо установленных. Выяснено, в частности, что как у растений, так и у животных с повышением уровня плоидности, как правило, снижается способность клеток к пролиферации. Для клеток различных уровней плоидности наблюдается в основном, одинаковая продолжительность мито-тического цикла и периода синтеза ДНК. Следовательно, с умножением числа геномов интенсивность репликации ДНК в расчете на геном не подвергается изменениям. Что же касается митоза, то в полиплоидных клетках он нередко занимает больше времени, чем в диплоидных. Последний вывод применительно к растительным клеткам базируется на данных Van t Hof, Sparrow / 1963/, Van t Hof /1965/, Типу /1965/, .Gimenes-Maxtin et al. /1966, 1968/, Murin /1975/. С ним же косвенно согласуются и указания на зависимость скорости митоза от величины клетки, хотя они не подтверждены анализом плоидности исследованных
Влияние физиологически активных веществ
Вопрос о гормональной регуляции кинетики митоза в клетках растительного происхождения находится пока на стадии накопления фактических данных /см. обзоры: Леопольд, 1968; Гамбург, 1970; Кефели, 1973; Кулаева, 1973; Муромцев , 1973; Brent, 1977; Fosket, 1977/.
Кинетин. В некоторых сообщениях отмечена его способность повышать митотическую активность клеток вообще и полиплоидных , в частности / Torrey , 1961; Кунах, 1971; Дмитриева и Липский, 1973; Баласанян, 1974/. Встречаются указания, что кинетин замедляет все фазы митоза на фоне укорочения интерфазы, вследствии чего пред ставление об активировании.им митотической активности следует считать иллюзорным / Das et al., 1958; Батикян, 1970; Баласанян, 1973/. Наконец, на некоторых объектах далее при относительно высоких концентрациях кинетина в среде, изменения кинетики митоза вовсе не обнаруживались / Torrey, 1961/. По мнению Баласанян /1973, I97V» воздействие кинетина на митоз зависит и от концентрации, и от продолжительности его действия, причем уменьшению количества профазных ядер сопутствует одновременное возрастание числа мета-фаз. Последнее объясняется автором как эффект блокады кинетином перехода клеток в митоз. На наш взгляд, здесь монет иметь место лишь ускорение перехода клеток через профазу. Такая интерпретация цитированных наблюдений согласуется с представлениями об участии цитокинина в процессах, вызывающих конденсацию хроматина /Fosket, 1977/. Некоторые исследователи полагают, что кинетин воздействует, главным образом, на организацию митотического веретена и протекание конечной фазы митоза /Fosket, 1977/. ИУК /индол-3ил-уксусная кислота/ значительно усиливает мито тическую активность. В некоторых работах показано, что под ее воз 4 действием в концентрации 10" М ускоряется про-, мета- и анафаза, но практически не изменяется скорость прохождения клетками тело _5 фазы. Уменьшение концентрации ИУК до 10 М приводит к укорочению и телофазы, что в частности, наблюдалось на клетках эндосперма / Naylor et al. , 1954; Tomaszevski , 1973/. Механизм действия ауксина на митоз все еще не ясен. Тем не менее имеются доводы, что ауксины воздействуют на митотический цикл по закону "все или ничего" /Гамбург, Буренкова, 1969/ и, по-видимому, нужны растительной клетке, по меньшей мере, дважды в цикле, в периодах G-i и G2 /Гамбург, Ошарова, 1973; Гамбург, 1976/. Полагают также, что ауксины воздействуют на генетический аппарат клетки и систему белкового синтеза /Гамбург, Буренкова, 1969/. Не исключается и опосредованное действие ауксина на митоз через стимуляцию клеточного дыхания /Гамбург, 1976/.
Гиббереллины. В литературе отмечается их антагонизм с ауксином /Kaufmann et al.. 969; Максимов и др., 1970; Муромцев, Агнис-тикова, 1973/. Гиббереллин подавляет индуцированное ауксином клеточное деление. Однако во взаимодействии гиббереллина с ауксином может наблюдаться и синергизм /Masuda , 1967; Kajawa, Katsumi, 1974; Ockerse , 1974; Ruddat, Chans , I97V и простая аддитив-ность /Eastman, Вага , 1961; Гамбург, 1970; Ockerse , 1970/.
Абсцизовая кислота исследована в интересующем нас отношении значительно слабее предыдущих. В основном, она антагонистична ауксину, но иногда действует с ним синергично, сильно замедляет про-фазную конденсацию хроматина, вплоть до остановки митоза в этой фазе / Nagl, 1972/.
Подводя краткий итог изложенным данным, можно отметить, что фитогормоны способны специфически и существенно модифицировать скорость прохождения растительной клеткой митоза и его отдельных фаз. В интактном организме клетка, по-видимому, исключительно редко испытывает регулирующее воздействие лишь какого-либо одного гормона, в большинстве же случаев регуляция ее жизнедеятельности осуществляется сложным комплексом гормональных веществ, находящихся в разнообразных соотношениях. Эффекты гормональных взаимодействий могут проявляться в различных формах, от простой аддитивности до синергизма и антагонизма. Гормональная регуляция репродукции клеток животного происхождения представляет большой практический и теоретический интерес, особенно в связи с проблемами регенерации и онтогенеза. И хотя работ, посвященных этому вопросу, чрезвычайно много, регуляция кинетики митоза у клеток животных изучена далеко не полно. Имеющиеся данные можно резюмировать следующим образом.
Прежде всего, установлена отчетливо выраженная тканеспеци-фичность действия гормонов на митоз /Епифанова, 1958; Лагучев, 1975 и др./ и на этой основе разработана концепция органов мишеней /Епифанова, 1965/. Далее показано, что различными гормонами, в соответствующих концентрациях, можно направлено воздействовать на кинетику практически всех фаз митоза /Богоявленская и Доброхотов, 1958; Епифанова, 1958, 1962; Епифанова, Чумак, 1963; Козлов, 1959; Алов, 1964; Доброхотов, 1974; Лагучев, 1975; Ивченко, Романов, 1976/. В последние десятилетия собраны доказательства эффективного воздействия на кинетику митотического цикла также веществ, объединяемых под названием "кейлоны" /Builough , 1962; 1975; Лагучев, 1975; Гудвин, 1979; Романов, 1981; ELgo et al., 1981/. Однако изучение их влияния на митоз пока практически не начато. Наконец, выяснено, что через регуляцию уровня различных гормонов в крови осуществляется опосредованное влияние на митоз центральной нервной системы /Алов и др., 1955; Суворова, 1956; Рябуха, 1958; Стрелин и Козлов, 1959/. Не исключается также прямая регуляция ею кинетики митоза путем передачи к клеткам нервным импульсов Дткин, 1953, 1958; Залкинд, 1954; Алов, 1964; Friedel, Webb , 1979/.
Изменчивость хромосомной композиции культуры при факторных изменениях среды
В настоящем разделе приводятся и обсуждаются результаты исследования хромосомных чисел в культивируемых клетках н.gracilis при модификациях питательной среды по факторному плану /I серия экспериментов/. Перенос с плотной в жидкую среду контрольного состава
Для суждения о кариотипической изменчивости перевивной культуры при варьировании состава среды необходимо прежде всего выяснить, в какой мере сказывается перенесение клеточной популяции с плотной среды в жидкую того же состава на распределение по числу хромосом. Сопоставим с этой целью популяции, которые выращивались на плотной /рис. 3,А/ и на жидкой /рис. 3,Б/ питательной среде
Эрикссона. Воспользуемся для сравнения непараметрическим критерием Колмогорова-Смирнова. Полученное значение Л=1,04 /[ =1,36 с достоверностью Р 0,95, что не позволяет отвергнуть Н0-гипотезу. Иначе говоря, статистически значимые различия между сопоставленными гистограммами не обнаруживаются. Следовательно, перенесение перевивной клеточной популяции с плотной в жидкую питательную среду того же состава не приводит к сколь-нибудь существенным изменениям хромосомной композиции ее митотической фракции. Это позволяет объединить рассмотренные выборки и полученное распределение /рис. 4,К/ использовать в качестве контроля при анализе данных факторного эксперимента.
В объединенной гистограмме, как видно из рисунка, содержатся 13 классов плоидности, от In до 20п. Клеточная популяция, следО вательно, относится к категории сильномиксоплоидных. Доминируют в ней три- и диплоидные клетки, составляющие в совокупности около 50# митотической фракции. Относительно ощутимыми объемами /более 10$ каждый/ представлены классы 4п, 5п и 7п. В каждом из остальных классов обнаруживается не более % выборки. Классы с числами хромосом, некратными гаплоидному, не выходят за пределы 1$ /рис. 5, б/.
Заканчивая эту краткую характеристику, отметим устойчивость хромосомной композиции исследованной перевивной линии. Приобретенная в ходе многократных пересевов на протяжении продолжительного выращивания, она прочно удерживается даже при изменении физического состояния питательной среды. Однако постоянство распределения хромосомных чисел, как будет показано ниже, относительно и при перемене отношений между компонентами среды нарушается уже в
Вариант I, /рис» 4.1/. После перенесения на данную модификацию среды культура сохраняет миксоплоидность с доминированием ди-и триплоидных вариантов /58$/ на фоне относительно слабого представительства фракций тетра- и пентаплоидных клеток /каждая около 10$Д Тем не менее при сравнении полученного распределения с контрольным Я =1,51 Л Q5=I,36, что позволяет отвергнуть Н0-гипо-тезу с вероятностью 95$. Для краткости последующего изложения фракции с числами хромосом.2 и 4, б и 8, 10 и более именуются соответственно низкоплоидной, умереннополиплоидной и высокоплоидной. Объединив по этому условно принятому принципу классы гистограммы, можно отметить, что на данном варианте среды примерно вдвое против контроля возрастает низкоплоидная и почти втрое уменьшается высо-коплоидная фракция. Во столько же раз увеличивается относительное количество клеток с хромосомными числами, не кратными гаплоидному значению. Амплитуда изменчивости популяции по плоидности сужается приблизительно вдвое. Почти во столько же раз уменьшается общее число классов.плоидности в гистограмме, несмотря на появление в ней 3 классов, в контроле не обнаруженных. Существенная перестройка популяции по хромосомным числам после перенесения на среду данного состава очевидна.
Вариант 2 /рис. 4.2/. Как и в контроле, на фоне выраженной гетерогенности по числам хромосом, доминируют ди- и триплоидные клетки. Приблизительно на исходном уровне сохраняется объем умереннополиплоидной фракции. Однако распределение популяции в целом по плоидности существенно отличается от контрольного / Я-1,б4 Я0т=1,бЗ/ с высокой достоверностью /Р=0,99/. Изменения затрагивают низкоплоидную фракцию, относительный объем ее увеличивается более чем вдвое. Еще в большей мере меняется представительство выеоколлоидной фракции. Она претерпевает примерно четырехкратное уменьшение. Размах.варьирования хромосомного числа уменьшается против контроля в 1,6 раза при соразмерном сокращении количества классов плоидности в гистограмме. Следовательно, и здесь налицо значительная и достоверная перестройка перевивной популяции по плоидности.
Вариант 3 не может быть рассмотрен ввиду того, что на момент фиксации клеточной суспензии митотически делящиеся клетки в ней не обнаруживались.
Вариант 4 /рис. 4.4/. Клеточная популяция остается миксопло-идной и в данном случае. Ди- и триплоидные фракции удерживают доминирующее положение. Полученное здесь распределение отличается от контрольного с вероятностью 95$: .Я =1,5 A 0,-1,36. Отличия затрагивают, главным образом, фланги распределения - почти вдвое увеличивается низколлоидная фракция при соразмерном уменьшении высокоплоидной. Подвергается существенному сужению амплитуда изменчивости хромосомных чисел. Значительно снижается число классов плоидности и вместе с тем появляется класс /хромосомное число 3/, который в контроле не обнаруживался. Таким образом, и на этом варианте среды можно констатировать перегруппировку популяции по хромосомным числам.
Кинетика митоза культивируемых клеток при изменениях плоидности и состава среды
В настоящем разделе рассмотрены вопросы, вынесенные в его заголовок / II серия экспериментов/. Как уже отмечалось в разд. 3.1,.опыты поставлены на жидкой среде Эрикссона и ее модификаци-ях 9, В- и 15 по плану МЭ 2 . Мотивировалось это следующими соображениями.
На среде Эрикссона использованная перевивная культура представляет собой явно миксоплоидную клеточную популяцию , распределение которой по плоидности лишено перерывов, а большинство классов плоидности имеет достаточные для статистического анализа объемы /см. разд. 3.2/. Популяция с такими свойствами требовалась для дифференцированного анализа кинетики митоза в широком спектре хромосомных чисел с выходом на доступные статистической оценке выводы. Охват исследованием всего периода экспоненциального роста культуры позволял одновременно извлечь информацию о зависимости кинетики митоза от изменений среды, сопутствующих режиму накопительного культивирования. Важно было в собранных сведениях отделить общие эффекты от возможных частных, которые могли отражать лишь специфику роста культуры на данной среде. Чтобы решить эту задачу, нужно было перенести культуру на такую модифицированную среду, которая обеспечила бы более или менее равномерное для всех классов плоидности изменение кинетики клеточной репродукции.Такую возможность открывал 15-й вариант среды Эрикссона, что и определило его включение во П серию экспериментов.
При планировании опытов нужно было еще предусмотреть и то, что с изменением хромосомной конституции клетки кинетика ее деления подвергнется не глубокой, а лишь частичной и относительно мягкой перестройке. В этом случае надежно идентифицировать ее можно было бы только на кариотипически отчетливо различимых классах и лишь при условии, что каждый из них представлен выборкой увеличенного объема. Сформулированные требования, по-видимомунаилучшим образом выполнялись на 14-м и 9-м вариантах среды. На первом из них доля диплоидных клеток в митотической фракции поднималась почти до 80% уже в начале экспоненциального роста после пересева. На другом варианте среды к указанному времени выращивания относительный объем фракции тетраплоидов увеличивался приблизительно втрое против того,что наблюдалось на среде Эрикссона /см. рис. 4/»
Включение всех упомянутых вариантов среды в эксперименты данной серии позволяло, наконец объективно оценить состоятельность выдвинутой в настоящей работе идеи об управлении кинетикой митоза культивируемых клеток спланированными изменениями состава среды. Среда Эрикссона
Кинетика численности перевивной популяции в пассаже на данной среде показана на рис. 9,А. Кривая роста имеет выраженный лаг-, относительно продолжительный лог-период и короткую стацио нарную стадию, из которой культура быстро переходит в фазу деградации. Параметры роста суспензии и средние значения продолжительности митоза и его фаз для периода экспоненциального роста воспроизводились в последовательных пассажах и даны в табл. б.
Рассмотрим кинетику митоза в проекции на плоидность для периода экспоненциального роста в целом Обобщенные данные по этому периоду свидетельствуют , что частота встречаемости клеток в каждой из исследованных фаз митоза явно зависит от плоидности. Зависимость эта имеет сложный характер. Наконец, для первых двух фаз митоза отмеченная зависимость подчинена диаметрально противоположным тенденциям /рис. 10/. Последнее наводит на мысль, что между указанными фазами существует, по-видимому, обратная связь в относительной скорости их прохождения клетками. Более достоверное суждение об этом позволяют вывести расчеты коэффициентов корреляции Значения их подтверждают правомочность предположения. В периоде логарифмического роста культуры на среде контрольного состава действительно выявляется сильная отрицательная корреляционная связь между про и метафазойг - - 0,97; 0,90 0,99 ЖЛ
Надежная идентификация шюидности телофазных клеток на препаратах, окрашенных лакто-ацето-орсеином не представлялась возможной, что и ограничило анализ лишь первыми 3 фазами митоза. Расчетные значения их относительной продолжительности оказались несколько завышенными, поскольку величина митотического индекса определялась с учетом телофаз.
