Введение к работе
Актуальность проблемы
В-клеточные неходжкинские лимфомы представляют собой гетерогенную группу злокачественных опухолей, как правило, возникающих из зрелых В-клеток. К основным нозологиям этой группы относят В-клеточный хронический лимфолейкоз, лимфому из клеток мантийной зоны, лимфому из клеток маргинальной зоны, волосатоклеточный лейкоз, фолликулярную лимфому, диффузную В-крупноклеточную лимфому (ДВККЛ) и лимфому Беркитта. Суммарно они составляют около 15 % от общего числа опухолей гематопоэтической и лимфоидной ткани (WHO classification of lymphomas, 2008).
Гетерогенность этой группы проявляется в большом количестве вариантов клинической картины, иммунофенотипа опухолевых лимфоцитов и различии в прогнозах заболеваний. Белки, дерегуляция которых играет центральную роль в патогенезе зрелоклеточных лимфоидных опухолей, с одной стороны должны быть эффекторным звеном нескольких сигнальных каскадов, с другой стороны - обладать плейотропностью действия. С этой точки зрения наиболее перспективными кандидатами на роль центральных белков - переключателей в опухолевых В-лимфоцитах представляются циклины группы D и циклины группы Е, чьей канонической функцией является стимуляция выхода клетки из фазы G1 и переход ее в фазу синтеза ДНК.
Для вхождения дифференцированной клетки в пролиферативный цикл необходим митогенный сигнал, в частности, связывание ростовых факторов (EGF, FGF, PDGF, IGF и т.п.) с рецептором и последующая активация ERK1/ERK2 каскада митоген-активируемых протеинкиназ (МАРК-каскад). Активируемые этим каскадом транскрипционные факторы Мус (Daksis et al., 1994) и АР-1 (Albanese et al., 1995) запускают синтез циклинов Dl, D2 и D3, которые образуют комплексы с киназами CDK4 и CDK6 (Bates et al., 1994), обусловливая выход клетки из фазы Gl (Murray, 2004). Синтез циклинов D также регулируется FAK киназой и/или Rho семейством ГТФаз (Zhao et al., 1998; Gille et al., 1999), а активация PI3K пути ингибирует GSK3beta-3aBHCHMyio деградацию циклинов D (Liang et al., 2003). Переход из поздней Gl фазы в S-фазу контролируется циклин-зависимой киназой CDK2 и циклинами Е1 и Е2. Комплекс СОК4/6-циклин D частично фосфорилирует Rb-белки, что приводит к диссоциации гистондеацителазы от комплекса HDAC-Rb-E2F и позволяет E2F запустить синтез циклина Е. Комплекс циклина Е и CDK2 дополнительно фосфорилирует Rb, и тот отсоединяется от E2F, снимая его ингибирование (Gottlieb et al., 1994; Ribes -Zamora et al., 2007).
Гиперэкспрессия циклинов группы D была показана методами иммуногистохимии, проточной флуориметрии и ИФА в некоторых лимфоидных опухолях, в частности, в опухолевых лимфоцитах фолликулярной лимфомы (Teramoto et al., 1999), диффузной В -крупноклеточной лимфомы (Filipits et al., 2002), в части опухолевых лимфоцитов В-клеточного хронического лимфолейкоза (В-ХЛЛ) (Komaczewaska et al., 2009). Лимфома из клеток мантийной зоны была выделена из группы В-ХЛЛ по наличию транслокации t(ll;14)(ql3;q32), перемещающей ген циклина D1 под промотор гена тяжелой цепи иммуноглобулинов, поэтому в клетках ЛКМЗ наблюдается наиболее высокий уровень экспрессии циклина Dl (Williams et al., 1995). Несмотря на то, что циклин Е является основным нижележащим эффекторным звеном циклина D (Geng et al., 1999), сведения о его экспрессии в опухолях иммунной системы носят весьма разрозненный и несистематический характер. До недавнего времени оценка уровня экспрессии циклинов проводилась исключительно качественными методами, обладающими относительно низкой чувствительностью, возможно, что использование более чувствительных методов детекции с определением уровня мРНК вместо количества белка позволит выявить не одиночные, а систематические изменения уровня экспрессии циклинов фазы G1 в опухолевых лимфоцитах В-зрелоклеточных лимфом.
Цель исследования
Целью данной работы было получение новых знаний об экспрессии мРНК циклинов групп D и Е в нормальной и опухолевой лимфоидной ткани методом ПЦР в реальном времени.
Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Получить коллекцию образцов кДНК из зрелоклеточных опухолей и нормальной лимфоидной ткани.
-
Определить оптимальные референтные гены для нормализации данных ПЦР в реальном времени.
-
Определить уровень экспрессии мРНК генов циклинов Dl, D2 и D3 в нормальных и опухолевых лимфоцитах.
-
Определить уровень экспрессии мРНК гена циклина Е1 в нормальных и опухолевых лимфоцитах.
Новизна исследования
1. Впервые исследована выборка образцов кДНК, полученной из свежезамороженных
образцов лимфоидной ткани от 165 пациентов с известным имунофенотипом
опухолевых клеток.
-
Использование корректной стратегии нормализации и наличие трех стабильно экспрессирующихся референтных генов впервые позволило детектировать повышенный уровень экспрессии мРНК циклинов D1 и Е в опухолевых лимфоцитах по сравнению с нормальной лимфоидной тканью.
-
Предложен новый диагностический метод разделения нозологии В-зрелоклеточных лимфом по уровню экспрессии мРНК циклина D1. Научно-практическая значимость исследования
Полученные результаты могут быть использованы в дифференциальной диагностике лимфоидных опухолей, данные об экспрессии циклинов G1 фазы в лимфоидной ткани могут быть использованы в курсах лекций по гематологии, частной гистологии и клеточной биологии.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на: внутреннем семинаре Совета Молодых Ученых в Гематологическом Научном Центре РАМН (2009 год), международной конференции «Experimental Hematology Association» (2010), второй Международной Школе по практической проточной цитометрии (Москва, 2011), 18-й международной конференции «18і Leipziger Workshop on Cytomics and Congenital Heart Disease» (2013) и обсуждены 23 мая 2013 года на специализированном семинаре кафедры клеточной биологии и гистологии Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.
Публикации по теме диссертации
По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 3 тезиса конференций. Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 132 страницах машинописи и состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», заключения и выводов. Работа содержит 16 рисунков и 14 таблиц. Библиографический материал включает в себя ссылки на 303 источника литературы.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Пациенты
Для исследования были выбраны образцы тканей селезенок, лимфоузлов и периферических мононуклеаров крови (48 биопсий селезенки, 23 биопсии лимфоузлов и 94 образца периферических мононуклеаров крови) 165 пациентов на базе
гематологического Научного Центра (Москва, Россия). У 33 пациентов был поставлен диагноз ЛКМЗ, и у 97 был поставлен диагноз В-ХЛЛ. Все пациенты не проходили курс лечения в момент взятия образца крови или биопсии лимфоузла. 3 5 референтных случаев содержали 2 случая фолликулярной лимфомы, 4 случая диффузной В-крупноклеточной лимфомы, 11 случаев лимфомы из клеток маргинальной зоны и 18 случаев с реактивным лимфаденитом (пролиферация клеток неопухолевой природы). Диагнозы «лимфома из клеток мантийной зоны» и «хронический лимфолейкоз» были поставлены с помощью методов трехцветной проточной цитофлуориметрии и иммуногистохимии, в 1 случае диагноз был поставлен по наличию транслокации и клиническим данным. Цитогенетические данные по транслокации t(ll;14)(ql3;q32) были доступны для 12 пациентов из 33. Средний возраст пациентов с В-ХЛЛ составил 62 года (разброс 48-76 лет), средний возраст пациентов с ЛКМЗ составил 58 лет (разброс 39-75 лет).
Иммуногистохимия и проточная флуориметрия.
Непрямая иммуногистохимическая окраска парафиновых срезов толщиной 4-5 мкм проводилась по стандартной методике (Petrosyan et al., 1999). Пробоподготовку образцов для флуориметрии проводили по стандартной методике, описанной ранее (Gretsov et al., 2004). Для окраски использовали моноклональные антитела к CD5-FITC (клон DK23, DAKO, Дания), CD19-Cy5 (клон НГВ19, eBioscience, США), CD23-PE (клон МНМ6, Dako, Дания), FMC7-FITC (клон MCA792F, AbD Serotec, США), CD20-Cy5 (клон 2Н7, eBioscience, США), поверхностное антитело к к - легкой цепи иммуноглобулинов и поверхностное антитело к Х-легкой цепи иммуноглобулинов (к-FITC/ Х-РЕ, клон АНМ4907, Invitorgen, США). Полученные пробы анализировались на проточном цитофлуориметре FACsCalibur (BD). Результаты обрабатывались в программе CellQuest (BD Biosciences, США). Отсечки выставлялись по негативным контролям.
Выделение периферических мононуклеаров крови и получение суспензий
Клетки мононуклеаров крови выделяли в градиенте Ficoll-Histopaque (Sigma-Auldrich, США) по стандартной методике. Полученные клетки дважды отмывались в среде RPMI-1640 (Панэко, Россия) и замораживались в жидком азоте. Из кусочков ткани лимфатических узлов и селезенок приготавливалась суспензия в medi-machine (BD BioSciences). Суспензии также замораживались в жидком азоте. Нормальные В-лимфоциты из периферических мононуклеаров крови здоровых доноров выделяли на колонках miniMACS (Miltenyi Biotech GmbH, Germany) по протоколу производителя.
Получение РНК и кДНК
Выделение РНК из замороженных клеток осуществлялось при помощи RNeasy Mini Kit (Qiagen, США) по протоколу производителя. После выделения РНК была
дополнительно обработана ДНКазой (Fermentas, США) в течение 30 минут при 37 С. Концентрация РНК измерялась на спектрофотометре (Genesis UV10, Thermo Electron, США). Анализ чистоты выделенной РНК проводился по измерению пиков А260/А280 и А260/А230. Среднее соотношение А260/А280 составило 1,85 (диапазон 1,7-1,9), среднее соотношение А260/А230 составило 1,7 (диапазон 1,65-1,95).
Подбор праймеров
Для амплификации ПЦР-РВ использовались е последовательности праймеров, предложенные Vandesompele et al., (2002). Для генов циклинов D2, D3 и циклина Е были написаны следующие праймеры: cyclin D2 sense: 5' - CTG GGG AAG TTG GAA GTG GA -3'; cyclin D2 antisense: 5' - CAA TCC ACG TCT GTG TTG G; cyclin D3 sense: 5'- GAC CTT TTT GGC CCT CTG T- 3'; cyclin D3 antisense: 5' - GCT TCG АТС TGC TCC TGA C; cyclin El sense: 5' - AGC ACT TCA GGG GCG TCG-3'; cyclin El antisense: 5' - GCC CGC TGC TCT GCT TCT. Результаты ПНР подтверждались на электрофорезе. Результат ПНР для гена циклина D1 проверяли с помощью клонирования продукта реакции в вектор pGem-T Easy Vector (Promega) согласно инструкции производителя с последующим сиквенсом вставки. Для того чтобы минимизировать амплификацию геномной ДНК, праймеры были составлены так, чтобы каждую пару разделял хотя бы один интрон. По последним данным, все выбранные нами гены выполняют независимые функции и не имеют общей регуляции.
ПЦР в реальном времени
Количественные ПНР-реакции в реальном времени проводили на приборе MiniOpticon (Biorad Headquaters, Hercules, California) методом неспецифической детекции с красителем SybrGreen І (Синтол, Россия).
Стандартная ПНР реакция проводилась в объеме 25 мкл с реактивами фирмы «Синтол» (Россия) и включала в себя 2,5 мкл 10 х кратного ПНР буфера с Sybr Green I, 2,5 мМ MgCb, 2,5 мМ дНТФ, 1,5 единицы Taq-полимеразы Hot Rescue, 10 пмоль каждого праймера и 5 мкл 5 -кратного разведения кДНК. Условия реакции включали первоначальную денатурацию (при 95 С) и последующие 40 циклов репликации (95 С 15 сек, 64 С ЗОсек, 72 С 60 сек).
Нормализация данных
В работе была использована методика расчета относительного нормализованного количества кДНК с помощью фактора нормализации (Vandesompele et al., 2002). Результаты были проанализированы с помощью бесплатных приложений для обработки данных ПЦР в реальном времени: GeNorm (Center of medical Genetics, Ghent University hospital, geNorm version 3.5, 2002), NormFinder (Molecular Diagnostic Laboratory,
Department of clinical Biochemistry, Aarhus University Hospital, Denmark, 2004) и BestKeeper (FML-Weihenstephan, Centre of Life and Food Science, Technical University of Munich, Germany, 2003). Для статистического анализа данных и построения графиков использовалась программа GraphPad Prism (GraphPad Software, version 5, San Diego, CA, USA). Для теста на нормальность распределения использовали критерии д' Агостино-Пирсона и Холмогорова-Смирнова.
Похожие диссертации на Экспрессия циклинов фазы G1 в B-зрелоклеточных лимфомах человека
