Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 15
2.1. Морфология печени 15
2.1.1. Структурно-функциональные единицы печени млекопитающих 15
2.1.2. Паренхиматозные клетки печени 17
2.1.3. Синусоидные клетки печени 18
2.1.3.1. Эндотелиальные клетки 20
2.1.3.2. Клетки Купфера 20
2.1.3.3. Ямочные клетки (Pit cells) 21
2.1.3.4. Морфо-функциональные характеристики перисинусоидальных клеток 22
2.2. Стволовые клетки печени 27
2.2.1. Коммитированные стволовые клетки печени 29
2.2.1.1. Гепатоциты 29
2.2.1.2. Малые гепатоцитоподобные прогениторные клетки 31
2.2.2. Потенциальные стволовые клетки - овальные клетки 31
2.2.3. Собственно стволовые клетки печени 37
2.2.4. Мультипотентные прогениторные клетки печени 40
2.2.5. Внепеченочные стволовые клетки и печень 43
2.2.5.1. Мезенхимальные стволовые клетки 43
2.2.5.2. Гемопоэтические стволовые клетки 44
2.3. Модели регенерации печени 47
2.3.1. Хирургические модели 48
2.3.1.1. Частичная гепатэктомия 49
2.3.1.2. Перевязка ветвей воротной вены 50
2.3.2. Модели токсического поражения печени 51
2.3.2.1. Повреждение нитратом свинца 52
2.3.2.2. Повреждение четыреххлористым углеродом 52
2.3.2.3. Повреждение галактозамином 53
2.3.2.4. Повреждение CC14-AAF 54
2.3.2.5. Повреждение фураном 54
2.3.2.6. Повреждение аллиловым спиртом 55
2.3.2.7. Повреждение дипином 55
2.3.3. Химические модели гепатоканцерогенеза 57
2.3.3.1. Повреждение ацетиламинофлуореном (AAF) 57
2.3.3.2. Повреждение диэтилнитрозамином 58
2.3.3.3. "Solt-Farber" модель 58
2.5.3.1. Холин-дефицитная модель 60
2.4. Регенерация печени после ЧГ 60
2.4.1. Триггеры регенерации печени 62
2.4.2. Ранние изменения, развивающиеся после ЧГ 65
2.4.3. Прогрессия Gl-фазы и пролиферация клеток печени 68
2.4.4. Завершение регенерации печени после ЧГ 75
3. Материалы и методы 78
3.1. Объекты исследования 80
3.2. Гистологические и иммуногистохимические методы исследования 82
3.2.1. Депарафинирование и регидратация парафиновых срезов 82
3.2.2. Окрашивание гематоксилин-эозином 82
3.2.3. Окрашивание парафиновых срезов печени крысы антителами против PCNAHCX-ГМА 82
3.2.4. Окрашивание парафиновых срезов печени крысы антителами к десмину, цитокератину № 19 83
3.2.5. Окрашивание парафиновых срезов печени крысы антителами к макрофагальному антигену 84
3.2.6. Двойное иммуногистохимическое окрашивание парафиновых срезов печени антителами против PCNA и десмина 84
3.2.7. Двойное иммуногистохимическое окрашивание парафиновых срезов печени антителами против PCNA и макрофагального антигена 86
3.2.8. Двойное иммуногистохимическое окрашивание парафиновых срезов печени антителами против c-kit и десмина 86
3.3 Морфометрия 87
3.3.1. Определение размера печеночных долек 88
3.3.2. Определение числа десмин-позитивных перисинусоидальных клеток 89
3.3.3. Определение числа пролиферирующих клеток 89
4. Результаты и обсуждение 91
4.1. Макроскопические изменения регенерирующей печени 91
4.2. Морфологические изменения регенерирующей печени при окраске на гематоксилин-эозин 91
4.2.1. Просвет синусоидов 93
4.2.2. Жировой стеатоз 94
4.2.3. Изменения размеров долек печени 95
4.2.4. Изменение площади печеночных долек 96
4.3. Пролиферативные процессы в печени после ЧГ 98
4.3.1. Экспрессия PCNA в гепатоцитах 98
4.3.2. Экспрессия PCNA в холангиоцитах 102
4.3.3. Экспрессия PCNA в синусоидных клетках 106
4.4. Перисинусоидальные клетки после ЧГ 108
4.4.1. Эспрессия десмина перисинусоидальными клетками 108
4.4.2. Экспрессия альфа-гладкомышечного актина 115
4.5. Реакция внутрипеченочных желчных протоков
и овальных клеток на ЧГ 123
4.6. Клетки Купфера при регенерации печени после ЧГ 126
4.6.1. Экспрессия макрофагального антигена 127
4.6.2. Двойное иммуногистохимическое окрашивание антителами к макрофагальному антигену и PCNA 129
4.7. Активация стволового компартмента 130
4.7.1. Экспрессия C-kit в печени после ЧГ 131
4.7.2. Двойное иммуногистохимическое окрашивание антителами к C-kit и десмину 134
5. Заключение 141
6. Выводы 147
7. Практические рекомендации
- Паренхиматозные клетки печени
- Депарафинирование и регидратация парафиновых срезов
- Двойное иммуногистохимическое окрашивание парафиновых срезов печени антителами против PCNA и макрофагального антигена
- Пролиферативные процессы в печени после ЧГ
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ. В настоящее время, благодаря интенсивным исследованиям последних десятилетий, не вызывает сомнений, что физиологическая и репаративная регенерация органов происходит благодаря наличию в них тканеспецифичных стволовых клеток, которые обнаружены в скелетных мышцах, роговице, эпидермисе кожи, красном костном мозге и многих других тканях и органах [292]. На этом фоне кажется парадоксальным, что в печени, удивительные способности к регенерации которой известны с античных времен, стволовая клетка до сих пор не идентифицирована.
Начиная с 60-х годов двадцатого столетия, на роль стволовой клетки печени рассматривались, так называемые овальные клетки [186, 359], фенотип которых идентичен фенотипу пренатальных гепатобластов [36, 40, 63, 64, 101, 129, 132, 180, 270, 410]. Овальные клетки появляются и участвуют в восстановлении печени после повреждения органа некоторыми канцерогенами на фоне частичной гепатэктомии [35, 116, 117, 130, 180, 188, 330, 352, 353, 404, 421, 428, 429]. Однако овальных клеток, нет во взрослой здоровой печени и в печени, которая регенерирует после частичной гепатэктомии [307, 310]. Поэтому главный вопрос — за счёт каких стволовых клеток восстанавливалась печень после частичной гепатэктомии до сих не решен.
Во-первых, это связано с тем, что большинство работ по изучению регенерации печени после частичной гепатоэктомии было выполнено в середине 20-го столетия, когда уровень знаний о клеточном составе печени и строении синусоидов, а также техническая оснащенность лабораторий, не
10 позволяли идентифицировать отдельные клеточные типы, участвующие в регенерации.
Во-вторых, описание овальных клеток привело к тому, что большинство исследований проведено на моделях регенерации органа с участием овальных клеток, а не на ЧГ. Однако в конце 20-го столетия исследование «классической» частичной гепатэктомии позволило практически по часам расписать включение различных генов, изменение концентрации цитокинов, а также установить вовлеченность в регенераторный ответ синусоидных клеток, в частности перисинусоидальных клеток печени. Перисинусоидальные клетки накапливают и сохраняют в своей цитоплазме ретиноиды [66], которые являются важными факторами морфогенеза эпителиев, модифицируют внеклеточный матрикс [233], синтезируют большое количество разнообразных цитокинов и факторов роста, среди которых фактор стволовых клеток [160], фактор роста гепатоцитов [393], эритропоэтин [301, 120]. Более того, перисинусоидальные клетки реагируют на любое повреждение печени независимо от его тяжести и характера [156]. Однако вопрос о том, являются ли перисинусоидальные клетки стволовыми, прогениторными, или они создают необходимое микроокружение для стволовых клеток печени до сих пор остается невыясненным.
Открытие специфических маркеров, позволяющих идентифицировать стволовые клетки и клетки предшественники, стимулировало новый виток исследований по идентификации стволовой клетки печени. Так, в работе Урываевой с соавторами [25] было установлено, что после частичной гепатэктомии некоторые гепатоциты приобретают фенотипические характеристики стволовых клеток. Гепатоциты изначально рассматривались как основной и чуть ли не единственный клеточный тип, вовлеченный в процессы гипертрофии печеночных долек [307, 310], которая, в свою очередь, по мнению ряда исследователей, лежит в основе репаративной регенерации печени после частичной гепатэктомии [345, 505]. Однако гипертрофия проявляется лишь увеличением толщины печеночных балок до размера двух
11 гепатоцитов [46, 309], что не объясняет механизмов внутренней перестройки железы. Этот механизм внутренней перестройки морфофункциональных единиц печени пытались объяснить ветвлением воротной вены [162]. Но воротная вена - это лишь одна из структур портального тракта, где обязательно присутствуют также ветвь печеночной артерии и желчный проток, поэтому перестройка структуры железы не может быть объяснена только с позиции ветвления воротной вены. Более того, клетки желчных протоков - это еще один эпителиальный клеточный тип печени, который, как предполагают, в ходе пренатального развития печени может образовываться из перипортальных гепатоцитов [111, 461]. Что же происходит после частичной гепатэктомии — повторение пренатального гистогенеза или спраутинг протоковых структур, до сих пор не известно, также как неизвестно каким образом перестраиваются притоки печеночной вены.
Таким образом, в настоящее время до сих пор остаются открытыми следующие основные вопросы: что же собой представляет стволовая клетка печени, как восстанавливается не только клеточная масса, но и структура железы в ходе регенерации, какие изменения происходят в сосудистой системе на уровне портальных трактов, притоков печеночных вен и синусоидов?
ЦЕЛЬ РАБОТЫ - изучение изменения микроархитектоники печени и активации ее стволовых клеток в ходе регенерации после частичной гепатэктомии у крыс.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
Выполнить морфометрическое исследование размеров печеночных долек через 1, 2, 3, 5, 7 суток после ЧГ.
Изучить пролиферацию гепатоцитов, холангиоцитов, перисинусоидальных клеток и макрофагов после ЧГ.
Изучить реакцию элементов портального тракта (желчные протоки, ветви воротной вены и печеночной артерии) и центральной вены после ЧГ.
4. Выявить клетки, экспрессирующие маркер стволовых и прогениторных клеток C-kit, в печени крыс после ЧГ.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В диссертации впервые на основе совмещения
морфометрического и иммуногистохимического анализа получены
доказательства того, что в гипертрофированных после частичной гепатэктомии
долях печени происходит образование новых ацинусов. Было установлено, что
в основе данного процесса лежит пролиферация гепатоцитов и
перисинусоидальных клеток с последующей перестройкой
морфофункциональных единиц. Образование новых притоков печеночных вен происходит за счёт перестройки синусоидов, а новые трубчатые структуры портальных трактов появляются в ходе преобразования терминальных артериол и венул в артерии и вены портальных трактов, с одновременным образованием рядом с ними новых желчных протоков. Впервые установлено, что при регенерации печени после частичной гепатэктомии не только гепатоциты, но и перисинусоидальные клетки проявляют фенотипические признаки стволовых и прогениторных клеток, экспрессируя C-kit.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Результаты работы позволили по новому оценить и понять закономерности изменения микроструктуры железы в ходе регенерации печени после частичной гепатэктомии. Проведенные исследования способствовали выявлению новых фактов как о характере, так и о последовательности клеточных реакций, возникающих в ходе регенерации печени после частичной гепатэктомии, и участии в этих процессах отдельных клеточных типов печени (гепатоцитов, холангиоцитов, клеток Купфера и перисинусоидальных клеток). Результаты работы расширяют и углубляют представления о роли перисинусоидальных клеток в регенерации печени, о процессах взаимодействия различных клеточных типов в ходе регенерации. Теоретически значимым является установление факта изменения фенотипа перисинусоидальных звездчатых клеток в ходе регенерации и экспрессия этими клетками рецептора к фактору стволовых клеток. Совокупность полученных данных позволила предложить,
что перисинусоидальные звездчатые клетки могут претендовать на роль стволовых клеток печени.
Полученные результаты могут быть использованы для дальнейшего изучения проблемы регенерации и активации стволовых клеток печени, а также в учебном процессе. В ходе выполнения работы разработаны новые методические подходы для двойного иммуногистохимического окрашивания, которые могут быть рекомендованы для лабораторной практики.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
Восстановление оставшихся долей печени после частичной гепатэктомии происходит поэтапно и начинается с 1) гипертрофии печеночных ацинусов, происходящей за счёт пролиферации гепатоцитов и перисинусоидальных клеток, и 2) заканчивается перестройкой морфофункциональных единиц путем спраутинга афферентных и эфферентных сосудов и желчных протоков.
В ходе регенерации печени после частичной гепатэктомии перисинусоидальные клетки являются клеточным типом, который наряду с гепатоцитами экспрессирует маркер стволовых и прогениторных клеток C-kit.
ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Иммуногистохимическая оценка регенераторного процесса при заболеваниях печени успешно внедрена в практику ГМУ «Республиканская клиническая больница» (г. Казань), ГУЗ «Республиканская клиническая инфекционная больница» (г. Казань). Результаты проведенного исследования внедрены в учебный процесс на кафедре нормальной анатомии и кафедре гистологии Казанского государственного медицинского университета.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследований доложены и обсуждены на XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), научно-практической конференции «Современные аспекты гистогенеза и вопросы преподавания гистологии в ВУЗе», посвященной 100-летию со для рождения Л.И.Фалина (Москва, 2007), 162-м международном симпозиуме Фальк (Dresden, Germany,
2007), 167-м международном симпозиуме Фальк (Mainz, Germany, 2008), IV Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2009), XIV Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2009), 44-ом ежегодном съезде Европейской ассоциации изучения печени (Копенгаген, Дания, 2009).
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 198 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований с обсуждением полученных данных, заключения, выводов и библиографии. Диссертация содержит 7 таблиц и 39 рисунков. Список литературы включает 511 наименований, из которых 27 русскоязычных и 484 иностранные работы.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Паренхиматозные клетки печени
Все клетки печени принято разделять на паренхиматозные клетки, к которым относят гепатоциты и холангиоциты, и синусоидные клетки [1, 3, 80, 82]. Около 80% объема и почти 60% общего количества клеток печени составляют гепатоциты [27]. Холангиоциты, или эпителиальные клетки внутрипеченочных желчных протоков, составляют 3-5% общего числа клеток печени [41, 42, 373]. На долю синусоидных клеток, к которым относят клетки Купфера, эндотелиальные клетки, перисинусоидальные клетки и ямочные клетки (pit-cells), приходится около 7% объема печени [67].
Гепатоциты являются клетками эпителиального типа, имеют диаметр 30-40 мкм и содержат одно или два достаточно крупных округлых ядра. Это клетки с высоким уровнем специализации, их строение подтверждает это. Так, для гепатоцитов характерна полиплоидия, хорошо развитые элементы комплекса Гольджи, обилие гранулярной и гладкой эндоплазматической сети, внутриклеточных включений, лизосом, пероксисом, митохондрий, количество которых может достигать 2000 в одной клетке [4]. Более того, гепатоциты имеют функциональную гетерогенность, то есть клетки в различных участках печеночной дольки различаются по выполняемым функциям. Морфологически это проявляется различиями гепатоцитов различных областей печеночной дольки в ультраструктуре, метаболизме, паттерне экспрессии белков, образовании желчи. Следствием высокой специализации гепатоцитов является низкий митотический индекс в нормальной печени, где большинство гепатоцитов находиться в Go-фазе клеточного цикла [24, 431]. Гепатоциты за счёт наличия межклеточных контактов упакованы в тяжи, толщиной в одну, иногда в две клетки [85], формирующие печеночные балки, которые соединяются друг с другом. Маркерами гепатоцитов служат альбумин, глюкозо-6-фосфотаза, цитокератины 8 и 18, цитохром Р-450, аспартатаминотрансфераза, аланин аминотрансфераза [478].
Холангиоциты являются вторым эпителиальным клеточным типом печени. Они имеют развитый комплекс Гольджи, значительное количество цитоплазматических включений и микроворсинки, направленные в сторону просвета желчного протока [357]. Холангиоциты образуют желчные пути, по которым транспортируется желчь, участвуют в формировании 10-15% базальной желчи у крыс и до 40% базальной желчи у человека [323], они также участвуют в транспорте белков и активно секретируют воду, электролиты [41], иммуноглобулины класса А и М [448, 437]. Маркерами холангиоцитов служат цитокератины 7 и 19, у-глутамилтранспептидаза, канцероэмбриональный антиген (СЕА), эпителиальный мембранный антиген (ЕМА) [357].
Первым упоминанием о синусоидных клетках печени стало описание Wedl в 1854 году в печени больного малярией пигментсодержащих «соединительнотканных» клеток [44]. Позже Hoffmann F.A. и Von Recklinghausen F. обнаружили способность непаренхиматозных клеток печени к фагоцитозу внутривенно введенных красителей [202]. В 1869 году Boll F. описал «сеть анастомозирующих соединительнотканных клеток с осмиофильным содержимым [68]. Несколько позже, используя окраску хлорным золотом, Купфер [253] обнаружил популяцию «звездчатых» синусоидных клеток и предположил наличие у них фагоцитарной активности; однако впоследствии оказалось, что обнаруженные Купфером звёздчатые клетки не являются макрофагами, а представляют собой так называемые перисинусоидальные клетки [470]. Несмотря на это, макрофаги печени были названы клетками Купфера. В результате тщательного морфологического анализа Zimmermann К. [511] показал наличие в пределах синусоидов печени трех типов клеток, которые получили название эндотелиальных клеток, эндоцитов и перицитов. В начале 1950-х годов японские ученые Ito Т. и Nemoto J. описали «новый» тип синусоидных клеток с высоким содержанием липидов в цитоплазме [215]. Фактически это были те же клетки, которые еще в 1869 году описал Boll F., а значительно позже обнаружил Zimmermann К. и назвал перицитами [511].
Несмотря на эти данные, мысль о том, что синусоиды печени представлены одним типом клеток с разным фенотипом, доминировала до конца 1960-х годов. Данный факт можно объяснить тем, что, несмотря на морфологические отличия, которые имеются между клетками синусоидов, проведение количественного анализа и идентификация отдельных клеточных типов на рутинных гистологических срезах является практически невыполнимой задачей. Именно поэтому при изучении клеток синусоидов печени в настоящий момент применяют методы гистохимии, иммуногистохимии, культуры клеток и тканей, гибридизации in situ и электронной микроскопии. Только после внедрения в практику этих методов, было установлено, что в синусоидах печени присутствуют четыре типа клеток, которые отличаются друг от друга по морфологическим характеристикам, топографии и функциям.
На долю синусоидных клеток приходится около 7% объема печени. Согласно морфометрическим данным [67], эндотелиальные клетки составляют 44,4%, клетки Купфера - 33,3%, перисинусоидальные клетки печени (клетки Ито) - 10-25% и ямочные клетки - 5% объема непаренхиматозных клеток железы. Клетки Купфера и синусоидные эндотелиальные клетки могут быть обнаружены при световой микроскопии, хотя морфология этих клеток не позволяет отличить их друг от друга, а значит, данный метод не может быть использован для количественной оценки этих клеток. Еще сложнее визуализация клеток Ито; ямочные клетки вообще не видны при использовании обычных методов световой микроскопии. Все это подтверждает необходимость использования более достоверных методов идентификации синусоидных клеток печени, которые позволили бы изучать изменения, происходящие с ними при повреждении печени.
Данный клеточный тип составляет около 44% объема непаренхимных клеток печени [65]. Эндотелиальные клетки формируют стенку синусоидов, отделяя просвет последних от пространства Диссе. В длинных и тонких цитоплазматических отростках имеются кластеры фенестр открытого типа, которые занимают от 6 до 8% поверхности эндотелия и создают подобие решета или сита. Фенестры регулируют поступление в пространство Диссе частиц более 0,2 мкм в диаметре, в частности, хиломикронов [491]. В составе последних транспортируются по крови триглицериды, холестерин, эфиры холестерина, апопротеины и эфиры ретинола [66]. Диаметр фенестр увеличивается под действием однократных доз алкоголя и пантетина, содержащегося в мёде [492]. В то же время хроническое воздействие алкоголя и никотин приводят к стойкому уменьшению диаметра фенестр и гиперхолестеринемии, поскольку снижается утилизация холестерола и липопротеинов гепатоцитами [492]. Для эндотелиальных клеток синусоидов характерен эндоцитоз всех типов молекул и частиц с диметром не более 0,1 мкм [489]. Отсутствие типичной базальной мембраны, способность к эндоцитозу и наличие фенестр отличают эндотелий синусоидов от эндотелия других сосудов.
Депарафинирование и регидратация парафиновых срезов
Для окрашивания применяли квасцовый гематоксилин Караци [17, 21] и 1% водный раствор эозина. Окрашивание проводили по следующей схеме. После депарафинирования и регидратации срезы инкубировали 30-45 сек с раствором гематоксилина, затем дифференцировали окраску в водопроводной воде (7-10 мин). Далее на 2-3 мин на срезы наносили раствор эозина, после чего споласкивали в дистиллированой воде и заключали в канадский бальзам [17, 21].
Парафиновые срезы печени крысы окрашивали антителами к PCNA (клон PC 10, DAKO, Denmark; разведение 1:100), ос-ГМА (клон 1А4, DAKO, Denmark; разведение 1:50). Окрашивание проводили стрептавидин-биотиновым методом. После депарафинирования и регидратации срезы инкубировали 20 мин с 1% раствором перекиси водорода в физиологическом растворе, забуференном Трис-HCl буфером (ТБС), споласкивали в ТБС и инкубировали 60 мин с первичными антителами. После инкубации трижды по 3 мин промывали в ТБС и инкубировали 15 мин с биотинилированными вторыми антителами (Link, DAKO LSAB2+Kit Peroxidase). Далее вновь трижды по 3 мин промывали в ТБС и инкубировали со стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена (Streptavidin, DAKO LSAB2+Kit Peroxidase), в течение 15 мин. Затем препараты промывали также, как после инкубации с первыми и вторыми антителами. В качестве субстрата пероксидазной реакции использовали раствор аминоэтилкарбазола и перекиси водорода в 0,1 М ацетатном буфере (рН=5,0). Интенсивность окрашивания (продукт реакции красного цвета) контролировали под микроскопом. После прекращения иммуногистохимической реакции срезы промывали в ТБС, ядра подкрашивали квасцовым гематоксилином (окраску дифференцировали 10 мин в водопроводной воде), препараты заключали в глицерин-желатину.
Парафиновые срезы печени крысы окрашивали антителами к десмину (клон D33, DAKO, Denmark; разведение 1:30), цитокератину № 19 (клон ВА17, DAKO, Denmark; разведение 1:50), C-kit (клон Т 595, Novokastra, UK; разведение 1:20). Окрашивание проводили также стрептавидин-биотиновым методом. Отличие данной процедуры окрашивания от описанной в предыдущем разделе заключалось в том, что данные антигены могли быть выявлены только после предварительной демаскировки методом HIAR (Heat-Induced Antigen Retrieval) [416]. Срезы кипятили в течение 30 мин в 0,01 М цитратном буфере (ЦБ, рН=6,0), затем выдерживали в том же буфере еще 15-20 мин и переносили в ТБС [466]. Далее окрашивание проводили по протоколу, приведенному в предыдущем разделе.
Парафиновые срезы печени крысы окрашивали антителами к макрофагальному антигену (клон LN-5, DAKO, Denmark; разведение 1:50). Окрашивание проводили методом меченных полимеров. Данный метод является более чувствительным, чем стрептавидин-биотиновый, и позволяет выявлять слабые антигены [8].
После депарафинирования и регидратации срезов проводили процедуру демаскировки антигенов методом HIAR, описанной в предыдущем разделе. Далее срезы инкубировали 20 мин с 1% раствором перекиси водорода в ТБС для блокирования эндогенной пероксидазной активности, споласкивали в ТБС и инкубировали 5 мин с протеиновым блоком (0,4 % раствор казеина в фосфатном буфере со стабилизаторами и сурфактантом) для уменьшения неспецифического связывания первичных антител. Далее наносили антитела к макрофагальному антигену и инкубировали 60 мин. После инкубации трижды по 3 мин промывали в ТБС и инкубировали 30 мин с постпервичным блоком (Post Primary Block, Novocastra), который усиливает проникновение и связывание полимера с первичными антителами. Далее вновь трижды по 3 мин промывали в ТБС и инкубировали со вторичными антикроличьими/антимышиными антителами, коньюгированными с полимером, к которому "пришито" большое число молекул пероксидазы хрена (Novolink Polymer, Novocastra). Затем препараты промывали также, как после инкубации с первыми и вторыми антителами. Выявление пероксидазной активности и заключение препаратов в глицерин-желатину проводили по протоколу, приведенному в предыдущем разделе.
Двойное иммуногистохимическое окрашивание парафиновых срезов печени антителами против PCNA и макрофагального антигена
Мы предполагаем, что деление холангиоцитов в большей мере является вторичной реакцией в ответ на функциональную недостаточность желчевыделения, возникающую при увеличении массы пролиферирующих гепатоцитов. Причинами отличия в длительности пролиферации холангиоцитов и гепатоцитов видимо служат анатомо-морфологические особенности расположения этих типов клеток. Гепатоцитам в ходе регенерации достаточно восстановить функциональное количество, обеспечивающее адекватную работу органа, при этом "решение задачи" о нормализации микроархитектоники и уменьшении размеров гипертрофированных долек видимо не относится к их "прямым обязанностям". Следовательно, гепатоциты в кратчайшие сроки начинают репликацию ДНК и совершают 2-3 цикла деления. В результате через трое суток в печени мы наблюдаем резкое увеличение размеров печеночных долек и числа гепатоцитов при морфометрическом исследовании (Таблица 4). Однако для нормального функционирования гипертрофированной паренхимы печени требуется соответствующее кровоснабжение и обеспечение желчевыделения. Необходимость обеспечения желчевыделения посредством гуморальных либо межклеточных механизмов вызывает скачок пролиферации холангиоцитов, но так как процессы перестройки микроструктуры печени, новообразования портальных трактов требуют большего времени, пролиферация клеток внутрипеченочных желчных протоков растягивается во времени, и даже через семь суток после операции остается на высоком уровне. Необходимо отметить, что синусоидные клетки, а именно перисинусоидальные клетки, являются основными клетками, создающими микроокружение для дифференцировки холангиоцитов в ходе пренатального развития [463; 231; 10; 5]. Мы предполагаем, что в ходе регенерации печени после ЧГ перисинусоидальные клетки также активируются и обеспечивают формирование желчных протоков в ходе новообразования печеночных долек. Это предположение явилось одной из многих причин изучения пролиферации синусоидных клеток в нашем эксперименте.
Ряд работ показал быстрое увеличение числа перисинусоидальных клеток после ЧГ [210, 327, 365]. Однако кинетика пролиферации синусоидных клеток печени остается полностью не изученной [310]. В целях восполнения пробела знаний, нами была поставлена задача оценить пролиферативную реакцию синусоидных клеток в ходе регенерации после ЧГ.
В печени контрольных животных синусоидные клетки практически не пролиферируют (рис. 8). Первое увеличение числа пролиферирующих синусоидных клеток было выявлено только через двое суток после ЧГ. Максимальная пролиферативная активность отмечена через трое суток (рис. 12). Морфометрический анализ показал, что в это время среднее число пролиферирующих синусоидных клеток составило 44,2±6,1 клетки в поле зрения. Через пять суток число пролиферирующих синусоидных клеток снижалось, а через семь суток было сравнимо с контролем.
Особый интерес с точки зрения изучения пролиферативной активности для нас представляли перисинусоидальные клетки печени. При изучении экспрессии десмина мы наблюдали перисинусоидальные клетки в митозе (рис. 14). Однако для выявления пролиферирующих перисинусоидальных клеток нами было проведено двойное иммуногистохимическое окрашивание на десмин и PCNA. Результаты исследования показали, что большая часть пролиферирующих синусоидных клеток относится к популяции перисинусоидальных клеток (рис. 15). При этом мы установили, что через сутки после операции десмин-позитивные перисинусоидальные клетки не пролиферируют, через двое суток появляются первые пролиферирующие перисинусоидальные клетки (рис. 16).
Через трое суток мы наблюдали позитивное окрашивание по PCNA части экспрессирующих десмин перисинусоидальных клеток, на этом сроке число таких клеток было максимальным и составило 27,3% от общего числа десмин позитивных перисинусоидальных клеток. Через пять суток число пролиферирующих десмин-позитивных перисинусоидальных клеток снижалось, а к концу седьмых суток пролиферация этих клеток прекращалась.
Пролиферативные процессы в печени после ЧГ
Очевидно, что в случае ЧГ активация перисинусоидальных клеток является неполной, незавершенной. Каскадный механизм активации перисинусоидальных клеток по A. Gressner [185] включает 3 этапа: 1) стимуляцию пролиферации перисинусоидальных клеток со стороны поврежденных гепатоцитов - довоспалительная фаза; 2) активацию перисинусоидальных клеток цитокинами активированных клеток Купфера, приводящую к трансформации в миофибробласты - воспалительная фаза; 3) стимуляцию миофибробластов аутокринным путем собственными цитокинами, а также активирующее воздействие этих цитокинов на трансформированные перисинусоидальные клетки - поствоспалительная фаза. Основной функцией транформированных перисинусоидальных клеток является синтез компонентов межклеточного вещества, и, особенно, коллагена I типа [363]. Повышенный синтез именно этого протеина характерен для фиброзирования печени, что послужило причиной рассмотрения миофибробластов печени в качестве основных виновников её фиброза.
Если рассматривать активацию перисинусоидальных клеток с точки зрения каскадного механизма, можно сделать вывод о том, что при репаративнои регенерации печени после ЧГ перисинусоидальные клетки "проходят" только первый этап каскада. Можно предположить, что такой тип активации данных клеток связан с особенностью поражения печени. Классическая миофибробластическая трансформация перисинусоидальных клеток наблюдается при повреждении печени гепатотоксинами, такими как четыреххлористый углерод [281] и при хронических вирусных гепатитах [83]. При повреждении четыреххлористым углеродом развиваются массивные сливные некрозы в центральных зонах печеночных долек. При хронических вирусных гепатитах также имеются массивные некрозы гепатоцитов, но уже преимущественно в перипортальных областях. Для заполнения образовавшихся в результате некрозов пустот в печеночных дольках перисинусоидальные клетки активируются, трансдифференцируются в миофибробласты, приобретают сократимость и подвижность, заполняют дефект ткани синтезируемыми ими компонентами межклеточного вещества и стягивают таким образом края дефекта. Этот процесс можно рассматривать как своеобразную попытку восстановления ткани печени перисинусоидальными клетками. В экспериментальной модели ЧГ происходит потеря большой массы органа, но пропорциональное соотношение клеток печени не нарушается. В данном случае нет фактора, требующего миграции перисинусоидальных клеток, следовательно, миофибробластической трансформации не происходит. В морфологической картине органа отмечаются дистрофические изменения гепатоцитов в виде стеатоза, которые носят обратимый характер. ЧГ не приводит к прямому поражению клеток печени, следовательно, в печени отсутствуют процессы некроза и воспаления. Результаты нашего исследования не выявили миофибробластической траснформации перисинусоидальных клеток, но что более важно, они указывают на обратимость процессов активации перисинусоидальных клеток печени, что позволяет усомниться в их ведущей роли в фиброзировании печени.
В ряде работ, посвященных изучению морфофункциональных характеристик популяции перисинусоидальных клеток при повреждении печени была показана их активация на самых ранних этапах регенерации [58, 194, 223, 283, 440, 168, 161]. Результаты нашего исследования в очередной раз подтверждают данный факт. Однако причины, лежащие в основе данного феномена, до сих пор остаются невыясненными.
Предложено несколько механизмов, лежащих в основе активации перисинусоидальных клеток, среди которых могут быть выделены: изменение межклеточного матрикса, межклеточных контактов и действие цитокинов [395]. Каковы же возможные механизмы активации перисинусоидальных клеток после ЧГ?
Функция и организация промежуточных филаментов цитоскелета в полной мере проявляется лишь тогда, когда клетки находятся в условиях естественного микроокружения [157]. От микроокружения зависит организация цитоскелета и экспрессия белков, входящих в его состав, а сам цитоскелет участвует в механической передаче информации со стороны микроокружения на ядро клетки [464]. Механические взаимодействия между клетками также регулируют активность генов, влияя на пролиферацию и дифференцировку [340, 464]. Перисинусоидальные клетки и гепатоциты взаимодействуют через прямые клеточные контакты [185]. После ЧГ начиная с первых суток уменьшается плотность щелевых контактов между гепатоцитами и перисинусоидальными клетками, а через 36 часов щелевые контакты между этими клеточными типами практически отсутствуют [105]. Причина данного события не ясна, однако, можно предположить, что оно опосредуется активацией синтеза перисинусоидальными клетками металлопротеиназ, в частности ММР9, в ответ на повышение активности урокиназного активатора плазминогена, которое в свою очередь, скорее всего, инициируется повышенным гемодинамическим давлением. Действие металлопротеиназ приводит к уменьшению плотных контактов между клетками и в первую очередь функционально значимо для снятия контактного ингибирования перисинусоидальных клеток. Более того, металлопротеиназы, действуя на интегрины, кадгерины, нектины клеток и связанные с ними белки внеклеточного матрикса, такие как фибронектин, витронектин, коллаген, ламинин, [176] разрушают их и в еще большей степени снимают контактное торможение.
