Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из важных вопросов современной клеточной биологии является изучение регуляции генной экспрессии. Среди многообразия подходов к разрешению этой проблемы значительный интерес представляет исследование антигенных изменений при опухолевой трансформации как модели изучения регуляции генной активности. Основанием для этого может слудить представление об антигенной дивергенции опухолевых клеток, сформулированное Дэем (Дэй, 1966), суть которой состоит в появлении в опухолях антигенов, не свойственных нормальным дефинитивным тканям, но присущих в норме клеткам негсмологичных тканей, впоследствии названных гете-роорганными антигенами. Процессы дисдифференцировни клеток опухолей, обусловленные экспрессией гетероорганных антигенов, могут служить примером изменения работы генома при ма-липшзации и позволяют рассматривать спонтанное возникновение неопластпческой трансформации клк результат действия эндогенных факторов, способных специфически воздействовать на характер экспрессии генов дифференцированной клетки (Кушнер, 1993).
Согласно современным представлениям в первую очередь такого рода факторы следует искать среди ядерных белков и, в частности, среди негистсновых белков хроматина (НГБ). Накопленный к настоящему времени экспериментальный материал позволяет говорить об активном участии отдельных компонентов этой весьма гетерогенной и многофункциональной группы белков в регуляции экспрессии генов ( Цанев, 1980; Phillips et al, 1980; Van Holde , 1988). В связи с этим значительный интерес представляет изучение.НГБ-антигенов, тем более, что они оказываются вовлеченными в процессы антигенной дивергенции при малигнизации клеток. Таї: в составе хроматина клеток гепатоцеллюлярных опухолей и рабдомиосаркомы крыс были обнаружены гетероорганные НГБ-антигены, конститутивно присущие клеткам почек интактных крыс (ГАПП) , которые также появляются в ответ на однократное введение гепатоканцероге-нов в клетках печени и свойственны пролиферируюким клеткам
регенерирующей печени крыс после операции частичной гепа-тзктомии (Кушнер и др, 1984, 1992; Фель и др, 1984). Вместе с тем, имеются указания на возможную причинно-следственную связь между появлением в малигнизированных клетках печени НГБ-ГАПП и. мембранных гетероорганных антигенов той же почечной принадлежности (Фель, 1982).
Принимая во внимание эти сведения, а также сведения о роли НГБ в регуляции экспрессии генов ( Цанев, 1980; Phillips et al,1980; Van Holde. 1988),' можно предполагать, что указанные выше НГБ-антигены, вероятно, являются одними из эндогенных факторов дисдифференцировки в процессах клеточной пролиферации, и малигнизации. Идентификации этих компонентов НГБ и изучению их функциональных свойств и посвящена проведенная работа.
Дели и задачи исследования.
-
Идентификация фракций гетероорганных НГБ-антигенов почечной природы, выявляемых в клетках гепатомы и печени крыс после однократного воздействия гепатоканцерогеном, с помощью биохимических и иммунологических методов.
-
Установление биологического действия хроматогра-фически индивидуальных фракций гетероорганных НГБ-антигенов почечной природы на непролиферирующие клетки в сравнении с нефракционированными препаратами НГБ.
-
Получение и характеристика моноклональных антител к компонентам НГБ - гетероорганным антигенам почечной природы с целью их последующего применения в изучении молекулярно- биологических механизмов функционирования этих белков в различных клеточных процессах.
Научная новизна работы. ; В ходе работы идентифицирован один из НГБ-ГАПП, ассоциированных с гепатомами - фосфопро-теинкиназа с мод.массой около 23 кДа (рр23). Этот белок является основным компонентом узкой белковой фракции, элюиру-емой 0.4-0.5 М NaCL и обладающей собственной фосфопротеин-киназной активностью (СФА), неизменно наблюдаемой при разделении на фосфоцеллюлозе препаратов НГБ из гепатом, печени крыс после однократного введения гепатоканцерогенов, нор-
мальных почек, но никогда - при фракционировании НГБ из печени интактных крыс. Иными словами, установлено, что в ма-лигнизированных клетках печени синтезируется белок рр23, не обнаруживаемый в интактной печени, но свойственный интакт-ной почке.
В экспериментах по стимуляции синтеза ДНК в покоящихся мышиных фибробластах Swiss ЗТЗ было установлено, что стимулирующее пролиферацию действие НГБ из гепатом и "канцерогенной" печени крыс может быть объяснено, в частности, наличием в этих препаратах белка рр23.
Этот белок приводил к индукции на поверхности нормальных гепатоцитов мембранных ГАПП при воздействии на клетки как нефракционированными так и очищенными препаратами НГБ из хроматина малигнизированных клеток печени и клеток нормальных почек крыс.
В ходе работы были получены моноклональные антитела к фракции НГБ из хроматина почек крыс, связывающиеся с фосфопротеинкиназой рр23. С их помощью удалось установить исключительно ядерную локализацию этого белка в малигнизированных клетках печени.
Полученные данные могут служить свидетельством в пользу предположения о регуляторной роли отдельных компонентов НГБ в процессах пролиферации и опухолевой трансформации.
Научно-практическая ценность работы. Результаты работы вносят существенный вклад в понимание свойств отдельных НГБ и их роли во внутриклеточных процессах. Полученные данные могут быть использованы для изучения механизмов регуляции экспрессии генов при дифференцировке и трансформации клеток. Использованный подход к получению моноклональкых антител может быть применен для получения антител к НГБ, содержащимся в хроматине в очень незначительных количествах .
В холе работы разработана оригинальная методика выявления невизуализируемнх иммунопреципитатов (удостоверение N 86/163), значительно повышающая чувствительность метода реакщта специфической задержки преципитации в агарозе.
Апробация работы.Материалы диссертации были доложены на IX Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Черноголовка, 1987), на Всесоюзном совещании "Клеточные и молекулярные механизмы канцерогенеза" (Ленинград, 1988), на Всесоюзном совещании "Актуальные вопроси клеточной биологии" (Ленинград, 1989), на совещании "Биология клетки в культуре" (С.-Петербург, 1992), на Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (С.-Петербург, 1993) и на научных семинарах лаборатории цитологии опухолевого роста Института цитологии РАН.
Публикации. По.теме диссертации опубликовано 12 работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 13^ страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и обсувдения, выводов и списка литературы, содержащего 2?? публикаций, материалы диссертации иллюстрированы 8 рисунками и 7 таблицами.
