Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 10
1.1 Закономерности сперматогенеза у человека 10
1.1.1 Гоноциты, просперматогонии, сперматогонии 10
1.1.2 Профаза I мейоза в сперматогенезе у человека 13
1.1.3 Деления созревания в сперматогенезе 14
1.1.4 Спермиогенез 15
1.1.5 Полизооспермия 18
1.2 Нарушение сперматогенеза при воздействии эндогенных и экзогенных повреждающих факторов 19
1.2.1 Воздействие на генеративную систему физических факторов 19
1.2.2 Варикоцеле и его влияние на репродуктивную функцию мужчины 22
1.2.3 Нарушение сперматогенной функции яичек при инфекционно-воспалительных заболеваниях урогенитального тракта у мужчин 23
1.2.4 Генетически обусловленные нарушения сперматогенеза 27
1.2.4.1 Аномалии половых хромосом 29
1.2.4.2 Аномалии аутосом при нарушении репродуктивной функции 31
1.2.4.3 Генные мутации 32
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 36
II. 1 Объект исследования 36
II.2 Анализ гистологических препаратов биоптатов яичек 36
II.3 Количественный кариологический анализ состава незрелых половых клеток из эякулята 37
II.4 Спермиологический анализ 37
11.5 Онтогенетический анализ лимфоцитов периферической крови 38
II.6 Микроделеционный анализ локусов AZF хромосомы Y 39
II.7 Электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов эякулята 40
И.8 Статистическая обработка данных 40
ГЛАВА III. Результаты собственных исследований и их обсуждение 41
ПІ.1 Формирование потока и групп пациентов по основному клиническому диагнозу, показателям семиологического анализа и результатам цитогенетического обследования 41
Ш.2 Количественный анализ состава незрелых половых клеток по стадиям их развития из эякулята у пациентов с нормальным кариотипом, сперматогенезом и фертильностью 44
Ш.З Анализ сперматогенеза у пациентов с нарушением генеративной функции неясной этиологии 45
III.3.1 Группа пациентов с азооспермией 45
Ш.З.2 Группа пациентов с олигозооспермией 48
Ш.3.3 Группа пациентов с астенозооспермией 51
Ш.3.4 Группа пациентов с тератозооспермией 54
Ш.3.5 Группа пациентов с полизооспермией 59
Ш.4 Анализ сперматогенеза при разном этиопатогенезе (облучение, варикоцеле, хламидиоз) его нарушения и количественный анализ состава НПК по стадиям их развития 62
Ш.5 Анализ сперматогенеза у пациентов с генетически обусловленным нарушением генеративной функции 66
III.5.1 Характеристика сперматогенеза у пациентов со структурными аберрациями хромосом 66
ІП.5.2 Характеристика сперматогенеза при числовых нарушениях хромосом 80
Ш.5.3 Характеристика сперматогенеза при микроструктурных перестройках хромосом и генных мутациях 83
ГЛАВА IV. Обсуждение полученных результатов 92
ГЛАВА V. Заключение 101
Выводы 102
Список литературы 104
- Деления созревания в сперматогенезе
- Нарушение сперматогенной функции яичек при инфекционно-воспалительных заболеваниях урогенитального тракта у мужчин
- Онтогенетический анализ лимфоцитов периферической крови
- Анализ сперматогенеза у пациентов с нарушением генеративной функции неясной этиологии
Введение к работе
Общая характеристика работы. Настоящая работа посвящена исследованию сперматогенеза у мужчин с бесплодием при генетически обусловленной патологии репродуктивной функции, действии биологических, физических факторов, нарушении кровоснабжения яичка. Работа включает раздел, посвященный выработке рекомендаций по обследованию пациентов с бесплодием и комплексной оценки сперматогенеза.
Актуальность темы. Бесплодие поражает около 10-15% супружеских пар. Учитывая результаты исследований последних лет, которые свидетельствуют об ухудшении качества спермы, можно сказать, что в этиологии бесплодия в настоящее время все большее значение приобретает мужской фактор. Несмотря на это диагностика заболеваний мужской половой сферы несовершенна, вследствие многопричинности нарушений и отсутствия общепринятой классификации, которая бы учитывала не только этиологию, но и патогенез заболеваний. Из всех форм мужского бесплодия значительное место занимают неизлечимые случаи инфертильности, к которым относится также и генетически обусловленная патология (Nieschlag ЕД997).
Одной из распространенных причин мужского бесплодия является нарушение сперматогенеза, которое в свою очередь является следствием влияния различных факторов: генетически обусловленная патология половой системы, заболевания яичек и придаточных половых желез, неблагоприятные внешние воздействия, включая профессиональные вредности, производственные аварии, неблагоприятную экологическую ситуацию и т.д.(Місіс et al., 1981; Ombelet, Vereecken, 1995).
Гаметогенез занимает центральное место в функционировании мужской репродуктивной системы и представляет собой гормонально-зависимый и генетически детерминированный процесс. Постоянно протекающие в сперматогенном эпителии процессы дифференцировки половых клеток, делают процесс сперматогенеза уязвимым на молекулярном, клеточном уровнях при действии повреждающих факторов различной природы. Изменение под их влиянием морфологических и/или функциональных характеристик половых клеток может стать причиной бесплодия у мужчины. Учитывая также уникальную роль половых клеток в онтогенезе, как фактора, несущего генетическую информацию и дающего начало генетически новому организму, становится очевидным возрастание опасности отдаленных последствий в результате действия повреждающих факторов в отношении здоровья, в том числе репродуктивного, последующих поколений.
Как было указано выше, на протяжении последних десятилетий отмечают общую тенденцию к снижению качества эякулята по количественным и функциональным критериям сперматозоидов. Несомненно, что такой результат может быть связан и с воздействием повреждающих факторов (чему способствовало бурное развитие науки и техники в XX веке, ухудшение экологической ситуации, внедрение в медицинскую практику новых лекарственных препаратов и т.д.) в антенатальном периоде или на организм взрослого мужчины (Шейко А.Д. и соавт., 2001; Быков В.Л., 2000.). Под влиянием эндогенных и/или экзогенных факторов в гаметах могут возникать аномалии цитоструктур, нарушения на уровне генов и хромосом. Это может привести к гибели половых клеток (гаметическая селекция на разных этапах их дифференцировки) или сохранению их жизнеспособности и участию в оплодотворении. В случае последнего повышается вероятность гибели эмбриона (эмбриональная селекция) или развития больного потомства (Курило Л.Ф., 1998; Шейко Л.Д. и соавт., 2001).
Полиэтиологичность мужской суб- или инфертильности, а также достаточно высокий удельный вес идиопатического бесплодия, предполагают расширение методов диагностики, применяемых в клинической практике. ВОЗ в четвертом издании (WHO, 1999) руководства по лабораторному исследованию эякулята и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью указывает на "необходимость поиска новых стандартизованных и усовершенствованных методов исследования эякулята", принимая во внимание, как один из многих неблагоприятных факторов, ухудшение экологической ситуации и влияние загрязнений окружающей среды на мужскую репродуктивную функцию.
Отсутствие понимания возможных составляющих мужской стерильности может привести к ошибке в диагнозе и лечении. В связи с этим становится несомненным, что для правильного подбора лекарственной терапии, разработки профилактических мероприятий требуется детальное понимание механизмов гаметотоксического эффекта тех или иных повреждающих факторов, имея в виду» что многие из них оказывают сочетанное повреждающее влияние на гонады и гаметы.
Исходя из вышесказанного, целью настоящего исследования явилось; изучение особенностей дифференцировки мужских половых клеток при генетически обусловленных нарушениях репродуктивной, функции; действии биологических, физических факторов; нарушении кровоснабжения яичка; а также создание схемы обследования мужчин с бесплодием для комплексной оценки сперматогенеза.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Установить характер цитологических и гистологических изменений в яичках при хромосомной, генной патологии сперматогенеза, заболеваниях мужской половой системы и гаметотоксическом влиянии факторов внешней среды.
2. Провести сравнение состояния сперматогенеза у мужчин с бесплодием разной этиологии и контрольной группы, используя количественный анализ состава НПК из эякулята.
3. Создать программу обследования с целью комплексной оценки сперматогенеза при нарушении генеративной функции различной этиологии у мужчин.
Практическая значимость работы. Практическая ценность заключается в выработке рекомендаций по совершенствованию диагностического и прогностического обследования мужчин, страдающих бесплодием. Показана необходимость проведения цитогенетического анализа лимфоцитов периферической крови, количественного кариологического анализа состава незрелых половых клеток из эякулята, ультраструктурного анализа мужских половых клеток, молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических методов при нарушении репродуктивной функции в схеме комплексного клинико-андрологического обследования пациентов с бесплодием. Выводы и рекомендации работы предложены для внедрения в клиническую практику и использованы специалистами, занимающимися проблемами механизмов нарушения репродуктивной функции человека, а также при медико-генетическом консультировании.
Новизна и научная ценность. На материале обширной группы пациентов была определена частота генетически обусловленной патологии в структуре мужского бесплодия неясной этиологии: при азооспермии - 20%, при олигозооспермии - 8%; при астенозооспермии - 6%; при астенотератозооспермии - 5%; при нормозооспермии — 2%.
У пациентов с одинаковыми формами генетически обусловленной патологии выявлена гетерогенность нарушений сперматогенеза.
Определена возможность завершения сперматогенеза при синдроме Клайнфельтера (кариотип 47,XXY) и синдроме Де ля Шапелля (46,XX-male).
Впервые проведенное исследование сперматогенеза у пациентов с полизооспермией свидетельствует о блоке дифференцировки гамет на разных стадиях профазы I мейоза и в делениях созревания.
У пациентов с хламидийной инфекцией, отмечена тенденция нарушения сперматогенеза на разных стадиях дифференцировки мужских половых клеток и слущивания незрелых половых клеток в просвет извитых семенных канальцев.
Положения, выдвигаемые на защиту:
1. Одинаковые формы генетически обусловленной патологии характеризуются гетерогенностью нарушений сперматогенеза;
2. У пациентов с генетически обусловленной азооспермией в осадке эякулята выявлены не только сперматоциты и сперматиды, но и сперматозоиды, что свидетельствует о вовлечении широкого спектра генов, локализованных на разных хромосомах и контролирующих различные этапы сперматогенеза.
3. У пациентов с варикоцеле, а также при хламидийной инфекции выявлена тенденция нарушения сперматогенеза на разных стадиях дифференцировки мужских половых клеток.
4. Анализ состояния сперматогенеза при полизооспермии позволяет рассматривать эти случаи как определенную форму, характеризующуюся нарушением сперматогенной функции.
Деления созревания в сперматогенезе
Затем наступает следующая после профазы I мейоза стадия первого мейотического деления - метафаза I мейоза. На этой стадии хромосомы располагаются в области экваториальной пластинки и затем в течение анафазы каждая тетрада (состоящая из четырех хроматид) распадается на два бивалента, расходящиеся к противоположным полюсам веретена деления. Поэтому в телофазе I мейоза у каждого полюса оказывается гаплоидное число хромосом, каждая из которых состоит из двух хроматид. По окончании первого мейотического деления образуются два сперматоцита II порядка. После непродолжительной интерфазы (синтеза ДНК не происходит, хромосомы конденсированы) наступает второе мейотическое деление, протекающее аналогично митозу; к противоположным полюсам расходятся хроматиды. В результате две сперматоциты II порядка превращаются в четыре сперматиды, каждая из которых содержит гаплоидный набор хромосом. Для половых хромосом в метафазе II характерно явление прередукции: в первом делении половые хромосомы расходятся к разным полюсам, а разделение каждой их них на хроматиды центромеров происходит во втором (эквационном) делении (White, 1954; Ford, 1969).
Спермиогенез - это процесс сложной дифференцировки сперматиды, который затрагивает все органеллы клетки и в результате которого из каждой сперматиды формируется функционально зрелый сперматозоид. Сперматозоид - зрелая мужская половая клетка, конечный этап дифференцировки, в результате которого зрелая гамета способна к активному движению и оплодотворению яйцеклетки (рис.2).
В среднем головка сперматозоида человека имеет длину 5-7 мкм и ширину в экваториальном сегменте около 2,5-3,5 мкм. Большую часть объема головки занимает гомогенный гиалиноподобный хроматин. Такая структура ядра зрелого сперматозоида является результатом физико-химической и морфологической трансформации, которая осуществляется на поздней стадии спермиогенеза и продолжается во время прохождения сперматозоидов через эпидидимис. Аномальная конденсация хроматина сперматозоидов, выявляемая при электронно-микроскопическом исследовании, выражается наличием грубогранулярного ядерного вещества ("незрелый хроматин"), обычно характерного для удлиненных сперматид. Описана связь низкой степени конденсации хроматина с наличием в гамете хромосомных аберраций, что может в последующем явиться причиной нарушения эмбриогенеза (Abramson et al., 1982).
Лизосома трансформируется в акросому, которая содержит несколько десятков протеолитических ферментов. Эти ферменты обеспечивают проникновение сперматозоида через оболочки яйцеклетки и активизируются в процессе акросомной реакции. Недостаточность генов, контролирующих синтез данных ферментов, а также нарушение формирования самой акросомы клинически у мужчин проявляется бесплодием. В эякуляте у подавляющего числа сперматозоидов выявляется нарушение строения или полное отсутствие акросомы (глобулозооспермия; синдром округлых головок) в сочетании с аномалией организации хроматина ядра, нарушением строения среднего отдела сперматозоида (Брагина Е.Е.и соавт., 1997). У сперматозоидов с агенезом акросомы изменяется проницаемость плазматической мембраны для ионов Са, теряется их способность прикрепляться к мембране ооцита.
По данным литературы этот синдром встречается у 0,1% всех мужчин с бесплодием. Предполагают, что данный синдром является следствием генетически обусловленного нарушения морфогенеза сперматозоидов (Florke-Gerloff et al.,1984; Carrell et al.,1999). Ген CSNK2A2 (casein kinase II, alfa-2), локализованный на 16 хромосоме (pl3.3-pl3.2), является кандидатным геном в развитии данного синдрома.
Жгутик имеет сложное строение. Основной его структурой является осевой комплекс, состоящий из двух центральных микротрубочек и девяти парных периферических (рис.3). Все 9 периферических фибрилл сформированы из белка тубулина и состоят из микротрубочек А и В. Периферические фибриллы соединены между собой нектиновой связкой (содержит белок нектин). На 9 А-микротрубочках локализованы наружные и внутренние динеиновые ручки (образованы из белка динеина). Весь этот комплекс фибрилл составляет аксонему. Вследствие генетически обусловленного отсутствия синтеза белка динеина возникает абсолютная астенозооспермия, которая является причиной мужского бесплодия (Брагина Е.Е. и соавт., 1997). Абсолютная астенозооспермия может являться одним из признаков синдрома Картагенера, полигенного генетически обусловленного заболевания. Этот синдром также характеризуется наличием хронической патологии дыхательных путей, вследствие функциональной недостаточности ресничек дыхательного эпителия, снижением слуха по проводящему типу, в некоторых случаях, декстракардией (Козлова СИ. и соавт., 1996; Azfelius В. et al.,1975; Pedersen Н. and RebbeH.,1975).
Средний отдел жгутика окружен спиралью из митохондрий, необходимых для продукции энергии, которая обеспечивает двигательную активность клетки. Общее количество этих органелл в мужских половых клетках составляет от 2000 до 3000 (Meinhardt A. et al., 1999). Митохондрии локализованы компактно по окружности вдоль длины среднего отдела жгутика сперматозоида на протяжении 5-7 мкм. Мутации митохондриальной ДНК могут приводить к нарушению подвижности сперматозоидов и быть причиной бесплодия.
Жгутик сперматозоида должен быть прямым, равномерной толщины на всем его протяжении. При использовании методов фазово-контрастной и флюоресцентной микроскопии было показано, что дисплазия фиброзной оболочки жгутика (DFS-dysplasia of the fibrous sheath) сперматозоида является причиной тяжелой астенозооспермии (Rawe V. et al., 2001). В зависимости от количества в эякуляте поврежденных сперматозоидов выделяют полную и неполную формы синдрома DFS (ChemesH. etal.,1998).
Таким образом, генетически обусловленное нарушение спермиогенеза или воздействие на различные этапы спермиогенеза повреждающих факторов приводит к функциональной неполноценности сперматозоидов и может являться причиной мужского бесплодия.
Нарушение сперматогенной функции яичек при инфекционно-воспалительных заболеваниях урогенитального тракта у мужчин
Инфекции (заболевания), передающиеся половым путем (sexually transmitted diseases) (ИППП) являются одними из наиболее частых заболеваний у человека. Каждый год в мире регистрируется более чем 162 млн новых случаев таких инфекций как сифилис, гонорея и хламидиоз (Могзе,2001). Учитывая высокую частоту ИППП среди мужчин и женщин репродуктивного возраста, возможное влияние их на здоровье потомства, можно сказать, что данная проблема носит не только медицинский, но и социальный характер.
Бактериальные и вирусные инфекции половых путей являются одним из основных этиологических факторов, приводящих к мужскому бесплодию. Патогенная или условно-патогенная микрофлора, являясь причиной воспалительного процесса в добавочных половых железах (эпидидимит, везикулит, простатит) и яичках (орхит), может приводить к изменению количественных и качественных характеристик сперматогенеза и/или обструкции семявыводящих путей и стать причиной мужского бесплодия. У некоторых пациентов параметры спермы могут оставаться нормальными, однако повреждение гематотестикулярного барьера может индуцировать продукцию антиспермальных антител и иммунологическое бесплодие. Наряду с этим возможно снижение оплодотворяющей способности сперматозоидов in vitro и in vivo (Comhaire F. et al., 1999). В литературе широко обсуждается важная роль в патогенезе мужского бесплодия, в том числе при ИППП, реактивных форм кислорода (свободных радикалов), участвующих в повреждении мембран сперматозоидов, изменении акросомной реакции, и в результате, снижении оплодотворяющей способности мужских половых клеток (Depuydt С. et al., 1998; Ichikawa Т. et al., 1999; Pasqualotto F. et al., 2000; Urata K. et al., 2001).
Наиболее часто диагностируемыми агентами при инфекционно-воспалительных заболеваниях урогенитального тракта являются хламидии (C.trachomatis), нередко в ассоциации с уреа-микоплазменной флорой (U.urealyticum, M.hominis), частота выявления которой в сперме варьирует от 7 до 42% (Keck С. et al., 1998; Reichart М. et al., 2000). Эти микроорганизмы способны адсорбироваться на сперматозоидах, вызывая повреждение цитоплазматических мембран. Хламидии прикрепляются к сперматозоидам в области акросомы, шейки и проксимальной части хвоста, что вызывает в этих структурах морфологические нарушения и приводит к интенсивной дегенерации сперматозоидов. При исследовании нарушений сперматогенеза при хламидийной инфекции показано также наличие корреляции между астено- и тератозооспермией и величиной титра IgA: в группах пациентов с более высоким титром IgA эти аномалии встречаются достоверно чаще (Tocuda N. et al., 1999; Брагина Е.Е., 2001). Инфекция, в том числе уреа-микоплазменная, обнаруживаемая в сперме, вызывает деконденсацию хроматина половых клеток и повреждение отцовской ДНК, что может стать причиной не только бесплодия, но и неблагоприятных исходов беременностей вследствие генетически обусловленных нарушений у потомства (Reichart М. et al., 2000).
Вирус простого герпеса (ВПГ) влияет на клеточные деления, вызывая аномалии расхождения хромосом и блокируя цитокинез. Этим объясняется, что у больных с выявленной герпетической инфекцией эякулята происходит значительное уменьшение количества сперматозоидов и увеличение содержания полиплоидных сперматозоидов (Брагина Е.Е., 2001). Также увеличивается количество незрелых половых клеток (НПК), которые «слущиваются» в просвет семенных канальцев (Брагина Е.Е. и соавт., 1998). Процесс «слущивания» НПК, кроме того, объясняется инфицированностью клеток сперматогенного эпителия, выступающих в качестве депо сохранения вируса (Брагина Е.Е.., 2001).
К одному из наиболее частых венерических заболеваний относится гонорея, возбудителем которой является гонококк (Neisseria gonorrhoeae Trevisan). Гонококковое воспаление, как правило, локализуется в мочеполовых органах (генитальная форма), вызывая у мужчин, прежде всего, воспаление слизистой оболочки уретры. Трансканаликулярное распространение гонококков обусловливает воспалительный процесс в области придатка яичка (эпидидимит).
Зачастую одновременно с гонококками обнаруживаются другие возбудители заболеваний, передающихся половым путем (ИППП) (хламидии, уреаплазмы, трихомонады и др.), что объясняется единством локализации патологического г процесса и сходством патогенеза. Из-за обтурации семявыносящих путей двусторонний эпидидимит очень часто приводит к аспермии. Однако и односторонние эпидидимиты отражаются на сперматогенной функции яичек и вызывают патологические изменения в сперме (Курило Л.Ф. и соавт., 1995).
У лиц, перенесших в анамнезе гонорею, снижается объем эякулята, уменьшается количество сперматозоидов в 1 мл эякулята, нарушается двигательная функция сперматозоидов (доля малоподвижных и неподвижных сперматозоидов возрастает). Показано, что у пациентов, перенесших гонорею и достаточно сильное медикаментозное лечение, возможно поражение аппарата веретена деления в делящихся сперматогониях и сперматоцитах, в результате чего возникает частичный блок делений созревания, и увеличение числа сперматоцитов в метафазе мейоза (делений созревания) (Курило Л.Ф. и соавт., 1995). Кроме того, происходит снижение числа сперматоцитов II и сперматид и нарушение спермиогенеза. При этом на уровне НПК интенсивно протекают дегенеративные процессы и увеличивается число неидентифицируемых половых клеток.
Согласно приведенным данным, результаты большинства научных исследований подтверждают возможность отрицательного влияния инфекций на репродуктивную функцию мужчин. Оценить состояние сперматогенеза как динамичного процесса возможно при постадийном изучении половых клеток. Установление особенностей нарушения позволило бы диагностировать на ранних этапах развития недостаточность фертильности и проводить контроль эффективности терапии.
Рассматривая влияние инфекций на мужскую половую систему в целом и сперматогенез в первую очередь, необходимо отметить и воздействие антибиотикотерапии, проводимой в таких случаях. По данным литературы, при лечении антибиотиками андрологических больных нередко наблюдается улучшение показателей сперматогенеза. Такие данные получены в отношении эритромицина, джозамицина, норфлоксацина (Dfekeret Н. al., 1984; Schramm P. et al., 1988). Однако наряду с улучшением показателей спермограммы отмечено повышение количества аномальных сперматозоидов, что не исключает мутагенного или гаметотоксического действия антибиотика на половые клетки и вследствие этого возникает проблема генетического риска для потомства.
В литературе имеются свидетельства угнетающего действия антибиотиков на сперматогенез и оогенез. Наименее устойчивыми к разного рода экзогенным воздействиям являются митотически делящиеся клетки, в том числе 00- и сперматогонии. Здесь следует отметить серию экспериментов по воздействию на беременных самок мышей и крыс цитостатиком ТиоТэф, окситетрациклином, алкоголем, никотином в периоды, когда у эмбрионов идет формирование пула половых клеток (Хилькевич Л.В., Курило Л.Ф., 1992; Курило Л.Ф. и соавт.,1994). Установлено замедление дифференцировки гамет, усиление их дегенерации. Кроме того, было показано нарушение фолликулообразования, уменьшение пула примордиальных фолликулов и овуляции ооцитов, нарушение пролиферации ооцитов и сперматоцитов, повышение уровня патологии мейоза, что приводит к анеуплоидии гамет. Данные нарушения приводят к снижению пула половых клеток у потомства (в женском организме необратимо). Этими же авторами (Курило Л.Ф. и соавт.,1994) была разработана система тестирования гаметотоксического действия повреждающих факторов и предложены количественные критерии оценки гаметогенеза по прохождению половыми клетками последовательных этапов развития, по пролиферативной активности оо- и сперматогониев, оо- и сперматоцитов, по дегенерации гамет, по интенсивности фолликулообразования и спермиогенеза.
Онтогенетический анализ лимфоцитов периферической крови
Данные анализа кариотипа лимфоцитов периферической крови необходимы для проведения дифференциального диагноза генетически обусловленных нарушений репродукции и заболеваний иной природы. а) Метод получения митотических хромосом лимфоцитов периферической крови: использовали метод культивирования лимфоцитов (полумикрометод), предложенный Hungerford et al.(1965) с модификациями. В стерильные флаконы с гепарином вносили 2 мл периферической крови. Затем в стерильных условиях, после добавления ФГА, сыворотки крупного рогатого скота и среды ИГЛА с глютамином, клетки культивировали в течение 72 часов при температуре 37 С. и за 1,5 часа до фиксации добавляли колхицин. На 72 часу культивирования суспензию центрифугировали (1,5 тыс. об./мин.) в течение 7 минут. После ресуспензии клеток осадка после добавления подогретого до 37С гипотонического раствора 0,55% КС1 суспензию инкубировали в термостате (37С) 15-20 мин. Фиксацию проводили свежеприготовленным и охлажденным фиксатором (смесь метанола - ледяной уксусной кислоты в пропорции 3:1), который меняли несколько раз. По завершении последней смены фиксатора суспензию клеток наносили на заранее приготовленные, охлажденные стекла. Стекла высушивали на воздухе. б) G-метод дифференциальной окраски митотических хромосом.
Высушенные на воздухе препараты окрашивали с помощью G-метода. G-окраску метафазных хромосом проводили с использованием 0,25% раствора трипсина по технике, приведенной Seabright (1971). На каждые 10 мл раствора красителя Гимза на фосфатном буфере (рН - 6,8) добавляли 0,02 - 0,06 мл 0,25% раствора трипсина. Оптимальное время окрашивания препаратов подбирали эмпирически (Захаров А.Ф. и соавт., 1982).
Результаты цитогенетического исследования приведены согласно Международной системе номенклатуры цитогенетики человека (ISCN, 1995) ДНК для проведения ПЦР выделяли по стандартной методике с определенным набором праймеров, который включал в себя 3 пары Y- специфичных STSs. 1. для субрегиона AZFa (интервал 5С- 5D): DYS275; 2. для субрегиона AZFb (интервал 5P-6D): DYS224; 3. для субрегиона AZFc (интервал 6E-6F): DYS249 ДНК - исследование проведено при участии сотрудника лаборатории генетики нарушений репродукции к.м.н. В.Б. Черных, которому автор выражает благодарность. Эякулят фиксировали 2,5% р-ром глютарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере в соотношении 1:20. После центрифугирования к осадку добавляли 2 мл фиксатора, ресуспендировали, инкубировали при 4С в течение 60 мин.
Материал центрифугировали, к осадку добавляли 2 мл буфера, инкубировали при 4С 15 мин. Затем после центрифугирования к осадку добавляли 2 мл четырехокиси осмия, фиксировали 1-1,5 часа при 4 С. Затем материал дегидратировали в спиртах возрастающей крепости.
Контрастировали 12-14 часов в растворе уранилацетата в 70%-ном этаноле. Затем проводили дегидратацию материала в спиртах возрастающей крепости (70, 96, 100), абсолютном ацетоне. Предварительную пропитку материала проводили в трех смесях абсолютного ацетона или окиси пропилена с эпоксидной смолой. Полимеризация 24 часа при 37С и 24 часа при 56С. Из залитого в эпоксидную смолу эякулята на ультратоме готовили ультратонкие срезы, которые контрастировали цитратом свинца.
Автор выражает благодарность д.б.н. Е.Е.Брагиной за участие в проведении данного раздела работы.
Достоверность полученных результатов определяли при помощи компьютерной программы "STATISTICA 6.0". Для анализа данных использовали методику вычисления средних показателей, их ошибок репрезентативности, расчета среднего квадратичного отклонения, определения: достоверности средних показателей, применяя методы сравнения средних и относительных величин непараметрической корреляции. Результаты считали достоверными, если различие по Т-критерию Стьюдента было незначимым, т.е. уровень значимости не превышал 0,01 (р 0,01) (Урбах,1975).
Автор приносит искреннюю благодарность всем, кто принимал участие в обследовании пациентов и помогал в проведении исследовательской работы: сотрудникам лаборатории генетики нарушений репродукции ГУ МГНЦ ГАМН -к.б.н. Л.В. Шилейко, Т.В. Остроумовой, Т.М. Сорокиной, к.б.н. Л.С. Ширшовой.
В лаборатории генетики нарушений репродукции ГУ МГНЦ РАМН с 1986 по 2003 год было проведено 1305 исследований спермы мужчин, обследующихся по поводу бесплодия в браке. Из них приблизительно в 49% случаев выявлена азооспермия и олигозооспермия.
Согласно классификации показателей эякулята (WHO, 1999) (табл. 1,2) случаи астенозооспермии в сочетании с тератозооспермией (при которой отмечают не более 85% патологически измененных сперматозоидов) или без нее составляют около 30% от общего числа обследованных (рис.5). Приблизительно 9% от числа мужчин с бесплодием составляют пациенты с тератозооспермией (более 85% патологически измененнных сперматозоидов в эякуляте) (116 случаев). Около 8% мужчин с бесплодием (114 случаев) имели нормальные показатели спермограммы. В небольшом проценте случаев (около 5%) выявлена полизооспермия (концентрация сперматозоидов выше 150 млн/мл).
Во многих случаях, как показано в нашей работе, встречается сочетание нарушений двух или трех показателей: олигоастенозооспермия, олигоастенотератозооспермия, астенотератозооспермия. Более чем в половине случаев снижение количества зрелых половых клеток сопровождалось снижением количества морфологически нормальных форм сперматозоидов в эякуляте, что, возможно, влечет за собой также и снижение подвижности половых клеток. У пациентов с тяжелой олигозооспермией тератозооспермия сочетается с некроспермией (повышение доли мертвых сперматозоидов в эякуляте). Такие изменения наводят на мысль о том, что нарушение сперматогенеза в результате действия повреждающего фактора не ограничивается определенным этапом, а затрагивает разные звенья этого процесса.
Анализ сперматогенеза у пациентов с нарушением генеративной функции неясной этиологии
Полученные данные по КА НПК были подтверждены при проведении гистологического исследования биоптатов яичек. Так, у одного пациента с робертсоновской транслокацией (45,XY,der(13;14)) (к.№380) при семиологическом анализе выявлена олигоастенотератозооспермия. В анамнезе у этого пациента -хронический простатит. При КА НПК обнаружен частичный блок сперматогенеза на стадии пахитены профазы I мейоза. Отмечено повышение количества неразошедшихся сперматид. При анализе гистопрепаратов биоптата яичка выявлено снижение числа клеток Лейдига, утолщение, многослойность и фестончатые очертания базальной мембраны семенных канальцев (рис.12). Перитубулярные клетки представлены в достаточном количестве. В извитых семенных канальцах были выявлены все стадии развития клеток сперматогенного эпителия, но вследствие блока сперматогенеза на стадии пахитены лишь часть сперматоцитов I переходит в деления созревания, а далее в сперматиды и сперматозоиды. Вероятно, частичный блок сперматогенеза в данном случае является причиной снижения количества зрелых половых клеток в эякуляте.
У другого пациента с аналогичной ХА (кариотип 45,XY,der(13;14)) (к.№376) при семиологическом анализе выявлена азооспермия. При КА НПК отмечено снижение доли сперматоцитов II/сперматид и повышение доли неидентифицируемых незрелых половых клеток, что свидетельствует об интенсивности дегенеративных процессов. При гистологическом исследовании биоптата левого яичка этого пациента отмечено наличие соединительной ткани в большей части исследованных срезов биоптата яичка (рис. 13). В другой части исследованных срезов выявлены семенные канальцы незрелого типа, в которых имеются единичные сперматогонии, единичные сперматоциты на стадии пахитены, недиференцированные клетки Сертоли. При исследовании биоптата правого яичка отмечено незначительное снижение числа клеток Лейдига по сравнению с нормой. Перитубулярная мембрана семенных канальцев представлена без особенностей. Несколько увеличено число семенных канальцев с десквамацией клеток сперматогенного эпителия. В некоторых канальцах наблюдается частичный блок сперматогенеза на стадии пахитены профазы I мейоза.
Оба описанных выше случая свидетельствуют о том, что наличие структурно измененных хромосом в половых клетках препятствует нормальному течению мейоза, вследствие нарушения конъюгации и кроссинговера между гомологичными хромосомами и активизации процессов селекции генетически неполноценных гамет.
В целом можно сказать, что при использовании КА НПК из эякулята у пациентов с генетически обусловленной патологией, а именно со структурными нарушениями хромосом, была отмечена задержка сперматогенеза на разных стадиях профазы I мейоза, что приводит в ряде случаев к снижению количества клеток на стадии сперматоцитов II/ сперматид (табл. 9). В патогенезе нарушений сперматогенной функции при структурных перестройках хромосом не последнее место занимает нарушение прохождения половыми клетками, прежде всего профазы I мейоза, с опосредованным нарушением формирования синаптонемного комплекса, конъюгации гомологичных хромосом.
Как показано в нашем исследовании в 6-ти случаях (около 30%) у пациентов-носителей структурных ХА была выявлена нормальная концентрация сперматозоидов в эякуляте (рис.11). Так, у одного пациента (к.№8711) в группе мужчин-носителей структурных перестроек хромосом при цитогенетическом исследовании обнаружен кариотип 46,XY, t (11;12). Количество сперматозоидов в эякуляте у данного пациента соответствует нормальным значениям (ВОЗ, 1992,1999) (96 млн/мл), среди них 87% живых гамет. Однако при анализе НПК выявлен частичный блок на стадиях предпахитены, пахитены профазы I мейоза и, вероятно, вызванное этим блоком уменьшение количества клеток на стадии сперматид.
Нормальное количество зрелых половых клеток в эякуляте обнаружено у семи пациентов со структурными перестройками: 45,XY,der(13;14)(qlO;qlO); 2 случая 46,X,del(Y); 46,XY,t(l;22); 46,XY,t(ll;12); 46,XY,t(14;Y)(pl2;ql2). Как мы видим в нашей работе одни и те же структурные перестройки хромосом не всегда сопровождаются значительным нарушением сперматогенеза. Например, транслокации между хромосомами 13 и 14 в одних случаях приводят к азоо- и тяжелой олигозооспермии (что было показано ранее), в других случаях концентрация сперматозоидов в эякуляте находится в пределах нормы.
Эти данные подтверждают гипотезу о том, что в структурную перестройку могут быть вовлечены различные участки хромосом и, следовательно, затронуты различные гены. Некоторые из этих генов могут участвовать в регуляции тех или иных этапов сперматогенеза, и их структурные изменения приводят к тем или иным нарушениям сперматогенеза.
В нашем исследовании выявлено также три случая структурных перестроек с вовлечением хромосомы Y. Известно, что именно на этой хромосоме локализуется группа генов (локус AZF), ответственных за некоторые этапы сперматогенеза. Данные литературы свидетельствуют о вариабельности расположения точек разрыва при транслокации с вовлечением хромосомы Y. Если нарушается функциональная структура гена AZF, то наблюдают тяжелое угнетение сперматогенеза вплоть до отсутствия половых клеток в эякуляте (Шаронин, 1998; Черных, 2002).
У одной супружеской пары (к. №2788), обследующейся по поводу бесплодия в браке в течение 6-ти лет, при кариотипировании супругов у мужа выявлен кариотип 45,X,-Y,der(22)t(Y;22), у жены - 46,XY (нормальный женский кариотип) При спермиологическом обследовании супруга выявлены олигоастенотератозооспермия, частичный блок сперматогенеза на стадиях до пахитены профазы I мейоза, высокий индекс НПК. Обнаруженная хромосомная аномалия у супруга, является причиной нарушения сперматогенеза, вследствие нарушения процессов коньюгацик и кроссинговера и задержки половых клеток на до пахитенных стадиях мейоза, а также слущивания незрелых половых клеток в просвет извитых семенных канальцев. Кроме того, вовлечение в структурную перестройку хромосомы Y может быть причиной нарушения структуры локуса AZF, что усугубляет фенотипические проявления данной патологии. Однако часть клеток с данной хромосомной аномалией "преодолевает " этот барьер и вступает в спермиогенез. Вследствие этого часть сперматозоидов имеет несбалансированный геном, который и превносит в яйцеклетку при оплодотворении. Вследствие наличия хромосомных аномалий нарушаются процессы дробления оплодотворенной яйцеклетки. Поэтому даже попытки ICSI (3 раза) у данной супружеской пары оказались безуспешными: остановка дробления оплодотворенной яйцеклетки на стадии 2-4 бластомеров. Однако даже в такой ситуации возможно успешное оплодотворение и рождение здорового ребенка, однако риск хромосомных аномалий у плода (в том числе и несовместимых с жизнью) очень высок.
