Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Клинические аспекты травмы спинного мозга 17
1.2. Патогенез травмы спинного мозга: тканевые, клеточные и молекулярные аспекты 23
1.3. Молекулярные факторы контроля нейрорегенерации при травме спинного мозга 42
1.3.1. Ингибиторы роста аксонов .42
1.3.2. Молекулы внеклеточного матрикса 43
1.3.3. Молекулы-навигаторы 43
1.3.4. Молекулы потенциальных стимуляторов нейрорегенерации .46
1.3.4.1. Сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF 46
1.3.4.2. Фактор роста фибробластов FGF2 47
1.3.4.3. Глиальный нейротрофический фактор GDNF .49
1.3.4.4. Молекулы адгезии .50
1.4. Клеточная терапия при травме спинного мозга 51
1.4.1. Клетки обонятельной выстилки .52
1.4.2. Шванновские клетки .54
1.4.3. Эмбриональные стволовые клетки .57
1.4.4. Нейральные стволовые клетки .58
1.4.5. Мезенхимные стволовые клетки 60
1.4.6. Клетки стромы костного мозга 61
1.4.7. Клетки крови пуповины .63
1.5. Генная терапия при травме спинного мозга 69
1.5.1. Вирусные векторы для доставки терапевтических генов при травме спинного мозга 70
1.5.2. Невирусные векторы 73
1.6. Клеточно-опосредованная доставка терапевтических генов при травме спинного мозга (генно-клеточная терапия) 80
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Животные и экспериментальные группы .85
2.1.2. Дозированная контузионная травма спинного мозга 85
2.1.3. Клетки обонятельной выстилки человека 87
2.1.4. Клетки крови пуповины человека .89
2.2. Гистологические исследования 91
2.2.1. Зоны морфометрии .92
2.2.2. Трансмиссионная электронная микроскопия 93
2.2.3. Иммуногистохимия .93
2.3. Создание AdV-GDNF и трансдукция клеток крови пуповины .94
2.4. Оценка восстановления функции спинного мозга .95
2.5. Световая микроскопия 96
2.6. Программное обеспечение и статистическая обработка результатов 96
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение
3.1. Эффекты трансплантации в область травматического повреждения нативных КОВ и ККП человека, их жизнеспособность и миграционный потенциал 97
3.1.1. Влияние трансплантации КОВ на посттравматическую регенерацию спинного мозга крысы .97
3.1.2. Влияние трансплантации ККП на посттравматическую регенерацию спинного мозга крысы .112
3.2. Влияние на посттравматическую регенерацию спинного мозга крысы трансплантации ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2 .128
3.3. Эффективность посттравматической регенерации при прямой генной терапии плазмидой pBud-VEGF-FGF2 156
3.4. Влияние ККП, трансдуцированных аденовирусом AdV-GDNF, на
посттравматическую регенерацию 181
4 3.5. Эффективность посттравматической регенерации при прямой генной терапии аденовирусом AdV-GDNF 199
Заключение .214
Выводы .217
Список литературы 220
- Молекулярные факторы контроля нейрорегенерации при травме спинного мозга
- Мезенхимные стволовые клетки
- Клетки крови пуповины человека
- Влияние трансплантации ККП на посттравматическую регенерацию спинного мозга крысы
Введение к работе
Актуальность проблемы
Травма спинного мозга вызывает комплекс патологических сдвигов, включающий
гибель нейронов и глиальных клеток, дегенерацию нервных волокон, демиелинизацию,
активацию микроглии и макрофагов. Эти нарушения являются причиной устойчивого
функционального дефицита, усугубляемого естественными лимитирующими
нейрорегенерацию факторами в центральной нервной системе. Поиск новых методов лечения травмы спинного мозга является актуальным.
Среди немногочисленных экспериментальных подходов стимулирования
посттравматической регенерации спинного мозга одно из ведущих мест принадлежит клеточной терапии. Трансплантируемые клетки необходимы для восстановления тканевого матрикса и формирования направляющих путей для роста аксонов, поддержания выживания нейронов и глиальных клеток, удлинения аксонов, стимулирования процесса миелинизации. Этим условиям в разной степени удовлетворяют клетки нескольких типов, трансплантируемых при экспериментальной травме спинного мозга. Интерес вызывают работы, выполненные с трансплантацией стволовых мезенхимных клеток и нейральных клеток обонятельной выстилки (КОВ) и клеток крови пуповины человека (ККП). КОВ человека обладают способностью стимулировать регенерацию и миелинизацию поврежденных аксонов спинного мозга крысы и частично восстанавливать двигательную и чувствительную функции (Ramon-Cueto et al. 1998, Викторов и др. 2009). КОВ продуцируют комплекс нейротрофических факторов, белки внеклеточного матрикса и молекулы адгезии нервных клеток. Интерес к этим клеткам подкреплен возможностью аутотрансплантации, не приводящей к длительному нарушению обоняния. ККП активно изучаются в связи с их низкой иммуногенностью, доступностью, простотой и безопасностью получения, способностью выдерживать длительное хранение, возможностью использования аутологичного материала (Deng et al. 2010, Park et al. 2011, Han et al. 2013). Несмотря на значительное количество исследований с применением клеток данных типов для трансплантаций в спинной мозг, многие вопросы их поведения в ткани реципиента, а также влияние на конкретные события посттравматической дегенерации спинного мозга, остаются неясными.
Усилить терапевтический эффект трансплантированных клеток можно за счет
применения ключевых факторов, поддерживающих выживание и дифференцировку
нейральных клеток и регенераторный потенциал спинного мозга. Представляют интерес
сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), фактор роста фибробластов основной
(FGF2), поскольку эти факторы являются одновременно нейротрофическими и
ангиогенными. При травме спинного мозга доставка в область повреждения VEGF
стимулирует нейрогенез, выживание, миграцию нейронов и рост аксонов (Benton et al.
2009, Mackenzie et al. 2012), а FGF2 стимулирует рост аксонов и восстановление
двигательной функции (Moftah et al. 2008, Guzen et al. 2012, Goldshmit et al. 2012),
способствует дифференциации предшественников макроглии в зрелые клетки (Ohori et al.
2006, Yang et al. 2012). Результаты различных авторов указывают на синергизм действия
этих факторов в ангиогенезе in vitro и in vivo (Seghezzi et al. 1998, Laporte et al. 2011).
Помимо перечисленных выше, особый интерес представляет глиальный
нейротрофический фактор (GDNF). Имеются данные, что при травме спинного мозга GDNF стимулирует регенерацию аксонов и образование миелина (Zhang et al. 2009, Koelsch et al. 2010).
К недостаткам метода непосредственного введения пептидных факторов следует отнести необходимость применения больших доз, быстрое их расщепление эндогенными пептидазами, высокую иммуногенность, длительное присутствие in vivo минипомпы и др. В ходе клинических испытаний с системной доставкой нейротрофических факторов и факторов роста при различных заболеваниях были выявлены побочные эффекты и низкая
эффективность (Apfel et al. 2002). Эти осложнения стимулировали поиск других способов увеличения содержания в ткани-мишени стимуляторов регенерации. Из них наиболее эффективным представляется генная терапия. В генной терапии различают два подхода: генно-клеточную терапию (клеточно-опосредованная генная терапия), предполагающую применение в качестве носителей трансгенов генетически модифицированных стволовых клеток, обладающих способностью к длительной сверхэкспрессии эндогенных стимуляторов нейрорегнерации, и прямую генную терапию непосредственно инъекцией ДНК-содержащих векторов.
При генно-клеточной терапии важным критерием отбора клеток, предназначенных
для трансплантации, является возможность трансфекции терапевтическими генами с
высокой эффективностью их экспрессии в ткани спинного мозга реципиента. Кроме того
эффективность клеточно-опосредованного подхода зависит от выбора конкретного
терапевтического гена и типа трансфицируемых клеток, применяемых для
трансплантации.
Для стимулирования нейрорегенерации также активно исследуют эффективность
двух принципиально различных способов доставки терапевтических генов, не связанных с
клеточными носителями – это доставка трансгенов при помощи вирусных и невирусных
векторов. Одним из наиболее эффективных и безопасных носителей терапевтических
генов считается адено-ассоциированный вирус (Исламов 2007, Colella 2010). Вирусные
носители обладают высокой трансфекционной активностью, но не считаются полностью
безопасными из-за вероятности инсерционного мутагенеза, выраженного воспалительного
и иммунного ответов и токсичности. Среди других недостатков вирусных векторов –
отсутствие постоянной экспрессии (аденовирус), малый размер вставки трансгенной
конструкции (аденовирус, рекомбинантный адено-ассоциированный вирус),
кратковременная экспрессия трансгенов (герпесвирусы), трансдукция только делящихся клеток (ретровирусы), трудоемкость и дороговизна получения (Bleiziffer et al. 2007).
Альтернативой генной терапии при помощи вирусных векторов является применение плазмидных векторов, у которых, несмотря на более низкую, чем у вирусных векторов, трансфекционную активность, вышеупомянутые недостатки либо не проявляются совсем, либо проявляются в значительно меньшей мере. Основное преимущество использования плазмидных векторов заключается в том, что на основе промышленного вектора можно конструировать векторы с различным набором необходимых трансгенов, экспрессия которых осуществляется одновременно и независимо. Встроенные в плазмидные конструкции механизмы контроля репликации позволяют регулировать их экспрессионную активность.
Вопрос об оптимальном выборе терапевтических генов или их комбинаций и эффективных способах их доставки при травме спинного мозга остается не выясненным. В связи с вышесказанным, была сформулирована цель исследования и поставлены следующие задачи.
Цель исследования
Оценить и сопоставить эффективность посттравматической регенерации спинного мозга крысы в условиях прямой и опосредованной клетками крови пуповины человека доставки в область повреждения клонированных генов нейротрофических и ангиогенных факторов VEGF, FGF2 и GDNF и трансплантации немодифицированных клеток обонятельной выстилки человека и клеток крови пуповины человека.
Задачи исследования
1. Изучить эффекты немедленной однократной трансплантации в область травматического повреждения спинного мозга нативных клеток обонятельной выстилки человека и клеток крови пуповины человека, их способность к выживанию и миграционный потенциал.
2. Изучить эффекты немедленной однократной трансплантации в область
травматического повреждения клеток крови пуповины человека, трансфицированных
плазмидами pEGFP и pBud-VEGF-FGF2. Сравнить эффективность стимулирования
посттравматической регенерации спинного мозга крысы при трансплантации в зону
повреждения нативных и трансфицированных pBud-VEGF-FGF2 клеток крови пуповины.
3. На модели контузионной травмы спинного мозга крысы изучить эффективность
прямой генной терапии путем введения в область повреждения плазмиды и pBud-VEGF-
FGF2.
4. Оценить эффективность посттравматической регенерации при введении в
область контузионного повреждения спинного мозга крысы аденовирусного вектора AdV-
GDNF.
5. Изучить эффективность трансплантации в зону контузионного повреждения
спинного мозга крысы клеток крови пуповины человека, трансдуцированных AdV-GDNF.
6. Провести иммуногистохимический анализ с использованием маркеров
астроцитов S100В; и рецепторов тромбоцитарного фактора роста PDGFR и PDGFR,
глиального фибриллярного кислого белка GFAP; транскрипционного фактора Krox20;
белка периферического миелина P0; низкоаффинного рецептора фактора роста нервов
p75; маркера ядер клеток человека HNu; белка теплового шока HSP25; трансмембранного
белка аквапорина AQP4. С помощью специфических маркеров оценить количество и
фенотип шванновских клеток, мигрировавших в область повреждения, образование
миелина, активацию перицитов и астроцитов, выживаемость и пространственную
локализацию генно-модифицированных клеток крови пуповины человека, эффективность
экспрессии рекомбинантного гена VEGF.
7. Сравнить эффективность стимулирования посттравматической регенерации
спинного мозга при генной и генно-клеточной терапии по критериям восстановления
функции, сохранности ткани, величине патологических полостей, регенерации
миелиновых волокон.
Научная новизна
На модели контузионной травмы спинного мозга изучены эффекты немедленной однократной трансплантации в зону повреждения нативных КОВ и ККП, доказана их высокая выживаемость и способность мигрировать на значительное расстояние, положительное влияние на восстановление двигательной активности и сохранность ткани, рост количества миелиновых волокон и снижение степени кавитации.
На модели контузионной травмы спинного мозга впервые в одинаковых условиях эксперимента исследованы морфологические и гистохимические характеристики ткани спинного мозга в ходе генно-клеточной терапии с использованием нативных и модифицированных ККП человека. Тестирование в открытом поле (метод ВВВ) на всех этапах эксперимента позволило соотнести параметры восстановления двигательной активности со структурно-морфологическими изменениями ткани спинного мозга и количественно охарактеризовать терапевтическую эффективность различных вариантов доставки генов нейротрофических и ангиогенных факторов в область травмы.
Впервые для стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга применена трансплантация в зону травмы ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, экспрессирующей одновременно и независимо гены vegf и fgf2. Обосновывается выбор факторов VEGF, FGF2 и их сочетанного применения для терапии КТСМ. Одновременно на двух моделях – КТСМ и гемисекции – показано, что по сравнению с трансплантацией немодифицированных КОВ, трансплантация ККП человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, дает более высокие показатели сохранности ткани и ремиелинизации в очаге поражения и восстановления функции спинного мозга.
Впервые проведено сравнение прямого и ККП-опосредованного способов введения плазмиды pBud-VEGF-FGF2 по их влиянию на посттравматическую регенерацию спинного мозга крысы. Установлено, что непосредственная инъекция плазмидной ДНК мало уступает по эффективности доставке этих же терапевтических генов посредством ККП, а по некоторым показателям (восстановление двигательной активности, размеры патологических полостей) превосходит ее.
Впервые выявлены и сопоставлены гистоморфологические проявления
посттравматической регенерации, обусловленные применением плазмиды pBud-VEGF-
FGF2 непосредственно и в составе клеточных носителей. Установлено, что в результате
трансплантации немодифицированных КОВ, а также при прямом и ККП-опосредованном
введении плазмиды pBud-VEGF-FGF2 в зоне контузионного повреждения появляются
миелиновые волокна диаметром меньше 2 мкм с компактным миелином периферического
типа. Источником миелина служат мигрирующие шванновские клетки. Трансплантация
ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, оказывает более выраженное
поддерживающее влияние на популяцию шванновских клеток, мигрирующих в зону
повреждения, чем трансплантация немодифицированных ККП. Субпопуляции
шванновских клеток-мигрантов имеют фенотип P0+- и P0+/p75+ в белом веществе, S100В+/GFAP+/Krox20+ и GFAP+/Krox20+ в области вхождения задних корешков и HSP25+/GFAP+/Krox20+ в задних канатиках, то есть, мигрирующие клетки находятся на разных стадиях дифференцировки в зависимости от локализации. ККП-опосредованное введение генов ангиогенного фактора VEGF сопровождается увеличением числа PDGFR+ - периваскулярных клеток, отражающим усиление васкуляризации.
Впервые на модели контузионной травмы спинного мозга исследовано действие немедленной однократной трансплантации в зону повреждения вирусной генно-инженерной конструкции AdV-GDNF. Установлено, что терапевтический эффект от трансплантации AdV-GDNF посредством трансдуцированных ККП превышает эффект от прямой генной терапии.
Положения, выносимые на защиту
-
Доставка в область контузионной травмы спинного мозга крысы генов нейротрофических и ангиогенных факторов VEGF и FGF2 при помощи плазмидного вектора pBud-VEGF-FGF2, а также гена нейротрофического фактора GDNF при помощи вирусного вектора AdV-GDNF, сдерживает развитие дегенеративных изменений и стимулирует посттравматическую нейрорегенерацию.
-
Опосредованная клетками крови пуповины человека, трансфицированными плазмидой pBud-VEGF-FGF2, доставка терапевтических генов и непосредственное введение той же плазмиды (прямая генная терапия) в область травмы спинного мозга с различной степенью эффективности влияют на параметры нейрорегенерации (уменьшение образования патологических полостей, сохранность миелиновых волокон, серого и белого вещества и восстановление функции).
3. Доставка в область повреждения спинного мозга крысы гена нейротрофического
фактора GDNF при помощи клеток крови пуповины человека, трансдуцированных
аденовирусом AdV-GDNF, более эффективно стимулирует посттравматическую
регенерацию спинного мозга, чем инъекция в эту же область аденовируса с геном gdnf.
Теоретическая и практическая значимость
Полученные результаты о стимулирующем влиянии на процессы
нейрорегенерации прямой и опосредованной клетками крови пуповины доставки рекомбинантных генов vegf, fgf2 и gdnf доказывают возможность использования плазмидной конструкции pBud-VEGF-FGF2 и аденовирусного вектора AdV-GDNF для дальнейших исследований клеточно-молекулярных механизмов на доклиническом этапе, и последующих клинических испытаний.
Полученные свидетельства высокой эффективности прямой генной терапии трансгенами vegf и fgf2, мало уступающей по эффективности клеточно-опосредованной терапии с теми же генами, обуславливают необходимость совершенствования метода прямой доставки ДНК, не связанного с клеточными носителями.
Результаты исследования имеют значение для работ по усовершенствованию и последующему применению разработанных технологических платформ генетических конструкций в качестве инструмента для формирования на их основе других, более эффективных терапевтических средств, для лечения и реабилитации больных с различного рода травмами спинного мозга и другими нейродегенеративными заболеваниями.
Методология исследования
С применением электронной и световой микроскопии, иммуногистохимии изучены посттравматические реакции спинного мозга после травмы на тканевом, клеточном и молекулярном уровнях в условиях генной, клеточной и генно-клеточной терапии. На основе анализа функциональных показателей и морфологических характеристик сопоставлена эффективность трансгенов при различных способах их доставки в область травмы.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования включены в лекционный курс для студентов Казанского государственного медицинского университета “Регенеративная медицина”, элективные курсы “Молекулярная неврология” и “Нейропатология”.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на VI съезде анатомов гистологов и эмбриологов России (Саратов 2009), Всероссийском симпозиуме “Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии” (Санкт-Петербург 2010), VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010), 8-й Всероссийской научной конференции “Бабухинские чтения в Орле” (2011), V Российском симпозиуме “Белки и пептиды” (Петрозаводск 2011), Всероссийской научной конференции “Регенеративная биология и медицина” (Москва 2011), V Всероссийском симпозиуме с международным участием “Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии” (Уфа 2012), XI Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Самара 2012), ХХIV Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка 2012), III международной научно-практической конференции “Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине” (Казань 2012), Всероссийской конфренции с международным участием, посвященной 90-летию со дня рождения Д.С.Гордон (Чебоксары 2012).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 28 печатных работ, из них 15 статей в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК для защиты докторских диссертаций, 12 тезисов докладов на международных и всероссийских конференциях, симпозиумах, конгрессе, съезде. По результатам работы получено 2 патента: № 2459630 «Способ стимулирования нейрорегенерации с помощью
генетических конструкций», № 2521225 «Способ регенерации спинного мозга с помощью генетически модифицированных клеток крови пуповины человека».
Структура и объем диссертации
Молекулярные факторы контроля нейрорегенерации при травме спинного мозга
Геморрагия – скопление крови, излившейся в окружающие ткани в результате повреждения сосуда, при котором происходит сдавливание клеток, что вызывает повреждение и нарушение их функций. Ушиб спинного мозга сопровождается субарахноидальным, субдуральным и эпидуральным кровоизлияниями, приводящими к компрессии (Ishizaka et al. 2012, Papanagiotou et al. 2012, Vinay et al. 2011). Данные, полученные методом УЗИ с повышением контраста (CEU - contrast-enhanced ultrasonography) свидетельствуют, что после травмы происходит кровотечение в паренхиме спинного мозга, которое усиливается в течение первого часа (Soubeyrand et al. 2012). Наиболее сильно страдают от геморрагии клетки капиллярного эндотелия, нейроны и олигодендроциты. В настоящее время предполагают следующий механизм развития прогрессирующего геморрагического некроза (Simard et al. 2013). Нарушение целостности сосудов активирует NF-kappa B сигнальный каскад, запускающий экспрессию SUR1-управляемых неселективных Ca-АТФ канальных белков (SUR1 regulated NC Ca-ATP channel, SUR1 -сульфонилуриновый рецептор 1, составная часть Ca-АТФ канала наряду с белком TRPM4) в перечисленных выше типах клеток. При этом кислородное голодание и нехватка глюкозы в условиях локальной ишемии приводят к падению синтеза АТФ и резкому росту проводимости неселективных Ca-АТФ каналов, что имеет следствием разрушение (фрагментацию) капилляров, вторичные петехиальные кровоизлияния и некроз нейронов и олигодендроцитов уже за пределами эпицентра травмы (Gerzanich et al. 2009). В итоге лавинообразно развиваются окислительный стресс и воспаление, питающие прогрессирующий гемморагический некроз.
Выявление ключевого звена в развитии прогрессирующего геморрагического некроза позволило предложить новый терапевтический подход при травме спинного мозга. Искусственное подавление экспрессии NC Ca-АТР канальных белков блокированием SUR1 или TRPM4 с помощью фармакологических ингибиторов (глибенкламид) либо генной суппрессии (антисмысловой олигодеоксинуклеотид) дало обнадеживающие результаты. В опытах на клеточных культурах и in vivo на мышах и крысах показано резкое ослабление (до 50%) прогрессирующей вторичной геморрагии и геморрагического некроза, с чем связывают также значительное улучшение краткосрочной нейрологической функции (Simard et al. 2012, 2013).
Ишемия. Другим результатом разрушения сосудов при травме является ишемия – уменьшение кровоснабжения участка органа или ткани вследствие ослабления или прекращения притока к нему артериальной крови и уменьшение содержания в нем кислорода. Ишемия при травме спинного мозга первоначально возникает как следствие механического разрушения капилляров и в дальнейшем осложняется петехиальными кровоизлияниями, вазогенным отеком, эксайтотоксичностью и сокращением кровотока в зоне пенумбры вследствие спазма сосудов (Benton et al. 2009). В ответ на пролонгированную ишемию развивается патоангиогенный процесс, длящийся в течение нескольких дней или недель и приводящий к неоваскуляризации поврежденной спинномозговой ткани. Новообразованная сосудистая сеть проявляет ряд патологических признаков, включая пониженный транспорт глюкозы, увеличенную проницаемость гемато-энцефалического барьера, аномальный гликокаликсный фенотип и нарушения целостности плотных межклеточных контактов (tight-junctions) (Benton et al. 2009). В развитии подобного типа сосудистой патофизиологии, специфичной для травмы спинного мозга, как полагают, могут участвовать молекулы ряда вазоактивных соединений, включая фактор роста фибробластов основной (FGF2) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). На вовлеченность последнего указывали, ссылаясь на резкий рост уровня белка и соответствующей mРНК в тканях сразу после травмы (Bartholdi et al. 1997, Skld et al. 2000) с последующим снижением в течение двух недель до нормального уровня (Vaquero et al. 1999). Хотя временной профиль процесса внешне совпадал с развитием нарушений сосудистой пластичности и гематоэнцефалического барьера, однако, специальные исследования с применением антагонистов VEGF не выявили какого-либо влияния выключения эндогенного VEGF на характер и интенсивность неоваскуляризации и на тяжесть посттравматичеcких повреждений (Benton et al. 2009). Нарушение гемато-энцефалического барьера и микрососудистые изменения, ведущие к уменьшению снабжения кровью в спинном мозге, являются характерными признаками вторичного повреждения спинного мозга, ведущими к дальнейшему ухудшению состояния пациента.
Мезенхимные стволовые клетки
Фактор роста фибробластов (FGF2) - представитель ключевого семейства морфогенов, которые контролируют индукцию и спецификацию тканей в эмбриогенезе. Молекула является фактором роста, обладает выраженным нейротрофическим действием и рассматривается как обязательный компонент в средах для направленной дифференцировки нейральных клеток in vitro. В зрелом спинном мозге FGF2 участвует в пролиферации нейральных предшественников (Kojima et al. 2002, Martens et al. 2002, Meng et al. 2008, Lee et al. 2012). FGF2 рассматривается в качестве узловой молекулы в патофизиологии травмы спинного мозга. Показано, что в области повреждения спинного мозга количество FGF2+-клеток возрастает в 15 раз (Xu et al. 2006). Введение FGF2 в комбинации с трансплантацией стволовых мезенхимных клеток человека улучшает функциональные показатели регенерации спинного мозга (Kim et al. 2006). Введение FGF2 в область травмы спинного мозга существенно уменьшает объм патологических полостей и способствует сохранности белого вещества (Jimenez Hamann et al. 2005).
FGF2 индуцирует фосфорилирование молекулы EphrinB (Brckner et al. 1997; Chong et al. 2000), представителя семейства эфринов, контролирующих направленный рост аксонов в развивающемся и регенерирующем спинном мозге, с последующей активацией ГТФазы Rho и перестройкой цитоскелета в аксоне. С другой стороны, при травме спинного мозга FGF2 усиливает экспрессию молекулы адгезии CHL1, близкого гомолога молекулы адгезии L1 из суперсемейства иммуноглобулинов. CHL1 поддерживает выживание нейронов и аксоногенез, а также экспрессию GFAP в астроцитах (Jakovcevski et al. 2007), но сдерживает прорастание нервных волокон через глиальный рубец при травме спинного мозга.
FGF2 вырабатывается также шванновскими клетками, экспрессия которого в них возрастает при повреждении периферических нервных структур (Santos-Silva et al. 2007, Doubles et al., 2008). Влияние этого фактора на поведение мигрирующих в спинной мозг шванновских клеток практически не изучено. В этом отношении известно, что в спинном мозге молекулы FGF2 контролируют взаимодействие шванновских клеток с астроцитами (Santos-Silva et al. 2007). При контактном взаимодействии с астроцитами, опосредуемом пока неизвестным сигналом, шванновские клетки секретируют гепарансульфат протеогликаны, которые активируют молекулы FGF2, продуцируемые и секретируемые глиальными клетками. Активированные молекулы FGF2, взаимодействуя с рецепторами на поверхности астроцитов, служат сигналами для модуляции фенотипа этой разновидности глиальных клеток, что проявляется в их пролиферации (астроцитозе), формировании барьера для регенерирующих аксонов и мигрирующих клеток, увеличении экспрессии GFAP и хондроитинсульфат протеогликана, основного компонента глиального рубца. Таким образом, при травме спинного мозга FGF2 может оказывать позитивное и негативное влияние на процесс нейрорегенерации. FGF2 поддерживает дифференцировку стволовых нейральных клеток в совместной культуре с амниотическими клетками. Трансплантация при травме спинного мозга крысы амниотических клеток, трансфицированых геном FGF2, способствует выживанию и нейральной дифференцировке одновременно трансплантируемых стволовых нейральных клеток, а также поддерживает выживание собственных нейронов в травмированном спинном мозге реципиента (Meng et al. 2008). Системное введение FGF2 мышам с контузионной травмой спинного мозга усиливало цитогенез олигодендроцитов и увеличивало количество NG2+-клеток (Lytle et al. 2009, Nishiyama et al. 2009), которые рассматриваются в качестве предшественников олигоденлроглии и астроцитов серого вещества (Zhu et al. 2008, Kucharova et al. 2010).
В интервале между 7 и 28 сутками после травмы спинного мозга на границе области повреждения с нормальной тканью значительно возрастает количество FGF2+-клеток (Tripathi et al. 2008). Эти клетки присутствуют в зоне повышенной пролиферации предшественников олигодендроцитов, что указывает на важную роль FGF2 в глиогенезе, опосредованном повреждением, поддержании миелинобразующих клеток и стимулирования процесса ремиелинизации.
Подкожное введение FGF2 крысам с повреждением двигательной коры способствует реконструкции нервных связей и восстановлению функции (Monfils et al. 2008).
Выбранный в качестве терапевтического гена gdnf продуцируется астроцитами и шванновскими клетками, является мощным фактором поддержания жизнеспособности нейронов, стимулирует рост аксонов, их миелинизацию, уменьшает апоптоз и дегенерацию ткани (Cheng et al. 2002, Mills et al. 2007, Allen et al. 2013). Мишенью действия GDNF являются допаминэргические и мотонейроны, как в периферической, так и центральной нервной системе. Применение GDNF способствует спраутингу и коллатеральной организации как поврежденных, так и уцелевших аксонов, с чем связывают улучшение двигательных функций. Именно поэтому с данным нейротрофическим фактором связывают перспективы лечения неврологических расстройств. Осложняющим обстоятельством является то, что как и другие нейротрофические факторы GDNF не может применяться системно, поскольку не проникает через гематоэнцефалический барьер, что требует либо непосредственного введения в мозг, либо разработки специальных средств доставки, таких как вирусные вектора, клеточные или искусственные трансплантанты, способные к непрерывной секреции фактора.
Значение молекул адгезии в процессе регенерации в центральной и периферической нервной системе детально рассмотрено в обзоре (Lavdas et al. 2011) и обсуждено в контексте их потенциального приложения к неврологической патологии. Применительно к травме спинного мозга наиболее изучена молекула адгезии клеток L1. Многочисленными работами установлено, что эта молекула контролирует удлинение аксона, пластичность синапсов в процессах обучения и памяти, миграцию нейральных клеток и их выживание, поддерживает миелинизацию в центральной и периферической нервной системе и способствует ремиелинизации в спинном мозге после травматического повреждения. Внеклеточный домен этой молекулы стимулирует восстановление двигательной функции в эксперименте при травме спинного мозга, а трансплантация эмбриональных стволовых клеток, сверхэкспрессирующих молекулу адгезии L1, поддерживает рост аксонов кортикоспинального тракта и выживание клеток (Chen et al. 2007).
Как следует из изложенного выше, в настоящее время известно многое о специфике влияния различных нейротрофических факторов на регенерацию пораженного спинного мозга. В то же время, результаты исследований последних лет показывают, что в ряде случаев, применяя сразу несколько факторов роста, удавалось добиться существенного повышения показателей регенерации по сравнению с раздельным их применением (Chen et al. 2010, Allen et al. 2013). Актуальной задачей, таким образом, становится исследование комбинаций различных стимуляторов регенерации для достижения синергетического эффекта.
Клетки крови пуповины человека
В каудальном направлении от эпицентра травмы наблюдается та же тенденция, но разница в количестве миелиновых волокон между опытом и контролем меньше, чем в ростральном (Рис. 32). Сохранившиеся волокна в контроле имеют характерное расслоение миелина и разрушенные осевые цилиндры (Рис. 34). В опыте с трансплантацией ККП оболочка выглядит более плотной (Рис.35).
Характеристика миграционных качеств, витальности и способности трансплантируемых стволовых клеток к поддержанию экспрессии плазмидных генов является необходимой основой для последующей оценки результатов применения этих клеток как носителей терапевтических генов. По способности к миграции трансплантированных в спинной мозг КОВ наши данные близки результатам исследования, полученным на модели бокового амиотрофического склероза у трансгенных по супероксиддисмутазе SOD1(G93A) крыс при трансплантации КОВ в область дорсальных канатиков (Li et al. 2011). Авторы этой работы показали возможность миграции трансплантированных КОВ в спинном мозге реципиента на расстояние 4,2 мм при их выживании в течение более 4 недель. При этом зарегистрировано существенное снижение гибели мотонейронов и стимулирование процесса ремиелинизации. Область повреждения при травме спинного мозга достаточно обширна, поэтому миграционный потенциал трансплантируемых клеток представляется крайне важным для нейрорегенерации. Он особенно значим для сдерживания процесса дегенерации миелиновых волокон и для стимулирования их ремиелинизации на всем протяжении области деструкции, начиная от эпицентра травмы и заканчивая зоной сохраненной ткани с интактными волокнами. В наших экспериментах появление трансплантированных в спинной мозг КОВ на значительном удалении от места инъекции может быть отчасти также связано с их пассивным перемещением вследствие развития отека и напряжения ткани в области травматического повреждения. В отношении
КОВ при их трансплантации в спинной мозг допускается возможность подобного неактивного перемещения (Andrews et al. 2007). Весьма значимым представляются выявленные нами миграционные возможности ККП. Миграционный потенциал ККП, изученный нами в области контузионного повреждения спинного мозга, превышает или находится на уровне типированных гемопоэтических и нейральных стволовых клеток в аналогичных экспериментах (Han et al. 2004, Khalatbary et al. 2007). ККП, трансплантированные в область повреждения, сохраняют жизнеспособность до 30 суток и способны мигрировать на расстояние до 10 мм от места трансплантации в ростральном и каудальном направлении. С учетом того, что в наших экспериментах иммуносупрессия не применялась, а клетки трансплантировали сразу в момент травмы, а не после прохождения пика цитостатического действия провоспалительных цитокинов и клеточных иммунных реакций, отмеченная выше достаточно длительная экспрессия EGFP свидетельствует не только о высокой жизнеспособности трансплантирумых клеток, но и о потенциальной возможности пролонгированной экспрессии терапевтических генов. В целом, ККП и КОВ следует признать сопоставимыми в качестве потенциальных носителей терапевтических генов.
Параметризация двигательной активности позволяет в целом количественно оценить степень восстановления неврологических функций спинного мозга после повреждения. Как показывают литературные источники, восстановление движений может обусловливаться отнюдь не только собственно регенерацией поврежденных клеток спинного мозга, но в значительной мере отражать компенсаторные перестройки уцелевших и вновь сформированных аксональных отростков (Шевелев и др. 2000, Maier et al. 2006, Darian-Smith et al. 2009). Учет двигательной активности представляется совершенно необходимым для сравнительной оценки способов восстановительной терапии. Так, контрольные группы (с введением среды Хенкса и DPBS) в наших экспериментах показали к 30-му дню весьма 126 умеренные приросты показателя «ВВВ» на уровне 2,5-3,3 балла, отражающие процесс спонтанного восстановления. В то же время в опытных группах с трансплантацией КОВ и ККП средний прирост был почти вдвое больше контрольного, что однозначно свидетельствует о терапевтической действенности трансплантации нативных стволовых клеток. Сравнительно с КОВ, ККП показали достоверно в полтора раза более высокий относительный прирост, что делает терапию на их основе предпочтительной.
Можно предполагать, что сравнение по качеству и интенсивности посттравматических реакций в ткани спинного мозга между контролем и опытом позволит выявить морфологические изменения, обусловленные специфическим влиянием трансплантируемых клеток, одновременно сопоставив их с положительной динамикой восстановления функции.
Влияние трансплантации ККП на посттравматическую регенерацию спинного мозга крысы
Данные иммуногистохимии. На 30 сутки после КТСМ в группах животных ККП+pBud-VEGF-FGF2 и pBud-VEGF-FGF2 на расстоянии до 2 см в ростральном и каудальном направлениях от эпицентра повреждения обнаружены клетки, экспрессирующие специфические маркеры шванновских клеток (Рис. 70). Их количество и распределение в белом и сером веществе существенно различается в этих опытных группах от контрольной (КТСМ). При помощи непрямого иммунопероксидазного метода с выявлением Krox20 обнаружено увеличение количества Krox20+-клеток во всех зонах морфометрии белого вещества на расстоянии 1 см в ростральном и каудальном направлении от эпицентра повреждения в обеих опытных группах по сравнению с контрольной (КТСМ) соответственно на 61% и 50%.
К 30-м суткам после нанесения травмы во всех 3-х исследуемых группах в белом и сером веществе обнаружены клетки, одновременно экспрессирующие белки S100, GFAP и Krox20 (S100+/GFAP+/Krox20+-клетки). Для контрольной группы в области вхождения задних корешков характерно: отсутствие S100+-клеток и Krox20+-клеток, преимущественно наличие GFAP+-клеток, небольшое скопление GFAP+/Krox20+-клеток и единичные S100+/GFAP+/Krox20+-клетки.
Для обеих опытных групп в указанной области серого вещества характерно: наличие S100+-клеток и единичных Krox20+-клеток, присутствие GFAP+-клеток, GFAP+/Krox20+-клеток и S100+/GFAP+/Krox20+-клеток. При этом в случае доставки генов нейротрофических факторов vegf и fgf2 на клеточных носителях (ККП+pBud-VEGF-FGF2) по сравнению с прямым введением плазмиды с терапевтическими генами (pBud-VEGF-FGF2) популяция S100+/GFAP+/Krox20+-клеток представляется наибольшей. В указанной области вхождения задних корешков в 1 опытной группе (ККП+pBud-VEGF-FGF2) особенно выражена популяция GFAP+/Krox20+-клеток, являющаяся также самой многочисленной.
Спинной мозг крысы. Экспрессия S100, GFAP и Krox20 в области вхождения задних корешков на расстоянии 1 см каудальнее эпицентра травмы: А, Г, Ж, К – контрольная группа животных; Б, Д, З, Л – 1 опытная группа с ведением ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2; В, Е, И, М – 2 опытная группа с ведением плазмиды pBud-VEGF-FGF2; К, Л, М – объединение панелей по всем трем маркерам (Merge). Конфокальная микроскопия. Увеличение 40х10
172 Для 2 опытной группы (pBud-VEGF-FGF2) в области вхождения задних корешков характерно наличие большего количества S100+-клеток (Рис. 70 (В)) и GFAP+-клеток (Рис. 70 (Е)). В белом и сером веществе для всех экспериментальных групп характерно наличие единичных S100+-клеток округлой формы. Отмечены различия в имеющихся размерах тел и отростков S100+/GFAP+/Krox20+-клеток в белом и сером веществах, характерные для опытных и контрольной групп. Так, размер шванновских клеток, одновременно экспрессирующих белки S100, GFAP и транскрипционный фактор Krox20, в зонах белого вещества в 2 раза больше, чем в сером веществе и задних канатиках.
К 30 суткам эксперимента количество S100+-клеток в наружных зонах белого вещества на расстоянии 1,5 см от эпицентра травмы в условиях прямой доставки генов возрастает на 46% (р 0,05) (Рис. 71). При введении клеток крови пуповины, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, этот показатель увеличивается на 55% (р 0,05).
При тройном иммунофлуоресцентом окрашивании с помощью антител против HSP25, GFAP и Krox20 в белом веществе выявлены клетки, экспрессирующие все три указанных маркера (HSP25+/GFAP+/Krox20+-клетки). В сером веществе и в области вхождения задних корешков данные клетки не обнаружены. Наибольшее количество HSP25+/GFAP+/Krox20+-клеток в области задних канатиков характерно для 1 опытной группы с доставкой генов vegf и fgf2 на клеточных носителях. Для 2 опытной группы с прямой доставкой плазмиды с теми же генами этот показатель снижен в 2 раза. В контрольной группе HSP25/GFAP/Krox20+-клетки в области задних канатиков отсутствуют, наблюдаются лишь единичные GFAP+/Krox20+-клетки и большое количество GFAP+-клеток. HSP25+-клетки в области вхождения задних корешков обнаружены лишь в 1 опытной группе (ККП+pBud-VEGF-FGF2).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что доставка генов vegf и fgf2 приводит к увеличению количества эндогенных шванновских клеток в области повреждения спинного мозга. Данный феномен можно объяснить либо увеличением срока выживания эндогенных шванновских клеток, либо повышением их способности к миграции в область повреждения и пролиферации. Эти данные согласуются с показанной ранее возможностью плазмиды с геном сосудистого эндотелиального фактора роста (vegf) усиливать пролиферацию шванновских клеток, увеличивать экспрессию в них белка vegf, тем самым улучшая способность к регенерации аксонов (Haninec et al. 2012). Способность усиливать пролиферацию шванновских
Транскрипционный фактор Krox20 является надежным маркером миелинобразующих шванновских клеток и также экспрессируется клетками пограничной шапочки, которые активно мигрируют в область повреждения, где дифференцируются в шванновские клетки (Shen et al. 2005). Начало экспрессии Krox20 приурочено к стадии перехода предшественников в зрелые клетки (Topilko et al. 1994). Наличие белка S100 специфично как для астроцитарной глии, так и для незрелых шванновских клеток. Ранее GFAP считался высоко специфичным только для зрелых астроцитов, но исследования последних лет показали экспрессию данного белка в миелиннеобразующих шванновских клетках (Wang et al. 2010). Обнаружение S100+/GFAP+/Krox20+-клеток в нашем исследовании может свидетельствовать о наличии мигрирующих в спинной мозг шванновских клетках на стадии неполной дифференцировки в миелинобразующий клеточный тип.
