Введение к работе
Актуальность темы. Иммунотерапия онкологических заболеваний привлекает внимание специалистов в особенности с развитием методов, основанных на использовании молекулярных шаперонов, в частности белка теплового шока Hsp70. Данные, полученные к настоящему времени, указывают на то, что Hsp70 способен активировать адаптивный и врождённый иммунный ответ организма [1]. В частности было установлено, что находящийся на поверхности раковых клеток Hsp70 вызывает активацию цитолитической функции NK-клеток, тем самым указывая на участие белка в стимуляции системы врожденного иммунитета [2]. Аутологичный опухолевый Hsp70, возможно благодаря своей шаперонной активности, способен доставлять опухолевые пептиды в антиген-презентирующие клетки (АПК), и в результате последующей презентации антигенов в комплексе с молекулами MHC I и II классов Т-клеткам формируется генерализованный специфический противоопухолевый ответ [3,4]. Эти открытия привели к появлению десятков конструкций противоопухолевых вакцин на базе молекулярных шаперонов, часть которых находится на разных фазах клинических испытаний [5-7]. Среди подобных технологий обращают на себя внимание способы иммунотерапии с помощью препаратов очищенного Hsp70, доставляемого непосредственно в опухоль. Так, внутриопухолевое введение препарата Hsp70 в комплексе с магнитными наночастицами с последующей локальной гипертермией приводило к задержке прогрессии меланомы [8]. В другом исследовании сочетание рекомбинантного Hsp70 с ДНК-плазмидой, блокирующей иммуносупрессорные молекулы B7-H1 на поверхности клеток меланомы, также приводило к замедлению роста опухоли in vivo [9]. Отчасти описанные эффекты объясняются способностью шаперона активировать созревание АПК, продукцию ряда провоспалительных цитокинов (TNF-a, GM-CSF и другие), а также стимулировать цитолитическую и миграционную активность NK-клеток [10-12]. Однако механизмы запуска как врожденного, так и приобретенного противоопухолевого иммунитета введенным в опухоль или культуру раковых клеток шапероном пока остаются не ясными. Таким образом, учитывая актуальность исследований противоопухолевых эффектов шаперона Hsp70, необходимы работы, как по пониманию механизмов этих эффектов, так и по анализу последних на животных моделях различных онкологических патологий.
Цель исследования. Целью работы было изучение влияния иммуномодулирующих противоопухолевых свойств рекомбинантного белка теплового шока Hsp70 человека на раковые клетки in vitro с последующей оценкой таких эффектов in vivo в модели интракраниальной глиомы С6 крыс. Цель отдельной части работы состояла в оценке возможности использования препарата очищенного рекомбинантного белка теплового шока Hsp70 в качестве адьювантной противоопухолевой терапии у больных злокачественными опухолями головного мозга.
Задачи исследования. (1) Изучение механизма взаимодействия экзогенного Hsp70 с опухолевыми клеточными линиями различного происхождения (глиома крысы С6, меланома мыши В16, клетки эритроидной лейкемии человека К562) и влияния внутриклеточного транспорта на цитотоксическую активность лимфоцитов. (2) Оценка терапевтической эффективности однократного либо непрерывного внутриопухолевого введения Hsp70 in vivo на модели интракраниальной глиомы С6 у крыс. (3) Изучение иммуномодулирующего влияния Hsp70 на развитие противоопухолевого ответа и мониторинг параметров врожденного и адаптивного иммунного ответа в динамике на модели глиомы С6. (4) Оценка возможности применения препарата очищенного рекомбинатного белка теплового шока Hsp70 в адьювантной терапии злокачественных образований головного мозга в серии ограниченных клинических исследований. Научная новизна работы. Впервые был продемонстрирован возможный механизм противоопухолевого эффекта экзогенного Hsp70 на примере раковых клеток разного происхождения. Был обнаружен феномен транслокации внутриклеточного Hsp70 на поверхность опухолевых клеток под влиянием экзогенного шаперона, что, в свою очередь, приводило к повышению чувствительности клеток к цитолитической активности NK-клеток иммунной системы. Цитотоксическая активность естественных киллеров различалась в зависимости от типа раковых клеток-мишеней, концентрации вносимого в клеточную среду очищенного Hsp70 и продолжительности инкубации клеток с экзогенным белком. Результаты этих экспериментов позволили предложить оригинальную концепцию механизма действия белка Hsp70 в активации противоопухолевого ответа.
В ходе экспериментов in vivo на модели внутричерепной опухоли у крыс мы впервые доказали терапевтическую эффективность локальной, внутриопухолевой доставки препарата белка теплового шока Hsp70. Установлено, что внутриопухолевое введение шаперона Hsp70 приводит к задержке прогрессии опухоли и, как следствие этого, к увеличению продолжительности жизни животных. Причинами этого эффекта по нашим данным была последовательная активация врождённого и адаптивного иммунного ответа организма, индуцированная внутриопухолевым введением шаперона.
Впервые проведены ограниченные клинические исследования возможности локальной аппликации шаперона Hsp70 у нейроонкологических больных. Установлено, что препарат обладает приемлемым уровнем токсичности и безопасен к применению у больных со злокачественными новообразованиями головного мозга.
Личный вклад автора. Все экспериментальные процедуры и обработка результатов выполнены автором лично. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научными руководителями.
Теоретическое и практическое значение работы. Обнаруженное явление активации белком Hsp70 клеток иммунной системы за счет транслокации собственного, внутриклеточного шаперона на поверхность раковых клеток, с одной стороны, является научным обоснованием противоопухолевого действия Hsp70, а с другой - делает возможным применение препарата белка в качестве средства монотерапии либо в комбинации с другими методами в клинической онкологии.
Работа по анализу эффективности технологии с использованием Hsp70 уже начата, и её предварительные результаты указывают на безвредность очищенного Hsp70 для лабораторных животных. Следует отметить, что в Институте цитологии РАН в кооперации с ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России начата работа по подготовке препарата Hsp70 к госрегистрации как лекарственного средства, а также проводится разработка технического задания на доклинические испытания препарата. В техническое задание внесены данные, представленные в диссертации, и это также указывает на высокую практическую значимость выполненной диссертационной работы.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Шестнадцатом международном европейском междисциплинарном онкологическом конгрессе (Швеция, 2011); на Британском нейроонкологическом конгрессе (Великобритания, 2011); на Международном конгрессе педиатрической нейро-онкологии (США, 2011); на Девятом съезде общества европейской ассоциации нейро-онкологии (Румыния, 2011); на VI и VII Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых учёных (Москва, 2011, 2012); на X и XI Всероссийской научно-практической конференции «Поленовские чтения» (Санкт- Петербург, 2011, 2012).
По материалам диссертации опубликовано 26 работ, в том числе 6 в рецензируемых научных журналах из перечня изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.
Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах
машинописного текста и включает введение, обзор литературы, методы, результаты, обсуждение и выводы. Материал иллюстрирован ___ рисунками и ___ таблицами. Библиографический указатель содержит источников.
Похожие диссертации на Иммуномодулирующие свойства рекомбинантного белка теплового шока Hsp70 в терапии опухолей головного мозга
