Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 10
2.1 Общие принципы строения и функции печени 10
2.2 Морфо-функциональные изменения в печени при хронических гепатитах и циррозе различной этиологии 14
2.3 Гепатотоксическое действие четыреххлористого углерода (СС14) и этанола 16
2.4 Регенерация печени. Роль клеточного дыхания 19
2.5 Дыхательная цепь митохондрий. Структура и функция 20
2.6 Состояние дыхательной цени при патологии печени 35
2.7 Возможные места образования супероксидного аниона в дыхательной цепи митохондрий 40
2.8 Антиоксидантная система митохондрий гепатоцитов 41
Материалы и методы 45
3.1 Экспериментальные животные и моделирование токсического гепатита 45
3.2 Приготовление гистологических срезов печени 45
3.3 Получение изолированных гепатоцитов и их культивирование 45
3.4 Окраска изолированных гепатоцитов родамином 123 46
3.5 Выделение митохондрий из гепатоцитов 47
3.6 Выделение субмитохондриальных частиц из митохондрий 47
3.7 Оценка функционального состояния дыхательной цепи митохондрий 48
3.7.1 Применение полярографического метода измерения скорости потребления кислорода изолированными гепатоцитами и митохондриями 48
3.7.2 Параметры оценки функционального состояния дыхательной цепи митохондрий 50
3.7.3 Определение активности цитохром с оксидазы 51
3.7.4 Определение адениловых нуклеотидов 51
3.8 Измерение скорости продукции супероксидного аниона 52
3.9 Определение параметров перекисного окисления липидов в печени 53
3.9.1 Измерение диеновых конъюгатов 53
3.9.2 Измерение Шиффовых оснований 53
3.10 Определение уровня триглицеридов 54
3.11 Измерение сухой массы изолированных гепатоцитов 54
3.12 Оценка антиоксидантного статуса митохондрий 55
3.12.1 Определение активности митохондриальной супероксиддисмутазы 55
3.12.2 Определение активности митохондриальной глутатионпероксидазы 55
3.12.3 Определение окисленного и восстановленного митохондриального глутатиона 56
3.13 Статистическая обработка полученных данных 56
4. Результаты 57
4.1 Экспериментальный токсический гепатит 57
4.1.1 Гистологическая характеристика печени 57
4.1.2 Морфология изолированных гепатоцитов 57
4.1.3 Морфология митохондрий, окрашенных родамином 123 61
4.1.4 Уровень триглицеридов в печени 63
4.1.5 Сухая масса изолированных гепатоцитов 63
4.2 Активность процессов перекисного окисления липидов в печени крыс при экспериментальном токсическом гепатите 64
4.3 Отработка условий измерения скорости дыхания изолированных гепатоцитов с помощью полярографического метода 65
4.4 Оценка скорости дыхания изолированных гепатоцитов при экспериментальном токсическом гепатите 69
4.5 Оценка скорости дыхания изолированных митохондрий при экспериментальном токсическом гепатите 70
4.6 Активность цитохром с оксидазы 74
4.7 Продукция супероксидного аниона субмитохондриальными частицами гепатоцитов при экспериментальном токсическом гепатите 75
4.8 Анализ антиоксидантной системы митохондрий при экспериментальном токсическом гепатите. Активности супероксиддисмутазы и глутатион-пероксидазы, концентрации окисленного и восстановленного глутатиона 77
4.9 Содержание адениловых нуклеотидов в печени (АМФ, АДФ, АТФ) 79
Обсуждение 80
Выводы 93
Список литературы
- Морфо-функциональные изменения в печени при хронических гепатитах и циррозе различной этиологии
- Приготовление гистологических срезов печени
- Определение активности цитохром с оксидазы
- Морфология митохондрий, окрашенных родамином
Введение к работе
Заболевания печени занимают одно из ведущих мест по летальности среди населения (Рябинин, 2002). К наиболее тяжелым из них относятся гепатиты различной этиологии и алкогольное поражение печени, вследствие которых зачастую развивается цирроз. Развитие токсического гепатита сопровождается активацией, как процесса дегенерации, так и процесса регенерации печени и соотношение этих процессов оказывает решающее влияние на исход заболевания. Успех регенерации зависит от того, насколько эффективен энергетический метаболизм гепатоцитов, который целиком определяется состоянием дыхательной цепи митохондрий.
Дыхательная цепь представляет собой сложную
мультикомпонентную структуру, состоящую из пяти комплексов, локализованных во внутренней мембране митохондрий: НАДН-CoQ-оксидоредуктаза (комплекс I), сукцинат-СоС>-оксидоредуктаза (комплекс II), CoQ-цитохромС-оксидоредуктаза (комплекс III), цитохром с оксидаза (комплекс IV) и АТФ-синтазы. Непосредственный синтез АТФ осуществляет АТФ-синтаза, локализованная во внутренней мембране митохондрий в непосредственной близости к электрон-транспортной цепи (Nicholls, Ferguson, 2002; Rubinstein et al., 2003).
Сведения о состоянии дыхательной цепи при токсическом гепатите весьма противоречивы и недостаточны. Так, некоторые авторы утверждают, что компоненты дыхательной цепи при патологии печени серьезно повреждаются, следствием чего является снижение синтеза АТФ (Krahenbiihl et al, 1989; Nozu et al., 1992; Hwang, Ismail-Beigi, 2003). Однако детальные исследования механизмов этих нарушений не проведены. Другие авторы считают, что компоненты дыхательной цепи не повреждаются, но могут изменять свою функциональную активность (Cederbaum et al., 1974; Bottenus et al., 1982; Yang et al., 2004). Важно
подчеркнуть также, что обычно состояние дыхательной цепи митохондрий изучают в рамках уже сложившейся патологии печени, используя модели с длительными сроками отравления животных, когда компенсаторные механизмы в клетке практически истощены и преобладают процессы деградации.
Таким образом, изучение состояния дыхательной цепи при токсическом гепатите является актуальной проблемой. Вместе с тем на наш взгляд важно изучить состояние дыхательной цепи митохондрий в ранний период развития патологии, когда компенсаторные механизмы клетки активированы в ответ на повреждающее воздействие токсических веществ. Такие данные могут помочь в разработке адекватной тактики лечения токсического гепатита.
Патологические процессы, развивающиеся в печени при токсическом гепатите, как вследствие непосредственного воздействия токсинов, так и в результате нарушения механизма их детоксикации, приводят к окислительному стрессу (Noyan et al., 2006; Esrefoglu et al., 2007; Raja et al., 2007). Окислительный стресс приводит к повышению внутриклеточной генерации активных форм кислорода (АФК) и окислительному повреждению молекулярных компонентов клетки (Андреев и др., 2005; Avasarala et al., 2006; Wang, Cederbaum, 2006).
Митохондрии концентрируют в себе большую часть окислительных метаболических путей и содержат многочисленные редокс-переносчики и сайты, потенциально способные к одноэлектронному восстановлению кислорода до супероксидного аниона - предшественника других АФК (Андреев и др., 2005; Cadenas et al., 1977; Lenaz, 2001). В дыхательной цепи митохондрий в норме роль основных генераторов супероксидного аниона отводят комплексам I (Cadenas et al., 1977; Lenaz, 2001) и III (Boveris, Chance, 1973; Turrens, Boveris, 1980). В комплексе I генерацию супероксидного аниона предположительно связывают с железосерными кластерами и семихиноном (Андреев и др., 2005; Herrero,
Barja, 2000). Существует предположение, что источником супероксидного аниона в комплексе III является нестабильный радикал семихинона (Q ~) в центре Qp (Rich, Bonner, 1978), хотя существование этого семихинона до сих пор не продемонстрировано (Turrens, 2003). В гепатоцитах нормальной печени интенсивность продукции супероксидного аниона ничтожно мала. Так, митохондрии в состоянии 4 (V4) по Чансу продуцируют 0.6-1 нмоль НгСЬ за 1 мин, на 1 мг белка, что составляет примерно 2 % от всего потребляемого ими кислорода (Liu, 1997). Вырабатываемый при этом супероксид анион может быть вовлечен в регуляцию клеточного метаболизма или элиминирован митохондриальной супероксиддисмутазой (Мп-СОД) (Liu, 1997; Turrens, 1997). При патологиях печени уровень продукции АФК в митохондриях гепатоцитов значительно возрастает (Андреев и др., 2005; Yang et al., 2004), однако механизм усиления продукции супероксидного аниона в дыхательной цепи митохондрий практически не изучен.
Исходя из вышесказанного, цель настоящей работы состояла в исследовании состояния дыхательной цепи митохондрий гепатоцитов крыс с экспериментальным токсическим гепатитом, вызванным комбинированным воздействием этанола и ССЦ- В рамках цели исследования были сформулированы следующие задачи:
получить гистологическую и биохимическую характеристики печени крыс, подвергавшихся комбинированному воздействию этанола и CCU в течение 1-го месяца;
провести ингибиторный анализ скорости дыхания изолированных гепатоцитов и митохондрий крыс с токсическим гепатитом;
исследовать продукцию супероксидного аниона различными комплексами дыхательной цепи митохондрий крыс с токсическим гепатитом;
изучить состояние антиоксидантной системы митохондрий гепатоцитов крыс с токсическим гепатитом;
5) исследовать энергообразующую функцию печени крыс с
токсическим гепатитом.
Морфо-функциональные изменения в печени при хронических гепатитах и циррозе различной этиологии
Регенерация печени - физиологический процесс, который включает комплекс компенсаторных механизмов, активизирующихся под действием повреждающих факторов. От полноты и скорости регенерации зависит восстановление и поддержание функций пораженной печени. Репаративная регенерация патологически измененной печени, направленная на восстановление стромально-паренхиматозных отношений в пользу увеличения объема функционирующей паренхимы, протекает по типу так называемой регенерационной гипертрофии. Поскольку развитие хронического гепатита сопровождается избыточным образованием коллагена, внутриклеточная и внеклеточная резорбция последнего является необходимым условием успешной регенерации. Резорбция избыточного количества коллагена позволяет восстановить оптимальные стромально-паренхиматозные отношения, адекватное кровоснабжение и функциональную состоятельность органа (Wu, Danielsson, 1995; Gressner, Schuppan, 1999).
Полноценность регенерационных процессов при токсическом гепатите в значительной мере определяется интенсивностью энергетического метаболизма в печени. В гепатоцитах аэробный способ получения энергии, связанный с окислительно-восстановительными процессами в митохондриях, значительно преобладает над анаэробным (гликолитическим) (Бреслер и др., 1969). Значение митохондрий в обеспечении гепатоцитов АТФ возрастает при регенерации печени и сохраняется в условиях патологии (Yang et al., 2004).
Митохондрии называют «энергетическими станциями» клетки, поскольку именно в этих органеллах в основном происходит образование энергии, поставляемой окислительными процессами. Митохондриальную систему сопряжения окислительных процессов с образованием высокоэнергетического промежуточного соединения АТФ называют окислительным фосфорилированием (Марри и др., 1993; Албертс и др., 1994).
Вся полезная энергия, высвобождаемая в процессе окисления жирных кислот и аминокислот, и почти вся энергия окисления углеводов используется в митохондриях в форме восстановительных эквивалентов (ЕҐ и электронов). Митохондрии содержат ряд катализаторов, образующих единую дыхательную цепь. Они обеспечивают улавливание и перенос восстановительных эквивалентов, направляя их на реакцию с кислородом, которая приводит к образованию воды. Одновременно функционирует механизм улавливания потенциальной энергии с накоплением ее в форме высокоэнергетических фосфатов (АТФ).
Перенос электронов от окисляемых субстратов к кислороду происходит в несколько этапов. В нём участвует большое количество промежуточных переносчиков, каждый из которых способен присоединять электроны от предыдущего компонента и передавать следующему, образуя цепь окислительно-восстановительных реакций (Nicholls, Ferguson, 1992).
Первичные акцепторы водорода окислительно-восстановительных реакций относят к 2 типам дегидрогеназ: никотинамидзависимым, содержащим в качестве коферментов производные никотиновой кислоты, и флавинзависимым, содержащим производные рибофлавина. Никотинамидзависимые дегидрогеназы содержат в качестве коферментов НАД+ или НАДФ+ - производные витамина PP. Эти коферменты входят в состав активных центров дегидрогеназ, но могут диссоциировать из комплекса с апоферментами и включаться в состав фермента в ходе реакции. Субстраты НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ находятся в матриксе митохондрий и в цитозоле. Рабочей частью никотинамидных коферментов служит никотинамид.
Большинство дегидрогеназ, поставляющих электроны в дыхательную цепь, содержат НАД4". Они катализируют реакции следующего типа: R-CHOH-R, + НАД4" - R-CO-Ri + НАДН + НҐ
Таким образом, НАД4", присоединяя протоны и электроны от различных субстратов, служит главным коллектором энергии окисляемых веществ и главным источником электронов, обладающих высоким энергетическим потенциалом, для электрон-транспортной цепи митохондрий.
Приготовление гистологических срезов печени
Гистологические срезы готовили по стандартной методике (Роскин, 1957). Кусочки печени крыс фиксировали в 10 %-ном нейтральном формалине, заливали в парафиновые блоки, из которых с помощью микротома приготавливали срезы толщиной 5 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином-эозином или пикрофуксином по Ван Гизону (Пирс, 1962).
Изолированные гепатоциты крыс получали по модифицированному методу Сеглена (Seglen, 1976). В течение 5 мин через воротную вену in situ проводили перфузию печени подогретым до 37С буфером (рН 7.4), содержащим 8.3 г/л NaCl, 0.5 г/л КС1, 2.4 г/л HEPES, 2 г/л глюкозы, 5.5 мл/л 1 М NaOH. Далее печень извлекали, помещали в стерильную чашку Петри и измельчали на кусочки размером примерно 1 мм . После промывки средой Игла, дополненной 0.1 % глюкозы, 0.01 М HEPES, 1 % сыворотки эмбрионов коров и 40 мкг/мл гентамицина, кусочки помещали в 0.5 %-ный раствор коллагеназы IV (Sigma, США) в среде Игла с 0.1 М HEPES (рН 7.6). По истечение 5 мин инкубации в ферментативном растворе при 37 С в условиях непрерывного встряхивания удаляли супернатант и процедуру повторяли еще 2 раза, увеличив ее длительность до 20 мин, всякий раз заливая кусочки печени свежей порцией фермента. Объединенную суспензию гепатоцитов фильтровали через стерильный нейлоновый фильтр и клетки трижды промывали средой Игла, осаждая центрифугированием при 20 g. Жизнеспособность гепатоцитов оценивали по окраске трипановым синим, акридиновым оранжевым и бромистым этидием, а также с помощью МТТ-теста (Mossman, 1983). Оценка жизнеспособности гепатоцитов основана на изменении проницаемости цитоплазматической мембраны клеток к указанным красителям. Жизнеспособность гепатоцитов составляла в разных экспериментах от 70 до 90 %. Количество изолированных гепатоцитов в суспензии определяли, подсчитывая клетки в камере Горяева. Осадок клеток ресуспендировали в" культуральной среде ДМЕМ/!7 с добавками трансферрина (10 мкг/мл), инсулина (10 мкг/мл), эмбриональной сыворотки (10 %) и гентамицина (40 мкг/мл) и высевали в пластиковые чашки Петри 0 30 мм с плотностью 5-6 106кл/мл. Клетки культивировали в условиях С02-инкубатора при 37 С.
Для анализа морфологического состояния митохондрий гепатоциты окрашивали флуоресцентным красителем - родамином 123 по методу Джонсона с соавторами (Johnson et al., 1980). Изолированные гепатоциты высевали на покровные стекла, с нанесенным заранее слоем желатина и инкубировали в среде Eagle с родамином 123 (10 мкг/мл) в течение 30 мин при 5 % С02, 37 С. Далее, инкубационную среду сливали и заливали чистой средой Eagle. Инкубировали в течение 5 мин при 5 % С02, 37 С. Данную процедуру повторяли дважды. Для сохранения жизнеспособности гепатоцитов во время микроскопирования покровные стекла с монослоем клеток помещали на предметное стекло с предварительно подготовленной герметичной камерой, заполненной подогретой культуральной средой. Флуоресценцию окрашенных гепатоцитов возбуждали светом 480 нм и наблюдали во флуоресцентном конфокальном микроскопе Leica (Германия).
Митохондрии выделяли методом дифференциального центрифугирования по методу Джонсона и Лэрди с небольшими изменениями (Jonson, Lardy, 1969). Кусочки печени гомогенизировали с помощью ручного гомогенизатора при 0 С в среде 1, содержащей 250 мМ сахарозы (без Са2+), 3 мМ Tris и 0.5 мМ ЭГТА, рН 7.3. Гомогенат центрифугировали 5 мин при 700 g и температуре 0 С. Полученный супернатант центрифугировали 10 мин при 7000 g и температуре 0 С в Пі среде 2, содержащей 250 мМ сахарозы (без Са ), 3 мМ Tris, рН 7.3. Полученный митохондриальный осадок дважды промывали в среде 2, осаждая митохондрии центрифугированием при 7000 g. Количество белка определяли по Бредфорд (Bradford, 1976).
Субмитохондриальные частицы получали из изолированных митохондрий печени крыс с помощью дифференциального центрифугирования (Herrero, Barja, 2000). Изолированные митохондрии суспендировали в 1 мл среды выделения, содержащей 220 мМ маннитола, 70 мМ сахарозы, 1 мМ №2ЭДТА и 10 мМ Tris, рН 7.4 при температуре 4С. Затем суспензию митохондрий дважды обрабатывали с помощью соникатора 50-W Vibra Cell в течение 30 с, с 1-минутным интервалом между обработками. Далее к полученной суспензии добавляли 15 мл среды выделения и центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин.
Полученный супернатант собирали и центрифугировали в течение 40 мин при 100 000 g на ультрацентрифуге Beckman Optima XL 900. Осадок суспендировали в 15 мл среды выделения и центрифугировали еще раз при 100 000 g в течение 40 мин. Конечный осадок, содержащий субмитохондриальные частицы, ресуспендировали в 0.3 мл среды выделения.
Определение активности цитохром с оксидазы
Результаты измерения продукции супероксидного аниона субмитохондриальными частицами представлены на рисунке 4.17. В присутствии НАДН (субстрат комплекса I дыхательной цепи) скорость выработки супероксидного аниона субмитохондриальными частицами опытной группы оказалась в 2.5 раза выше, чем в контроле. При добавлении сукцината (субстрат комплекса II дыхательной цепи) скорость выработки супероксидного аниона субмитохондриальными частицами контрольной и опытной групп не отличалась от соответствующих значений, полученных в присутствии НАДН для субмитохондриальных частиц контрольной группы. Однако скорость выработки супероксидного аниона субмитохондриальными частицами опытной группы при добавлении сукцината была достоверно ниже, чем таковая в присутствии НАДН.
Внесение в инкубационную систему ротенона (ингибитор комплекса I дыхательной цепи) в сочетании с НАДН вызвало увеличение продукции супероксидного аниона в 4.7 раза в контроле, и, наоборот, никак не повлияло на его выработку в опытной группе.
Добавление миксотиазола (ингибитор окисления и восстановления CoQ) в присутствии НАДН вызвало увеличение скорости продукции супероксидного аниона в 7.3 и 4.9 раза в контрольной и опытной группах соответственно.
В присутствии антимицина А (ингибитор восстановления CoQ) и НАДН продукция супероксидного аниона в контрольной группе была увеличена в 8 раз по сравнению с исходным уровнем, и достоверно не изменилась в опытной группе.
Продукция супероксидного аниона субмитохондриалъными частицами гепатоцитов крыс в норме (белые столбики) и при токсическом гепатите (серые столбики). X ± S.D., N=15, Р 0.05 относительно контроля; Р 0.05 относительно скорости продукции Oi СМЧ в контроле при добавлении НАДН; Р 0.05 то же, но в рамках опытной группы. Сокращения: Рот — ротенон; Микс — миксотиазол; Ант А — антшшцин А.
Совместное воздействие миксотиазола и антимицина А в присутствии НАДН вызвало повышение продукции супероксидного аниона в 6 и 5.4 раза в контроле и опыте соответственно, по сравнению с их уровнями на фоне одного НАДН. Скорость продукции супероксидного аниона в опытной группе при совместном воздействии миксотиазола и антимицина оказалась в 2 раза выше, чем в контроле.
Данные экспериментов по измерению скорости продукции супероксидного аниона в присутствии ингибиторов дыхательной цепи показали, что скорость продукции супероксидного аниона субмитохондриальными частицами крыс с токсическим гепатитом в присутствии НАДН достоверно выше, чем в контроле. Субмитохондриальные частицы животных опытной группы не реагировали на добавление ротенона. Скорость продукции супероксидного аниона при внесении в образцы миксотиазола и НАДН в опытной группе оказалась достоверно выше, чем в контроле. Напротив, добавление антимицина А к субмитохондриальным частицам опытной группы не привело к изменению продукции супероксидного аниона. Полученные данные указывают на то, что в комплексе I дыхательной цепи при токсическом гепатите происходит усиление образования супероксидного аниона. Вклад комплекса III в увеличение продукции супероксидного аниона, по-видимому, незначителен.
Митохондрии являются одним из основных источников активных форм кислорода в клетке, защиту от которых осуществляет собственная антиоксидантная система этих органелл. Антиоксидантная система митохондрий представлена в основном митохондриальной Мп-СОД и компонентами глутатионового цикла. Результаты определения в митохондриях активностей Мп-СОД, глутатионпероксидазы, а также содержания окисленного и восстановленного глутатиона представлены в таблице 4.4
Морфология митохондрий, окрашенных родамином
Для оценки вклада в продукцию супероксидного аниона остальных компонентов дыхательной цепи мы провели измерение скорости продукции супероксидного аниона в присутствии миксотиазола и антимицина А, имеющих отличные от ротенона сайты ингибирования электронного транспорта в дыхательной цепи. Миксотиазол имеет два сайта воздействия в дыхательной цепи (рис. 5.2), блокируя окисление CoQ в центре Qp в комплексе III, и частичное восстановление CoQ в комплексе I (Ortega-Saenz et al., 2003; Ward, 2003). Антимицин А подавляет передачу электронов с цитохрома Ь566 на окисленный убихинон в комплексе III, тем самым, препятствуя восстановлению убихинона (Андреев и др., 2005; Grivennikova, Vinogradov, 2006). В связи с этим, миксотиазол в норме вызывает многократное увеличение продукции АФК комплексом I, а антимицин А - комплексом III. В свою очередь совместное действие миксотиазола и антимицина А проявляется в небольшом снижении продукции супероксидного аниона комплексом III (Андреев и др., 2005). Перечисленные эффекты миксотиазола и антимицина А были также получены нами на субмитохондриальных частицах контрольной группы (рис. 4.17). Уровень продукции супероксидного аниона субмитохондриальными частицами опытной группы в присутствии миксотиазола и НАДН на 72% выше, чем в контроле в этих же условиях. Это указывает на то, что интенсивность электронного транспорта по дыхательной цепи митохондрий опытной группы намного выше, чем в контроле. Напротив, в присутствии антимицина А продукция супероксидного аниона субмитохондриальными частицами опытной группы была ниже чем в контроле, но не отличалась от скорости продукции супероксидного аниона субмитохондриальными частицами опытной группы в присутствии ротенона и НАДН. Следовательно, либо продукция супероксидного аниона комплексом III при гепатите очень низкая, либо весь образующийся в комплексе III супероксидный анион утилизируется в рамках компенсаторного механизма с участием цитохрома с и цитохром с оксидазы. Цитохром с может окислять образовавшийся супероксидный анион и переносить его на цитохром с оксидазу, которая, в свою очередь, восстанавливает кислород. до воды (Korshunov et al., 1999; Андреев и др., 2005). Выявленное нами ранее почти двукратное увеличение активности цитохром с оксидазы при токсическом гепатите подтверждает такую возможность (Ширяева и др., 2007). По-видимому, результат совместного действия миксотиазола и антимицина А в опытной группе, определяется действием одного миксотиазола в комплексе I. Эти данные также подтверждают предположение о существовании в комплексе I дыхательной цепи митохондрий при токсическом гепатите препятствия в транспорте электронов.
Данные по измерению скорости продукции супероксидного аниона на субстрате комплекса II дыхательной цепи — сукцинате, не выявили каких-либо отличий- между опытной и контрольной группами. Следовательно, при токсическом гепатите комплекс II не участвует в выработке АФК. Известно, что комплекс II обладает наименьшей способностью к продукции супероксидного аниона по сравнению с остальными источниками АФК в митохондриях (McLennan, Esposti, 2000).
Более того, некоторые авторы вообще высказывают сомнение в отношении возможности продукции АФК комплексом II в неповрежденной дыхательной цепи (Андреев и др., 2005).
Митохондрии млекопитающих обладают эффективной системой защиты от АФК (Андреев и др., 2005; Li et al., 1995). Устранение первичных АФК (супероксидного аниона и Нг02) осуществляют Мп-содержащая СОД и глутатионпероксидаза. Мп-СОД, расположенная в митохондриальном матриксе, ускоряет дисмутацию супероксидного аниона в Н2О2, защищая от супероксидного аниона железосерные кластеры, входящие в состав комплексов дыхательной цепи (Gardner et al., 1995). Глутатионпероксидаза утилизирует Н2Ог, посредствам окисления восстановленного глутатиона (Li et al., 1995). Активность систем удаления АФК в норме очень высока, однако при патологии скорость выработки АФК митохондриями может превышать скорость их утилизации системой антиоксидантной защиты (Андреев и др., 2005). Кроме того, продукты окислительного стресса могут подавлять компоненты антиоксидантной системы (Bota, Davies, 2002). Возможно и появление окислительно модифицированных белков электрон-транспортной цепи, которые могут привести к нарушению работы дыхательной цепи, усилению окислительного стресса и снижению синтеза АТФ. Результаты наших исследований показали снижение на 45 % синтеза АТФ в группе животных с токсическим гепатитом. Активности Мп-СОД и глутатионпероксидазы при этом были снижены на 34 % и 26 % соответственно. Однако уровни окисленного и восстановленного глутатиона не имели достоверных отличий от контроля (табл. 4.4). Снижение синтеза АТФ и активности глутатион пероксидазы выявлено также при хроническом алкогольном поражении печени (Bailey et al., 2006) и при циррозе печени (Balkan et al., 2001). Следовательно, при гепатите в условиях окислительного стресса антиоксидантная система не обеспечивает эффективную утилизацию АФК,
