Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 13-29
Глава II. Материалы и методы исследования 30-37
Глава III. Результаты исследования 38
3.1. Цитохимические исследования клеток крови при отравлении солями свинца, меди и их комбинацией 38
3.1.1. Исследование содержания гликогена, липидов и SH-групп в клетках периферической крови 38-47
3.1.2. Изучение активности эстераз и СДГ циркулирующих нейтрофилов.47-52
3.1.3. Исследование основных антимикробных систем (миелопероксидазы и катионных белков) циркулирующих нейтрофилов 52-61
3.2. Исследование активности ЛДГ, пероксидазы и белков плазмы крови биохимическими методами 61
3.2.1. Исследование активности ЛДГ 61-67
3.2.2. Диск-электрофорез белков плазмы крови 67-73
3.2.3. Диск-электрофорез пероксидаз крови 73-83
3.3. Исследование функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов 83-90
Глава IV. Обсуждение полученных результатов 91 -102
Выводы 103-104
Приложение к разделу «Исследование функциональной активности НЛ». 105-113
Список литературы
- Исследование содержания гликогена, липидов и SH-групп в клетках периферической крови
- Исследование основных антимикробных систем (миелопероксидазы и катионных белков) циркулирующих нейтрофилов
- Диск-электрофорез белков плазмы крови
- Исследование функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов
Введение к работе
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1... Снижение содержания гликогена в нейтрофильных лейкоцитах крови имеет место во всех трех вариантах экспериментов. Однако оно наиболее выражено при отравлении уксуснокислым свинцом и в варианте с комбинацией. Эти сдвиги являются показателем непосредственного влияния токсических веществ, особенно, уксуснокислого свинца, на синтетические процессы в нейтрофильных лейкоцитов, что подтверждается результатами исследования в клетках липидов и SH-rpynn.
2. Стимуляция иммунной системы опытных животных эритроцитами баранов в определенной степени блокирует токсическое действие использованных веществ, что выражается заметным ростом в нейтрофильных лейкоцитах содержания гликогена, липидов и белков содержащих SH-группы. ,
3. Хроническое отравление сернокислой медью, уксуснокислым свинцом и их комбинацией существенно подавляет активность окислительных ферментов в нейтрофильных лейкоцитах, в частности, ЛДГ4. При этом в наибольшей степени угнетается активность ЛДГ4 — фракции, ответственной за анаэробный гликолиз - основного поставщика энергии в НЛ, что, несомненно, снижает функциональные возможности клеток.
4. Отмеченный, при исследовании антимикробных систем (миелопероксидазы и катионных белков) нейтрофильных лейкоцитов дегранулирующий эффект использованных токсических соединений наряду с появлением в крови паралейкобластов следует рассматривать как результат их влияния не только на гранулогенез, но и на циркулирующие клетки.
5. Во всех выбранных вариантах экспериментов выявлены качественные и количественные сдвиги белкового состава сыворотки крови, особенно выраженные в зоне спектра у - глобулинов и белков, ответственных за транспорт железа и меди (гаптоглобулинов и церулоплазмина). Иммунизация животных в определенной степени корригирует эти изменения, преимущественно за счет - у-глобулиновых фракций.
6. Использованные токсические вещества при длительном использовании подавляет функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов, что выражается снижением всех показателей фагоцитоза, и особенно миграционной активности, количества нейтрофильных лейкоцитов, участвовавших в фагоцитозе, и количества поглощенных кокков. Эти сдвиги следует объяснить, прежде всего, угнетением активности ферментов, ответственных за энергетическое и пластическое обеспечение фагоцитов.
Введение
Одним из приоритетных медико-биологических проблем, особенно последнего времени, следует считать профилактику неблагоприятных воздействий химических и физических факторов окружающей среды. Известно, что организм человека постоянно подвергается действию целого ряда токсических веществ, которые в малых концентрациях вызывают лишь обратимые нарушения определенных физиологических процессов. При их длительном и в больших концентрациях действии возможны необратимые биохимические, а в последующем и морфологические изменения в различных органах и системах.
В настоящее время с определенной полнотой изучено лишь изолированное действие на организм различных токсических соединений, тогда как их комбинированное действие исследовано недостаточно и лишь на примере некоторых систем.
В частности, действие бинарных смесей свинец-медь и свинец-цинк с целью выведения определенных гигиенических нормативов для определенных групп населения изучены рядом авторов [59, 64, 68,102,111].
Авторами исследованы, в основном, морфофункциональные свойства эритроцитов населения экологически неблагоприятных районов. Установлены сдвиги осмотической резистентности, цитоархитектоники эритроцитов, содержания в них SH-групп и др.
Длительное действие предельно допустимых доз солей тяжелых металлов на клетки крови рассмотрено в работах ряда исследователей [6, 67, 115, 119, 120]. Установлено, что при этом отмечаются изменения гемопоэза, а в отдельных случаях - заболевания крови.
Авторы отмечают, что повреждение гемопоэза выражается в дегенеративных изменениях клеток крови. Эти изменения могут быть обнаружены на всех стадиях дифференцировки клеток и проявляются в виде повреждения клеточных мембран, структуры цитоплазмы и ядра, в нарушении субклеточных структур - митохондрий и лизосом.
Все это, как считают, сокращает продолжительность жизненного цикла клеток и способствует их преждевременной гибели. Предполагается, что дегенеративно измененные клетки, разрушаясь, в ряде случаев превращаются в антигены и сенсибилизируют организм. Образующиеся при этом антитела, действие которых направлено против собственных лейкоцитов, тромбоцитов, эритроцитов, изменяют физико-химические свойства клеток и становятся дополнительными факторами, повреждающими клетки.
Однако, следует отметить, что в этом плане со значительной полнотой исследованы лишь эритроциты крови и недостаточно рассмотрены клетки лейкоцитарного ряда.
Из представленных авторами данных можно предположить, что действие указанных токсических факторов, по-видимому, осуществляется в основном, на уровне гемопоэза. Нам представляется, что для подтверждения этого мнения следует подвергнуть детальному исследованию и клетки белой крови, так как трудно представить вариант, когда указанные цитохимические вещества влияют на одни клетки, образующиеся в процессе миелопоэза, и инертны в отношении к другим, хотя возможность преимущественного воздействия их на эритроциты и эритропоэз в целом нельзя отрицать.
В приведенных выше исследованиях акцентируется внимание лишь на клинических и морфологических аспектах вопроса.
Однако, как отмечается в единичных работах [1, 117, 118], где исследованы показатели клеток крови при силикозе, бериллиозе и других профессиональных заболеваниях, не сопровождающихся сколько-нибудь выраженными сдвигами в морфологическом составе крови, имеют место четкие метаболические изменения.
Нам представляется, что это перспективное направление, в плане раскрытия тонких механизмов токсического действия тяжелых металлов, в частности, свинца и меди, на систему крови, заслуживает внимания. Это мнение базируется на известном факте, что в патологических процессах биохимические изменения опережают морфологические.
Влияние соединений свинца и меди на функциональное состояние лейкоцитов рассмотрено в некоторых работах [9, И, 14, 102, 111, 183] с использованием лишь ограниченного количества показателей. По этой причине полученные данные не могут дать полного представления о состоянии фагоцитарной активности клеток при указанных токсических воздействиях. Лишь комплексный подход с охватом всех показателей фагоцитоза в совокупности с цитохимическими исследованиями основных антимикробных систем - миелопероксидазной (МПО) и системы катионных белков, а также ферментов, ответственных за энергетическое обеспечение этих процессов, позволили бы выяснить ключевые этапы нарушения функционального состояния лейкоцитов, а следовательно и состояние неспецифической резистентности организма в целом.
Исследование функционального состояния лейкоцитов при действии бинарной смеси - свинец-медь было бы неполным без рассмотрения возможных изменений белкового состава, в том числе и ферментов, плазмы крови. В работах ряда авторов [4, 36, НО, 114] изучено лишь общее содержание белков плазмы крови. Во всех исследованиях указывается, что при данных токсических воздействиях имеет место гипо- и диспротеинемия. Однако для более четкого представления о количественных и качественных изменениях отдельных белков и сдвигах активности различных ферментов, на наш взгляд, необходимо применение более современных методов микрохимического анализа. Результаты их позволили бы расшифровать некоторые детали сложного механизма развития патологического процесса при выбранных токсических воздействиях.
В связи с этим нам представлялось актуальным комплексное исследование цитохимических показателей и функционального состояния нейтрофильных лейкоцитов (НЛ) крови в эксперименте при хроническом воздействии наиболее часто встречающихся токсических факторов окружающей среды - соединений свинца и меди, а также их комбинации. При этом важно было рассмотреть и возможное корригирующее влияние стимуляции иммунной системы организма на выявленное сдвиги.
Исследование содержания гликогена, липидов и SH-групп в клетках периферической крови
В клетках крови у экспериментальных крыс получавших в течение длительного времени (5мес.) соли свинца в выбранной дозировке отмечаются значительные цитохимические сдвиги. Так, содержание гликогена в НЛ снижено с высокой степенью достоверности (0,17±0,01, при контроле -3,1±0533). Как видно на представленном микрофото (Рис. 1(6)) в мазках лейкомассы лишь единичные сегментоядерные нейтрофилы содержат умеренное количество окрашенных гранул. Преобладающее большинство положительные гранулы. Их несколько больше в цитоплазме юных и палочкоядерных форм.
Опыт - отравление уксуснокислым свинцом. Реакция на гликоген. В мазке лейкомассы крови у контрольной (а) крысы большая часть НЛ насыщена окрашенными гранулами, тогда как у опытной (б) лишь часть сегментоядерных нейтрофилов содержит умеренное количество окрашенных гранул. Ок. 10. Об. 90.
Моноциты также содержат единичные, равномерно распределенные по всей цитоплазме гранулы с малиново-красными продуктами цитохимической реакции; в случаях нормы их концентрация значительно больше. Не удается их заметить в тромбоцитах, тогда как в контрольных мазках они обычно имеют (не во всех) сгруппированные в центральной части гранулы гликогена.
Цитохимическая картина другая у иммунизированных крыс. При первом после иммунизации исследовании (4-5 дни) в мазках обнаруживается много сегментоядерных форм с умеренным содержанием или даже насыщенных ШИК - положительными гранулами. Они чередуются с клетками, имеющими или малое количество равномерно распределенных, или сгруппированных в определенных участках окрашенных гранул. Однако общее содержание гранул гликогена в обоих случаях все же достоверно ниже по сравнению с контролем и составляют соответственно: 2,0+0,07 й 2,6±0,15(Табл. 1).
При хроническом отравлении солями меди гликогена в НЛ экспериментальных животных также снижено значительно (0,75+0,05). Однако по сравнению с предыдущим случаем в мазках лейкомассы больше клеток с умеренным содержанием ШИК - положительных гранул.
При первом исследовании после иммунизации в мазках преобладают НЛ с умеренным содержанием гранул, наряду с которыми имеются единичные клетки, насыщенные продуктами цитохимической реакции. Молодые циркулирующие формы (юные и палочкоядерные) по количеству гранул не отличаются от контрольных значений. Нет заметной разницы от контроля в содержании гранул и в моноцитах. Еще меньше разницы в содержании гранул гликогена в НЛ при втором исследовании после иммунизации (2,99±0,35). Большая часть выявленных НЛ насыщены продуктами цитохимической реакции. Однако нередко в мазках встречаются клетки с единичными разбросанными по всей цитоплазме гранулами.
В случаях комбинированного отравления экспериментальных животных содержание гликогена в НЛ минимальное (ОД+0,06). Основная масса клеток с малым содержанием светло окрашенных гранул. Характерно наличие среди них отдельных сегментоядерных форм насыщенных продуктами реакций. Гранулярность в них слабо очерчена.
Через 4-5 дней после иммунизации общее содержание гликогена -2,2±0,41 (Табл.1.). В мазках значительное разнообразие клеток по количеству гранул; часть НЛ с умеренным их содержанием, а другая - с единичными разбросанными по всей цитоплазме. Редко встречаются сегментоядерные формы, насыщенные продуктами цитохимической реакции. Количество последних больше при втором исследовании (7-8 дни) после иммунизации и соответственно меньше количество клеток с малым их содержанием.
Следует отметить, что у контрольных животных процесс иммунизации заметно не влияет на содержание гранул гликогена в НЛ, хотя, в большинстве случаев, в первый срок исследования оно несколько выше по сравнению с не иммунизированными.
Содержание липидов в НЛ экспериментальных животных, получавших соли меди, мало изменено по сравнению с контрольной группой (2,85+0,67, при контроле - 2,97±0,53). Большая часть клеток насыщена продуктами цитохимической реакции. В мазках лишь единичные зрелые формы НЛ с малым содержанием суданположительных гранул. Нет заметной разницы в количестве выявляемых липидов и у иммунизированных животных; их значение при первом (4-5 дни) и втором (7-8 дни) исследований соответственно - 2,90±0,77 и 2,78±0,11 (Табл.1.). Сдвиги содержания липидов в НЛ контрольной группы животных также незначительны. Не удается заметить разницу в количестве выявляемых в виде гранул липидов в НЛ и у иммунизированных животных; они в пределах контрольных цифр. Таблица 1 Влияние хронического введения сульфата меди, ацетата свинца и их комбинации на цитохимические показатели лейкоцитов крови (М±т).
Исследование основных антимикробных систем (миелопероксидазы и катионных белков) циркулирующих нейтрофилов
В НЛ иммунизированных животных количество липидных гранул также снижено. В частности, при первом исследовании (4-5 дни) их общее содержание - 2,62+0,77. Преобладают клетки с умеренным количеством окрашенных продуктов реакции. Их значительно меньше при втором исследовании (7-8 дни после иммунизации), что, несомненно, отражается на общее содержание липидов (2,3±0,11).
Характерно частое наличие под одним полем зрения одновременно трех групп НЛ по количеству окрашенных гранул: клетки в основном сегментоядерные, насыщенные ими, с умеренным количеством, а также с малым их содержанием.
При окрашивании мазков лейкомассы на SH- группы у контрольных животных нет статистически достоверной разницы в содержании окрашенного материала в цитоплазме клеток гранулоцитарного ряда. Диффузное распределение продуктов реакции независимо от степени зрелости клеток. Сходная картина в цитоплазме моноцитов, а также лимфоцитов. Однако в последних интенсивность окрашенного материала менее выражена. Диффузно окрашены и ядра клеток. При хроническом отравлении солями свинца в цитоплазме НЛ отмечается более чем двукратное уменьшение количественного содержания продуктов цитохимической реакции (39,0±6,1, при контроле 93,0±7,2). Многие сегментоядерные нейтрофилы имеют лишь следы окрашенного материала. Однако следует отметить, что в мазках нередко встречаются НЛ с умеренным содержанием или даже насыщенные продуктами реакции.
В моноцитах, а также в лимфоцитах интенсивность реакции сравнима с контролем.
Количество НЛ с умеренным содержанием продуктов реакции несколько больше у иммунизированных животных, средние цитохимические показатели которых при двух исследованиях соответственно - 57,0±6,8 и 65,0±4,5 (Таб.№1.).
При отравлении сернокислой медью содержание SH - групп в НЛ экспериментальных животных также достоверно снижено (67,0±8,2, при контроле - 93±7,2). Однако при сравнении с предыдущим случаем значительно больше клеток с умеренным содержанием продуктов реакции. Характерно снижение интенсивности окрашенного материала в цитоплазме моноцитов, а также лимфоцитов, вследствие чего ядра клеток слабо контурируются. И то же время молодые, циркулирующие НЛ (юные и палочкоядерые формы) имеют сравнимую с контролем интенсивность реакции по всей цитоплазме.
Однако около 40% НЛ имеют умеренное содержание SH — групп. Характерно диффузное распределение продуктов цитохимической реакции; редко определяется гранулярность последней. Более насыщены окрашенным материалом молодые циркулирующиеся формы (юные сегментоядерные).
В моноцитах редкие окрашенные гранулы распределены равномерно; в количественном отношении их значительно меньше по сравнению с контролем.
Единично окрашенные гранулы удается заметить и в эозинофилах. У животных при первом исследовании после иммунизации количество НЛ со следами цитохимической реакции заметно меньше. Параллельно увеличено количество клеток с умеренным содержанием диффузно окрашенного материала, что выражается некоторым ростом его количественном отношении (SH 1,0±3,2, при контроле -42,0±2,8).
В мазках лейкомассы встречаются лишь единичные НЛ со следами цитохимической реакции. Большинство клеток имеет слабое или умеренное содержание продуктов реакции. Несколько более очерчены контуры окрашенных гранул; однако, диффузный фон сохраняется. Достоверность различий слабая (р 0,05).
При использовании в качестве субстрата ос- нафтол хлорацетата интенсивно окрашивается часть гранулоцитов.
В мазках лейкомассы крови контрольных крыс имеет место, четко локализованное гранулярное окрашивание в цитоплазме примерно половины всех выявленных нейтрофильных гранулоцитов (48 из 100 выявленных). Распределение гранул равномерное. В мазках лейкомассы крыс отравленных CuS04 (без иммунизации) количество эстераз положительных клеток снижено до 33 (Рис.6).
У животных отравленных (СНЗ СОО)2 РВ количество эстераз положительных НЛ по сравнению с контролем снижено значительно - 22 (Рис.6). Основная масса клеток имеет, светлую неокрашенную цитоплазму. В цитоплазме некоторых эстеразположительных клеток отмечается групповое расположение гранул. Последние отличаются и по размерам, и по степени интенсивности окрашивания. Нередко встречаются клетки с единичными, но четко окрашенными гранулами, а определенный процент НЛ имеет лишь следы (тени) слабоочерченных гранул.
В мазках лейкомассы крови крыс отравленных комбинацией CuS04 и (СНЗ СОО)2 РВ число зстеразположительньїх клеток больше по сравнению с предыдущим вариантом - 29 (Рис.6). Среди них преобладают клетки с умеренным содержанием окрашенных гранул. У иммунизированных крыс (4-5 день) количество эстераз положительных клеток увеличивается до 37. При этом отмечается рост НЛ насыщенных окрашенными гранулами. Сходная картина и у иммунизированных животных на 7-8 день. Активность СДГ в зрелых полиморфноядерных клетках или слабая, или умеренная. В мазках лейкомассы у контрольных крыс активность СДГ выявляется в цитоплазме НЛ, а также лимфоцитов в виде нечетко очерченных гранул. Лишь в единичных клетках окрашенные гранулы выделяются хорошо.
Диск-электрофорез белков плазмы крови
В лейкомассе крови у животных отравленных CuS04 (не иммунизированные) при постановке реакции на СДГ НЛ контурируются слабо, или умеренно. В цитоплазме клеток продукты цитохимической реакции локализованы в виде слабо заметных синеватых гранул.
Подсчет СЦП показывает, что активность фермента достоверно снижена (1,05±0,05, при контроле 1,44±0,08). Следует отметить, что количество окрашенных гранул заметно снижено и в цитоплазме лимфоцитов.
Картина несколько изменена в мазках у иммунизированных животных (4-5 день 7-8 день). Значительно больше клеток с умеренно контурирующими гранулами. Более четко окрашена и цитоплазма лимфоцитов. Количественное содержание продуктов реакции в обоих случаях сходная (Рис8).
При отравлении животных (СНЗ СОО)2 РВ активность фермента в НЛ еще более снижена (0,88±0,07). Не удается обнаружить клетки с хорошо или умеренно окрашенными гранулами. Почти все гранулоциты контурируются слабо. В их цитоплазме лишь следы окрашенных продуктов цитохимической реакции
Показатели активности при отравлении: А- Си S04 Б- (СНЗ СОО)2 РВ В - их комбинацией Не удается установить заметных изменений в активности СДГ по сравнению с контролем в НЛ у животных на 7-8 дни после иммунизации.
При комбинированном отравлении животных CUS04 (СН СОО)2 РВ активность фермента во всех вариантах опытов близка к контрольным значениям (Рис.8). Однако следует отметить, что интенсивность окрашивания цитоплазмы лимфоцитов в опытных вариантах заметно ниже.
ЗЛ.З.Исследование основных антимикробных систем (МПО и катионных белков) циркулирующих нейтрофилов.
Сравнительная оценка способов выявления активности МПО показала, что наиболее информативен усовершенствованный нами метод описанный в главе «Материалы и методы исследования». Апробация метода на большом экспериментальном материале определила условия, необходимые для оценки количества и характера распределения пероксидазасодержащих гранул (ПО -гранул) в цитоплазме нейтрофилов.
1. При выявлении ферментов, в том числе и МПО, мазки должны быть приготовлены из лейкоконцентрата. Лейкомассу следует получать в физиологичных условиях, исключающих сморщивание, деформацию вследствие сдавливания от близко расположенных клеток. При соблюдении их форма клеток, как правило, округлая. Изменение формы клеток - это, чаще всего, результат внешних не физиологичных воздействий. В частности, применение любых соединений, смесей, известных ныне, ускоряющие осаждение эритроцитов, приводит к двигательной активности лейкоцитов, а, следовательно, и к изменению формы клеток. Это, как известно, результат высокой реактивности лейкоцитов к любому изменению состава внеклеточной среды.
2. Необходимо исследовать клетки, расположенные лишь предщеточной зоне мазка, где толщина наименьшая, расположение клеток изолированное. 3. Ядра клеток следует докрашивать так, чтобы было и фоновое докрашивание и цитоплазмы в участках свободных от гранул.. При соблюдении указанных условий предщеточной зоне мазка можно получить достаточную концентрацию лейкоцитов недеформированных и без признаков сморщивания. Отсутствие последнего можно проверить простым сравнением нейтрофилов и эритроцитов. Как показали наблюдения при правильном приготовлении мазка в отмеченной зоне диаметр нейтрофилов примерно в 2-2,5 раза превышает диаметр эритроцитов. Распределение ПО - гранул в цитоплазме у контрольных крыс обычно равномерное. По интенсивности цитохимической реакции удается вьщелить три типа гранул: сильной, умеренной и слабой активностью (Рис.9). Плотность расположения гранул во всех участках цитоплазмы умеренное (СЦП 1,33±0,13). Однако следует отметить, что у взрослых крыс примерно 3-6 % клеток имеет более насыщенное периферическую зону или же разную степень изреженности, а у 94 - 97 % нейтрофилов распределение ПО - гранул равномерное с преобладанием умеренной активности.
У контрольных крыс распределение гранул в основной массе клеток равномерное; малая их часть (5-7 %) имеет слабо выраженную сегментарную активность, или же насыщенную периферическую зону. Редко встречаются незрелые формы гранулоцитов.
В лейкомассе крови у иммунизированных опытных крыс (4-5 день) активность фермента сравнима или даже несколько выше (1,48+0,22) по сравнению с контролем. Увеличено количество клеток насыщенных ферментсодержащими гранулами, в то же время сохраняется количественное соотношение НЛ с признаками дегрануляции. Отмечается также рост количества незрелых циркулирующихся форм клеток с умеренной и выраженной активностью.
В мазках нередко выявляются паралейкобластные формы клеток миелоидного ряда с необычно сегментированным или слабо сегментированным ядром и следами диффузной иногда гранулярной пероксидазной активностью. Следует отметить, что указанные патологические формы клеток нам удавалось определить лишь при комбинированном отравлении опытных животных. В случаях иммунизации опытных животных (4-5 день и 7-8 день) количество НЛ со значительной изреженностью гранул меньше. Характерно выраженное разнообразие выявленных НЛ по количественному содержанию гранул; клетки с малым или умеренным содержанием гранул чередуются с чрезмерно насыщенными. Паралейкобластные формы клеток, как правило, отсутствуют.
Как следует из приведенного Рис.13 активность МПО в НЛ находится в прямой зависимости от количества дегранулированных клеток. Оно наибольшее у опытных крыс (без иммунизации) при их комбинированном отравлении. Высокие цифры количества таких клеток сохраняются и в случаях их иммунизации.
Необходимость оценки активности ЛДГ и спектра ее изоферментов диктовалась тем известным фактором, что гликолиз - это единственный источник энергии, обеспечивающий все двигательные процессы в нейтрофилах, в том числе и дегрануляцию. По мнению исследователей (Hoffstein et ае., 1977 и др.) ее структурной основой служат сократительные белки подобные (но не идентичные) актину и миозину. Для выполнения своей функции последние, несомненно, нуждаются в АТФ, единственным поставщиком которой в нейтрофилах является гликолиз.
Известно, что в нейтрофилах крови доминирует растворимая М-субьединица, вследствие, чего в его спектре преобладают анаэробные(4, 5) и промежуточные (3) фракции, а аэробные фракции(1, 2) слабо выражены. Эти данные согласуются с мнением о том, что в нейтрофилах весьма ограничено количество митохондриев. Однако проведенные нами дискэлектрофоретические исследования ЛДГ леикомассы крови показали, что в ее спектре довольно хорошо выражены и аэробные фракции.
Исследование функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов
У иммунизированных опытных животных (4-5 день и 7-8 день) указанные сдвиги активности изоферментов ЛДГ в основном сохраняются. Однако следует отметить, что при данных вариантах опытов аэробные (ЛДГ- 1 и ЛДГ - 2), а также промежуточная (ЛДГ - 3) по степени выраженности весьма сходны с контролем. Разность сдвигов активности аэробной (ЛДГ- 1) и (ЛДГ - 4) лейкомассы крови крыс в трех вариантах опытов с отравлением CuS04 хорошо демонстрируется на представленном рисунке (Рис. 17).
Хроническое отравление животных (СНЗСОО)2РЬ приводит к значительным сдвигам всех фракций изоферментного спектра ЛДГ лейкомассы крови. В частности, в фореграммах слабо выражена фракция ЛДГ - 1 (3,3+0,28, при контроле-6,310,29). Почти в два раза уменьшен и объем ЛДГ - 2 (11,2±0,13, при контроле -19,8±0,37). Несколько в меньшей степени уменьшена активность ЛДГ - 3 (26,1 ±0,51, при контроле 35,4+0,54). Еще более выражены сдвиги активности анаэробных фракций. Так, активность ЛДГ - 4 снижена по сравнении с контролем в цифровом выражении более чем в 4 раза(3,5±0,07, при контроле -14,3±0,32).
В зависимости от способа исследования получаются различные фракции. Так, при высаливании нейтральными солями белки плазмы группируются в три основные фракции (альбумины, глобулины и фибриноген); при электрофорезе на бумаге, получается, пять основных фракций (альбумины,а - глобулины,р -глобулины, р - глобулины, фибриноген).
Использование гелей, наиболее совершенным из которых является полиакриламидный, создает лучшие возможности для передвижения белков и их фракционирования, чем бумага. При электрофорезе на полиакриламидном геле получается большое количество фракций, и они более отчетливы. При этом фракции проходят через "молекулярное сито", которым в сущности, является полиакриламидный гель, распределяются в зависимостим от заряда и молекулярного веса белков.
Фракция альбумина без заметных изменений, тогда как преальбумин по сравнению с контролем слабо очерчен.
В случае опыта с иммунизацией (7-8 день) картина спектра белков близка к контролю. В частности, по сравнении с предыдущим вариантом отмечается значительный рост числа фракций р - глобулинов; они на фореграммах хорошо очерчены. Хорошо выявляется и фракция pLp-глобулина.
В случае иммунизации опытных животных область р - глобулинов в фореграммах насыщена фракциями; их количество даже больше чем в случае контроля. Вследствие этого некоторые из них сливаются между собой. Отмечается рост объема липопротеиновой (PLp) фракции, а также медленных сс2 -глобулинов. Последние по выраженности превосходят контрольные случаи. В то же время более подвижные ар -глобулины по размерам и количеству сравнимы с контролем. Трансфериновая (Р1) фракция весьма насыщенная. Сходные сдвиги и в зоне церулоплазмина (Foc2). Последняя имеет тенденцию к слиянию трасфериновой.
Нет заметных различий по сранении с контролем по объему и количеству постальбуминовых фракций, тогда как альбуминовая имеет тенденцию к росту. Хорошо выражена и преальбуминовая полоска.
При хроническом комбинированном отравлении экспериментальных животных сдвиги спектра белков плазмы крови по сравнению с предыдущими вариантами опытов более значительные (Рис.23). Рис.23. Диск - электрофореграммы белков плазмы крови у крыс отравленных комбинацией Си S04 и (СНЗ СОО)2 РВ. Фракции белков окрашены 1 % раствором амидочерного в 7 % растворе уксусной кислоты, а - опыт без иммунизации б - опыт с иммунизацией (7-8 день). В случаях опытов без иммунизации в зоне р - глобулинов количество фракций весьма ограничено; насчитывается 3-4 слабо очерченных полосок. Особенно слабо выражены их быстро движущие формы. Также слабо заметна, или вовсе не обнаруживается липопротеиновая (PLp) фракция. Не удается заметить четких окрашенных полосок и в зоне ос2 - глобулинов. Лишь в некоторых случаях заметна одна слабо выраженная фракция. Гаптоглобулиновая зона представлена одной слабо очерченной полоской. Лишь трансфериновая (pi) фракция по объему близка к контролю, тогда как следующая за ней фракция церулоплазмина в фореграммах полностью отсутствует. Следы очень слабо окрашенных двух полосок выявляются в зоне постальбуминов. Последних удается обнаружить лишь в единичных случаях. Следует отметить, что только альбуминовая фракция по объему близка к контролю, а в большей части случаев тоже уменьшена. Картина иная в зоне преальбуминов. В большинстве случаев фракции здесь не выявляются. Лишь в некоторых случаях видна весьма слабо контурируемая и сливающаяся с альбуминовой одна фракция. р - глобулиновых фракций еще меньше при проведении опытов с иммунизацией. В этой зоне удается выявить лишь 2-3 полоски, но они контурируются хорошо. Во всех случаях не обнаруживается в фореграммах и липопротеиновая (PLp) фракция. В то же время в зоне а2 - медленных глобулинов заметно сильно выраженная одна фракция, которая по объему превосходит все р-глобулиновые. Также хорошо выделяется одна полоска в области сф -глобулинов, то есть гаптоглобулинов. Причем в некоторых случаях определяется очень слабо очерченная одна фракция меньшей подвижности.
Для выявления и разграничения фракций пероксидаз крови использовали метод диск - электрофореза в полиакриловидном геле. Прежде всего, установили уровень расположения фракций пероксидаз крови у крыс. Они, как правило, занимают стартовый конец гелевых полосок, то есть располагается на уровне фракций гамма- глобулинов сыворотки крови. При использовании метода выявления фракций пероксидаз по Шроуэн (1966г.) на этом уровне выявляются четыре фракции, степень четкости которых находиться в зависимости от чистоты гомогената. При недостаточно очищенной лейкомассы выявляются две выраженные, но слабо разграниченные фракции, которые становиться более четкими после многократного отмывания. Ограничены они от гемоглобиновых фракций. Такое расположение облегчает изучение фракций пероксидаз, ибо попытки полностью удалить все эритроциты из леикомассы путем осмотического лизиса приводит обычно к потере активности.
Раздельный диск - электрофорез лейкоцитарной и тромбоцитарной массы показал, что при фракционировании чистой лейкоцитарной массы выявляются 2,3 и 4 фракций, а тромбоцитарной - только первая (стартовая) фракция. Проверка специфичности реакции использованием ингибиторов пероксидазы (гидроксиламин и азид Na в концентрации 0,01 м), как правило, приводит к полному исчезновению предполагаемых пероксидазных фракций и частично гемоглобиновых, что указывает на специфичность реакций. Таким образом, результаты исследований по идентификации фракций показали, что из четырех обнаруживаемых пероксидазных фракций первая имеет отношение к тромбоцитам, а последующие три - к лейкомассе, состоящей из нейтрофилов эозинофилах, базофилов, моноцитов и лимфоцитов. Если учесть, что лимфоциты не содержат пероксидазную активность, выявляемой использованными методами, а активность пероксидазы базофилов весьма слабая, таким образом, надо полагать, что все три фракции связаны с нейтрофилами, эозинофилами и моноцитами. Если сопоставить полученные данные с фракциями пероксидаз у людей, то следует отметить, что четвертая фракция - это пероксидаза эозинофильное. Таким образом, результаты проведенного диск - электрофоретического разграничения фракций пероксидаз форменных элементов крови у крыс и сравнение с данными, полученными у людей, позволяют высказать мнение, что первая фракция — тромбоцитарная пероксидаза, 4-ая пероксидаза эозинофилов, а 2-ая и 3-ья - нейтрофилов и моноцитов, т. е. фракции миелопероксидазы.
