Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Внутривидовое разнообразие видов рода Picea 9
1.1. Ботаническая характеристика рода Picea 9
1.2. Ель сибирская и ее место в системе рода Picea 10
1.3. Ботанико-лесоводственные особенности ели сибирской 12
1.4. Морфологическая изменчивость ели сибирской 19
1.5. Генетический полиморфизм видов рода Picea 24
1.6. Анализ состояния равновесия и подразделенности популяций видов рода Picea 35
1.7. Генетическая дифференциация популяций видов рода Picea 39
ГЛАВА 2. Район, объект и методы исследования 45
2.1. Географическое положение и природно-климатические условия района исследования 45
2.2. Объект исследования 50
2.3. Материал и методы исследования 54
2.3.1. Материал исследования 54
2.3.2. Методы исследования 54
2.3.2.1. Гидролиз крахмала . 58
2.3.2.2. Приготовление гелевого блока 59
2.3.2.3. Подготовка образцов 60
2.3.2.4. Проведение электрофореза и гистохимическое выявление ферментов 61
2.3.2.5. Фиксация и высушивание крахмальных гелей 63
2.3.3. Генетический контроль ферментов и генетическая символика 64
2.3.4. Расчет основных показателей генетической изменчивости 65
ГЛАВА 3. Генетический контроль ферментных систем ели сибирской 68
ГЛАВА 4. Генетическая структура 86
4.1. Генетическая структура природных популяций ели сибирской 86
4.2. Уровни генетической изменчивости в природных популяциях ели сибирской 100
ГЛАВА 5. Подразделенность и внутривидовая генетическая дифференциация популяций ели сибирской 106
5.1. Оценка равновесия и подразделенность популяций ели сибирской 106
5.2. Внутривидовая генетическая дифференциация популяций ели сибирской 112
Выводы 121
Литература 123
Приложение 153
- Ботанико-лесоводственные особенности ели сибирской
- Генетическая дифференциация популяций видов рода Picea
- Проведение электрофореза и гистохимическое выявление ферментов
- Генетическая структура природных популяций ели сибирской
Введение к работе
Актуальность темы. Одним из приоритетных направлений в современной биологии является изучение популяционно-генетической структуры, внутривидового разнообразия и дифференциации популяций основных лесообразующих видов хвойных. Генетическое разнообразие на популяционном и внутривидовом уровнях - базовая составляющая общего биологического разнообразия, сохранение которого рассматривается наукой в качестве одной из важнейших проблем человечества [Динамика популяционных генофондов..., 2004]. Исследование генетических процессов, протекающих в природных популяциях, имеет не только теоретическое значение для познания закономерностей внутривидовой дифференциации и микроэволюции вида, но и характеризуется важным прикладным аспектом -возможностью обоснования путей сохранения генофонда и селекционного улучшения вида на популяционной основе [Путенихин, 2000; Eriksson, Ekberg, 2001; Ирошников, 2002]. Особую актуальность в связи с этим имеет изучение внутривидовой изменчивости наиболее ценных в хозяйственном отношении видов, к числу которых относится и ель сибирская (Picea obovata Ledeb.), генетическое разнообразие которой остается малоизученным.
К настоящему времени с помощью одного из наиболее распространенных
методов изучения генетической изменчивости хвойных —
электрофоретического анализа изоферментов детально исследованы генетическая структура, разнообразие и дифференциация популяций ели сибирской, произрастающей на Южном Урале, в Приуралье и в прилегающих районах Западной Сибири, в основном в зоне гибридизации ее с елью европейской (Picea abies (L.) Karst) [Путенихин и др., 1995; Krutovskii, Bergmann, 1995; Янбаев и др., 1997; 1999; Политов, Крутовский, 1998; Ганиев, 2000; Янбаев, 2002; Шигапов, 2005]. Основная же часть ареала ели сибирской (Средняя и Восточная Сибирь) изучена в меньшей степени. Проанализированы лишь отдельные популяции этого вида из Красноярского края, Алтая,
Восточно-Казахстанской области, Дальнего Востока [Гончаренко, Потенко, 1991а; Krutovskii, Bergmann, 1995; Ларионова, 1995а, б; Гончаренко, Падутов, 2001; Падутов, 2002; Кравченко и др., 2004; Потенко, 2004а, б].
Отсутствие достаточной информации для большей части ареала ели сибирской не позволяет оценить генетический потенциал вида в целом, уровень генетического разнообразия и степень дифференциации популяций в различных районах его естественного распространения, что крайне необходимо для разработки и непосредственного проведения мероприятий, направленных на максимальное сохранение генетического разнообразия еловых лесов России, создания региональных программ по лесовосстановлению и неистощительному лесопользованию.
Цель исследования - определение структуры, уровня генетического разнообразия и степени внутривидовой дифференциации популяций ели сибирской {Picea obovata Ledeb.) в Средней Сибири.
Задачи исследования:
Провести электрофоретический анализ ферментов в гаплоидной (эндоспермы семян) и диплоидной (вегетативные почки) тканях ели сибирской, установить генетический контроль аллозимного разнообразия ферментов и выявить локусы, пригодные для генетико-популяционных исследований этого вида;
Изучить генетическую структуру и определить основные параметры генетической изменчивости популяций ели сибирской из различных районов ее естественного распространения в пределах исследуемой части ареала;
Выявить характер пространственного распределения генетической изменчивости, оценить уровень подразделенности и степень дифференциации включенных в анализ популяций.
Научная новизна. Впервые с использованием изоферментных маркеров генов определена генетическая структура популяций ели сибирской в неисследованной ранее обширной части ее ареала (Красноярский край, Тыва и Томская область). Установлены уровни внутрипопуляционного и
внутривидового разнообразия, степень и характер генетической дифференциации популяций. Показано, что степень дифференциации популяций в различных районах изученной территории существенно различается. Наиболее дифференцированными оказались популяции ели из горных местообитаний.
Теоретическое и практическое значение. Данные о генетическом разнообразии и межпопуляционной изменчивости ели сибирской в исследованной части ареала вносят существенный вклад в изучение генетических ресурсов и внутривидовой дифференциации этого вида и служат основой для дальнейших генетико-популяционных исследований. Выявленные закономерности в распределении генетической изменчивости могут быть востребованы при разработке региональных программ, направленных на сохранение генетического разнообразия популяционных систем этого вида в процессе их использования и искусственного лесовосстановления.
Защищаемые положения:
Ель сибирская в пределах исследуемой части ареала характеризуется достаточно высоким генетическим разнообразием, слабой подразделенностью и низким уровнем генетической дифференциации популяций;
Популяции ели сибирской из горных местообитаний обнаруживают более существенные различия в генетической структуре по сравнению с популяциями равнинных территорий;
Горные популяций ели сибирской из Тывы, расположенные у южной границы ареала вида, обособлены как от равнинных популяций, так и от остальных горных популяций.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на конференции молодых ученых «Исследования компонентов лесных экосистем Сибири», посвященной 60-летию образования Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН (Красноярск, 2004); на Всероссийской конференции «Структурно-функциональная организация и динамика лесов», посвященной 60-летию Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН и 70-летию образования
Красноярского края (Красноярск, 2004); на III Международной конференции «Проблемы вида и видообразования» (Томск, ТГУ, 2004); на Всероссийской конференции «Природная и антропогенная динамика наземных экосистем» (Иркутск, 2005); на Международной конференции «Лесные экосистемы Северо-Восточной Азии и их динамика» (Владивосток, 2006), на конференции молодых ученых «Исследования компонентов лесных экосистем Сибири», посвященной 50-летию Сибирского отделения РАН (Красноярск, 2007), на I Международном совещании по сохранению лесных генетических ресурсов в Сибири (Барнаул, 2007).
Кроме того, результаты исследований были представлены на отчетной
конференции по Программе Президиума РАН «Динамика генофондов
растений, животных и человека» (Москва, 2005, 2006); на Международной
конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института
общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (Москва, 2006). >
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в
9 опубликованных работах. 7
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 152 ..страницах-' компьютерного текста, содержит 14 таблиц и 24 рисунка. Библиографический список включает 297 наименований, 133 из которых на иностранных языках.
Личный вклад автора. Представленные в диссертации результаты исследований получены непосредственно автором в лаборатории лесной генетики и селекции Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность и признательность научному руководителю д.б.н., проф. Л.И. Милютину за всестороннюю помощь в работе над диссертацией. Автор благодарит к.б.н. А.Я. Ларионову за критические замечания, ценные указания и советы при обсуждении результатов работы и при подготовке диссертации. Автор благодарит к.б.н. А.К. Экарта и к.б.н. Н.В. Орешкову за помощь в проведении экспериментальных работ. Считаю своим приятным долгом выразить
признательность сотрудникам Института общей генетики РАН к.б.н. Д.В. Политову, М.М. Белоконь, Ю.С. Белоконь за методическую помощь на начальных этапах исследования. Автор благодарит д.б.н. СП. Ефремова за помощь в подборе объектов исследования в Томской области, к.б.н. Г.В. Кузнецову и к.б.н. Е.В. Бажину за помощь в сборе экспериментального материала в Западном Саяне, а также к.б.н. О.С. Владимирову за предоставленный экспериментальный материал из Тывы.
Диссертационная работа выполнена при частичной финансовой поддержке РФФИ (гранты №03-04-49719, №06-04-81026, №06-04-48052), РФФИ-ККФН «Енисей-2005» (грант № 05-04-97717), СО РАН (проект № 145), Программы Президиума РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека».
Ботанико-лесоводственные особенности ели сибирской
Ель сибирская - вечнозеленое, однодомное, анемофильное растение. Дерево первой величины, достигающее 30-35 м высоты и до 70-100 см в диаметре [Васильев, Уханов, 1949; Шиманюк, 1967; Бобров, 1978; Гроздова и др., 1986; Коропачинский, Встовская, 2002]. Форма кроны ели в большинстве определителей характеризуется как узкопирамидальная [Крылов, 1927; Комаров, 1934; Бобров, 1978 и др.], в свободном состоянии начинающаяся от основания ствола. Кора серая или красновато-бурая, в молодом возрасте гладкая, затем неглубоко растрескивается и отслаивается тонкими чешуевидными пластинками. Побеги светло-каштановые, с короткими и толстыми волосками по продольным бороздкам или голые. Хвоя темно-зеленая, блестящая, длиной 7-20 мм, толщиной 1 -2 мм, колючая, на конце заостренная, в сечении четырехгранная [Васильев, Уханов, 1949; Бобров, 1978; Гроздова и др., 1986; Крюссман, 1986; Коропачинский, Встовская, 2002], держится на ветвях 5-7 лет [Шиманюк, 1967].
Цветет ель сибирская до 15 дней с середины мая и до начала июня [Коропачинский, Встовская, 2002], на севере цветение начинается в конце мая -начале июня [Абаимов и др., 1997]. Мужские соцветия фиолетово-красные, овальные, 8-12 мм длиной и 6-7 мм шириной, собраны группами на побегах предыдущего года. Женские шишечки красновато-бурого или зеленоватого цвета, почти цилиндрические, 13-20 мм длиной и 6-7 мм шириной, сидят одиночно на концах ветвей и торчат вверх до момента опыления, после опыления постепенно свисают вниз [Шиманюк, 1967; Коропачинский, Встовская, 2002].
Созревание шишек наступает в первой-второй половине сентября в год цветения ели [Коропачинский, Встовская, 2002]. Зрелые шишки красновато коричневые или бурые, висячие, продолговато-яйцевидные или яйцевидно-цилиндрические, длиной 5-8 см и шириной около 3 см; семенные чешуи до 15 мм длины, около 11 мм ширины, выпуклые, по краю закругленные, цельнокрайние; кроющие чешуи 4 мм длины, 1 мм ширины, вверху заостренные, каштановые; семена светло-коричневые, темно-бурые или черноватые, около 4 мм длины и до 2.5 мм ширины, у основания и вверху клиновидные, крыло пленчатое, ланцетное, 10-12 мм длины [Крылов, 1927; Комаров, 1934; Васильев, Уханов, 1949; Шиманюк, 1967; Бобров, 1978; Гроздова и др., 1986; Коропачинский, Встовская, 2002].
Средняя масса 1000 шт семян колеблется в насаждениях ели сибирской в пределах 3.5-5.5 г, энергия прорастания — 47-89%, всхожесть - 69-96%. Всходы с 6-7 семядолями [Шиманюк, 1967; Мамаев, Попов, 1989; Попов, 1999, 2005].
Плодоносить ель сибирская начинает с 15-30 лет [Коропачинский, Встовская, 2002]. Отличительной чертой ее семеношения является преобладание средних по урожайности лет [Каппер, 1954]. Размножается преимущественно семенами, а также вегетативно - за счет укоренения нижних ветвей. За исключением дренированных участков, формирует поверхностную корневую систему [Абаимов и др., 1997]. Живет ель сибирская до 200-300, в отдельных случаях до 500 лет [Шиманюк, 1967; Ареалы деревьев..., 1977; Гроздова и др., 1986; Коропачинский, Встовская, 2002].
Ель сибирская обладает более высокой холодостойкостью, чем ель европейская; она выносит низкие температуры, обычные в северных и восточных регионах, но нередко молодые побеги подмерзают при поздневесенних заморозках, от чего кроны становятся многовершинными [Гроздова и др., 1986]. О высокой холодоустойчивости ели сибирской свидетельствует и тот факт, что северная граница ее ареала проходит по очень высоким широтам: на Кольском полуострове — по 68 с.ш. Примерно на такой же широте северная граница распространения ели пересекает Урал [Мамаев, Попов, 1989] и проходит вдоль Западно-Сибирской равнины [Абаимов и др., 1997]. По долине р.Енисей ель поднимается на север до 69о20 с.ш., в Северной Якутии в бассейне р. Оленек - до 70с.ш. [Рысин, Савельева, 2002].
Будучи не слишком требовательной к богатству почвы элементами минерального питания, ель сибирская в то же время избегает очень бедные почвы, что позволяет отнести ее к категории мезотрофов. Она хорошо растет на свежих увлажненных суглинистых и плодородных супесчаных почвах, не выносит засоления почвы, плохо переносит загрязнение атмосферного воздуха сернистыми соединениями. По отношению к влаге — мезофит, переувлажнение почвы переносит плохо, при заболачивании ухудшает рост и отмирает [Ареалы деревьев..., 1977; Гроздова и др., 1986; Булыгин, 1991; Абаимов и др., 1997; Коропачинский, Встовская, 2002; Рысин, Савельева, 2002].
Ель сибирская принадлежит к числу теневыносливых пород, и это делает ее исключительно сильным конкурентом по отношению к другим лесообразующим породам. Поселяясь под полог светолюбивых "пионерных" пород (сосны, березы, осины), ель со временем догоняет их по высоте и вытесняет из состава древостоев как непосредственным затенением взрослых деревьев, так и созданием условий, неприемлемых для развития подроста; в еловом лесу могут возобновляться только теневыносливые породы: пихта, липа, кедр. Помимо светового режима ель меняет и другие условия подпологовой среды. Задерживая кронами до 40% осадков [Каппер, 1954], ель, с одной стороны, уменьшает поступление влаги на поверхность почвы, а с другой - увеличивает влажность воздуха. Существенно меняется температурный режим и атмосферы, и почвы. Все это делает ель одним из сильнейших лесообразователей [Рысин, Савельева, 2002].
Как эдификатор ель сибирская проявляет себя сильнее в европейской части ареала. В Сибири она реже образует монодоминантные леса (чаще в долинах рек) и является непременным компонентом древостоев темнохвойной тайги. На большей части своего ареала растет в виде незначительной примеси в лесах, образуемых пихтой сибирской и кедром сибирским, иногда в речных поймах совместно с лиственницей и лиственными породами. На Северном Урале ель сибирская поднимается в горы до 860 м н. ур. м., на Алтае и в Саянах — до 1800-2000 м, наиболее высоко — на юге Тывы (до 2100 м н. ур. м.) [Шиманюк, 1967; Коропачинский, Федоровский, 1969; Ареалы деревьев..., 1977; Коропачинский, Встовская, 2002].
Современный ареал ели сибирской простирается от севера Скандинавии через северо-восточные районы европейской части России, Урал и всю Сибирь (кроме крайнего севера) до побережья Охотского моря и среднего Амура. За пределами России ель сибирская растет в северной части Монголии и Китая (рис. 1.1) [Шиманюк, 1967; Ареалы деревьев..., 1977; Бобров, 1978; Гроздова и др., 1986]. Предположительно остаточный оторванный ареал этого вида (или же ближайшего к нему замещающего P. alpestris) лежит в высокогорьях Швейцарских Альп (кантон Граубюнден) и в Западных Карпатах [Бобров, 1978].
Среднеевропейские высокогорные популяции ели сибирской, так же, как и бореальные скандинавско-кольские, а отчасти и популяции на северо-востоке европейской части России находятся под гибридным воздействием западноевропейской P. abies [Бобров, 1978].
Генетическая дифференциация популяций видов рода Picea
Для количественной харакиеристики степени генетических различий между популяциями по данным электрофоретического анализа было разработано несколько коэффициентов [Cavalli-Sforza, Edvards, 1967; Nei, 1972, 1978; Rogers, 1972; Gregorius, 1978; Животовский, 1979]. Наиболее удобным для оценки генетической дифференциации популяций оказался коэффициент генетической дистанции (расстояния) D М. Ней [1972, 1978].
При использовании метода, предложенного М. Ней, рассчитываются две величины: генетическое сходство I, оценивающее долю структурных генов, которые идентичны в обеих популяциях, и генетическое расстояние D, указывающее на среднее число замен аллелей в каждом локусе, произошедших за время раздельной эволюции двух популяций. Замены аллелей имеют место тогда, когда в результате мутаций аллели в отдельных локусах замещаются другими аллелями или когда сразу замещается весь набор аллелей. Этот метод учитывает то обстоятельство, что замены аллелей могут быть неполными: в какой-то части популяции новый аллель может вытеснить старый, который, тем не менее, с большей или с меньшей частотой продолжает присутствовать в популяции [Айала, 1984].
Генетическое сходство I может принимать значения от нуля, когда у сравниваемых пар популяций нет общих аллелей, до единицы, когда частоты всех аллелей одинаковы в обеих популяциях. Генетическое расстояние D варьирует от нуля до бесконечности, поскольку в процессе эволюции, протекающей в течение длительного времени, аллели в каждом локусе могут неоднократно полностью замещаться.
Известно, что в большинстве случаев генетические расстояния, вычисленные на основе результатов анализа изоферментной изменчивости, хорошо отражают как степень дивергенции популяций, так и филогенетические отношения между различными таксонами растений, в том числе и у хвойных [Крутовский и др., 1989].
По расчетам К.В. Крутовского с соавторами [1989] в среднем для разных видов хвойных генетическое расстояние Нея равняется: между выборками из одной популяции - 0.007, между рядом расположенными популяциями - 0.008, между удаленными друг от друга популяциями - 0.013, между расами - 0.029, между подвидами - 0.036, между видами - 0.185.
Значение генетического расстояния между популяциями у разных видов рода Рісеа в зависимости от их удаленности друг от друга, различий в экологических условиях произрастания варьирует довольно значительно (табл. 1.1).
Для сравниваемых пар популяций P. abies из Восточной Европы (Карпатский, Белорусско-Балтийский и Северороссийский регионы) значение D колебалось от 0.003 до 0.035. Наибольшие генетические различия выявлены между географически удаленными карпатскими и северороссийскими популяциями ели обыкновенной (D в среднем составило 0.025), тогда как белорусско-балтийские популяции отделились от карпатских и северороссийских на величину равную 0.014 [Гончаренко, Падутов, 2001; Падутов, 2002]. Четкая взаимосвязь генетической и географической дифференциации обнаружена ранее при изучении генетической структуры ели европейской в Италии [Giannini et al., 1991] и по всему ареалу вида в Европе [Lagercrantz, Ryman, 1990].
Аналогичная картина прослеживается у P. obovata. Значение генетического расстояния D для географически удаленных зауральских и саяно-алтайских популяций P. obovata составило 0.060-0.077 [Гончаренко, Падутов, 2001; Падутов, 2002], для сибирских и дальневосточных популяций -0.037-0.055 [Потенко, 20046], в то время как у географически близких популяций этого вида значение генетического расстояния не превышало 0.010 [Kratovskii, Bergmann, 1995; Гончаренко, Падутов, 2001; Падутов, 2002; Кравченко и др., 2004; Потенко, 20046].
Следует однако отметить, что генетическое расстояние достоверно было связано с географическим лишь в тех случаях, когда оно превышало 100-200 км [Yeh, O Malley, 1980; Wheeler, Guries, 1982; Steinhoff et al., 1983; Furnier, Adams, 1986; Moran et al., 1988]. При меньших расстояниях между выборками эта связь не обнаруживалась [Plessas, Strauss, 1986; Alden, Loopstra, 1987; Boyle, Morgenstem, 1987; Merkle, Adams, 1987], локальная дифференциация могла быть значительно выше, чем между регионами [Крутовский и др., 1989]. У P. mariana генетическая дифференциация популяций в пределах регионов (D = 0.012) близка к межрегиональной (D = 0.014) [Yeh et al., 1986]. Кроме того, у этого вида выявлена значительная генетическая дифференциация разновысотных популяций. Большие различия в генетической структуре наблюдались между всеми сравниваемыми парами горных популяций со средним значением D = 0.027. Равнинные популяции P. mariana были дифференцированы в меньшей степени (D = 0.016) [O Reilly et al., 1985].
Высокие значения межпопуляционных генетических расстояний у P. schrenkiana (D = 0.011-0.081), по-видимому, вызваны изоляцией популяций горными хребтами Тянь-Шаня [Гончаренко и др., 1992]. Однако, у P. orientalis, произрастающей в горных условиях Главного Кавказского хребта, значение генетического расстояния D между популяциями составило всего 0.011 [Потенко, Кривко, 1993; Гончаренко, Падутов, 2001].
Ю.А. Янбаев с соавт. [1997] при исследовании дифференциации ели сибирской на Южном Урале выделил в ранг самостоятельной подгруппы высокогорные популяции ели сибирской на горе Иремель, произрастающие на высоте 1300-1350 м н. ур. м., что вполне согласуется с данными фенотипического анализа популяций ели на Южном Урале [Путенихин, 2000].
Ель (Picea abies (L) Karst), произрастающая в высокогорной части Карпат, достаточно хорошо дифференцируется от предгорной по морфологическим признакам — форме семенной чешуи [Голубец, 1968]. В связи с этим, некоторые исследователи придавали высокогорным популяциям видовой статус {Picea montana Schur.). Однако на основании сравнительно незначительного уровня генетической дифференциации (D = 0.024), Г.Г. Гончаренко и В.В. Потенко [1991а] относят ее лишь к рангу географической расы в пределах вида P. abies.
Проведение электрофореза и гистохимическое выявление ферментов
По окончании электрофореза из стартовых щелей гелевого блока пинцетом удаляли кусочки Whatman ЗММ, а сам гель извлекали из кюветы и помещали в специальное устройство для разрезания. Затем гель накрывали стеклянной пластинкой и при помощи тонкой рыболовной лески разрезали на несколько горизонтальных срезов толщиной 1-1.5 мм (рис. 2.8), каждый из которых помещали в отдельную кювету, содержащую инкубационный раствор для гистохимического окрашивания анализируемого фермента.
Инкубационный раствор обычно содержит буфер, обладающий определенным рН, в котором исследуемый фермент проявляет максимальную активность; субстрат, на который действует этот фермент и краситель, вступающий в соединение с продуктом ферментативной реакции. При необходимости в инкубационный раствор добавляли кофермент и активатор.
Гистохимическое окрашивание проводили по стандартным прописям с некоторыми модификациями [Brewer, 1970; Shaw, Prasad, 1970; Bergmann, 1974; Yeh, O Malley, 1980; Conkle et al., 1982; Vallejos, 1983; Millar, 1985; Гончаренко, Падутов, 1988; Manchenko, 1994]. Состав инкубационных сред для гистохимического окрашивания ферментов представлен в приложении.
После наиболее четкого проявления фракций окрашиваемого фермента гель отмывали дистиллированной водой от окрашивающего раствора и заливали фиксирующей жидкостью, следующего состава: 70 мл уксусной кислоты (лед.) и 75 мл глицерина в 1 литре водного раствора. Фиксацию гелей проводили в течение 10 часов. Одновременно с гелем, но в отдельной ванночке, в 7.5%-ном растворе глицерина вымачивали полоски целлофана. Затем гель с двух сторон покрывали целлофаном так, чтобы края были на 2.5-3 см свободными, укладывали на стеклянную пластинку, удаляли пузырьки воздуха и сушили под вентилятором. Предварительно целлофан прокалывали в нескольких местах. Высушенные таким образом гели могут храниться в течение нескольких лет.
В настоящее время, при наличии современной оргтехники, гели после проявления сканируют и записывают как компьютерные видеоизображения.
Генетический контроль выявленных в процессе электрофореза вариантов ферментов устанавливали на основании изучения их сегрегации (расщепления) среди гаплоидных мегагаметофитов семян отдельных деревьев. В соответствии с менделевскими закономерностями при моногенном наследовании у деревьев, гетерозиготных по какому-либо локусу, аллельные варианты ферментов должны сегрегировать в соотношении 1:1. Соответствие наблюдаемых соотношений генотипов ожидаемым по закону Харди-Вайнберга определяли с помощью критериях [Айала, 1984].
Для обозначения ферментов использовали наиболее часто употребляемые в литературе названия, записываемые в сокращенном виде прописными латинскими буквами. Локусы, кодирующие эти ферменты, обозначали теми же буквами, но строчными, кроме первой, которая остается без изменений. Нумерацию локусов производили в порядке уменьшения электрофоретической подвижности кодируемых ими зон ферментов. Локус, контролирующий наиболее подвижную зону фермента, обозначали цифрой 1, менее подвижную по сравнению с ней цифрой 2 и т.д. Аллели обозначали следующим образом: наиболее часто встречающийся аллель локуса получал цифровой символ 100, остальным аллелям присваивали номера в соответствии с их электрофоретической подвижностью относительно аллеля 100, например, 104, 102, 98 и т.д. Результаты электрофореза считывали в виде аллозимных фенотипов, соответствующих многолокусным генотипам. Гомозиготы обозначали как 100/100, 98/98 и т.п., гетерозиготы как 104/100, 100/98 и т.д. Фенотипически не проявляющиеся аллельные варианты ферментов обозначали п.
Для оценки уровня генетического разнообразия рассчитывали следующие общепринятые в генетико-популяционных исследованиях показатели: процент полиморфных локусов при 95%-ном (Р95) и 100%-ном (Рюо) критериях полиморфности, среднее число аллелей на локус (А), среднюю наблюдаемую (Н0) и ожидаемую (Не) гетерозиготносте, эффективное число аллелей (пе).
Показатель Р рассчитывали путем деления числа полиморфных локусов на общее число исследуемых локусов, а показатель А — путем деления общего числа выявленных аллелей на число изученных локусов.
Наблюдаемую гетерозиготность (Н0) вычисляли путем деления числа гетерозиготных деревьев на общее число деревьев, проанализированных по данному локусу.
Генетическая структура природных популяций ели сибирской
Генетическая структура популяции или вида в целом является эволюционно сложившейся характеристикой, которая может быть описана как в частотах генотипов, так и в частотах аллелей, формирующих эти генотипы. Большинство исследователей обычно используют более удобную форму описания генетической структуры в виде аллельных частот. Это обусловлено тем, что различных аллелей в популяции всегда значительно меньше чем генотипов. Кроме того, они в меньшей степени зависят от размера выборки по сравнению с частотами генотипов, соотношение которых в отдельных выборках может в силу разных причин, чаще всего случайных, отклоняться от ожидаемых в соответствии с законом Харди-Вайнберга [Гончаренко, Падутов, 2001].
В процессе электрофоретического анализа 12 ферментных систем в 14-ти природных популяциях ели сибирской из различных районов ее естественного распространения в Красноярском крае, Тыве и Томской области выявлено 65 аллельных вариантов, находящихся под контролем 22 ген-ферментных локусов. Полностью мономорфными во всех включенных в исследование популяциях ели сибирской оказались лишь локусы Sod-І и Pgm-1, остальные локусы (Got-1, Got-2, Got-3, Lap-1, Lap-2, Skdh-1, Skdh-2, Mdh-1, Mdh-2, Mdh-3, Idh-2, Sod-2, Fdh, Gdh, Pgm-2, Pgi-J, Pgi-2, Pepca, 6-Pgd-2, 6-Pgd-3) были изменчивы хотя бы в одной из популяций. Семь локусов: Got-1, Mdh-1, Mdh-2, Sod-2, Pgi-J, Pepca и 6-Pgd-3 являются диаллельными, то есть представлены в популяциях двумя аллелями. Локусы Got-3, Lap-2, Skdh-2, Fdh, Gdh, 6-Pgd-2 имеют no 3 аллеля. В локусах: Got-2, Skdh-J, Pgm-2, Pgi-2 выявлено no 4 аллеля. Максимальное число аллелей (5 аллелей) отмечено в локусах Lap-J, Mdh-3, Idh-2. В локусах Got-2, Lap-1, Skdh-1, Mdh-3, 6-Pgd-3 обнаружены аллели, не имеющие фенотипического выражения, так называемые нуль-аллели, обозначенные нами буквой п. Частоты встречаемости всех выявленных аллелей по всем проанализированным локусам в каждой из включенных в исследование популяций ели сибирской приведены в таблице 4.1.
Наиболее низкий уровень полиморфизма среди полиморфных локусов обнаруживают локусы: Got-1, Mdh-1, Mdh-2, Pgi-1, Pepca, 6-Pgd-3. Частота наиболее распространенного аллеля у каждого из этих локусов превышает значение 0.95. Это означает, что при 95%-ном критерии полиморфности перечисленные выше локусы классифицируются как мономорфные. К полиморфным их можно отнести лишь при 100%-ном критерии полиморфности. Среднее значение наблюдаемой гетерозиготности для этих локусов варьирует от 0.0027 до 0.0186. Минимальные значения показателя имеют локусы Mdh-1, Mdh-2 и Pepca.
Локусы Got-2, Got-3, Lap-1, Skdh-2, Mdh-3, Idh-2, Pgm-2 и Pgi-2 характеризуются средним уровнем полиморфизма (табл. 4.1). Следует однако отметить, что некоторые из них в отдельных популяциях могут быть слабополиморфными или даже мономорфными. Наиболее изменчивыми среди этих локусов являются локусы Pgi-2, Got-3, Skdh-2, Mdh-3, Pgm-2 и Lap-1, (средняя гетерозиготность колеблется от 11.7% до 27.1%), наименее изменчивыми локусами - Got-2 и Idh-2 (средняя гетерозиготность не превышает 6%).
Самый высокий уровень полиморфизма обнаруживают локусы Lap-2, Skdh-1, Sod-2, Fdh, Gdh и 6-Pgd-2. Альтернативные аллели указанных локусов встречаются в популяциях с частотой, достигающей в ряде случаев 25-30% и более. Так, например, в одной из тувинских популяций ели (Хандагайты 2) наиболее распространенный аллель Sod-2100 имеет частоту, равную 0.575, а альтернативный ему аллель Sod-2 — 0.425. Средняя для изученных популяций ели гетерозиготность этого локуса оказалась самой большой (0.431) среди полиморфных локусов (табл. 4.1). У других локусов, относящихся к группе высокополиморфных, средняя частота гетерозиготных генотипов варьирует от 0.3316 (6-Pgd-2) до 0.4140 (Skdh-1).
Из приведенных в таблице 4.1 данных видно, что 30 из 65 (46%) аллелей, выявленных у ели сибирской, встречаются во всех изученных популяциях. Двадцать два общих аллеля (по одному в каждом локусе), обозначенные цифровым символом 100, относятся к категории наиболее распространенных аллелей. Средние частоты этих аллелей в совокупной выборке проанализированных деревьев варьируют от 0.689 (Sod-2100) до 1.000 (Sod-1100, Pgm-1100). Другие общие для исследованных популяций аллели (Lap-2104, Skdh-l55, Skdh-277, Sod-2178, FdK175, Gdh80, Pgi-2116, 6-Pgd-263) имеют более низкие в среднем частоты встречаемости: от 0.114 {Skdh-277) до 0.311 (Sod-2178). Широко представлены в популяциях и аллели Pgm-294, Got-386, Mdh-З62. Они встречаются в 13 из 14 популяций, хотя и с различной частотой. Аллели Pgm-294 и Got-З86 отсутствуют лишь в одной из тувинских популяций (Хандагайты 2), а аллель Mdh-З62 - в популяции Арадан.
Двадцать восемь обнаруженных у ели сибирской аллелей являются редкими. Средние частоты 24-х из них в совокупной выборке деревьев составляют менее 1%. У четырех аллелей частоты варьируют от 1.2% до 1.5% (табл. 4.1). Десять редких аллелей (Got-2n, Got-283, Got-3109, Mdh-1109, Mdh-272, Mdh-3142, Mdh-З", Pgm-2102, Pgm-297, Рерса95) можно рассматривать как уникальные, поскольку они встречаются только в какой-либо одной из популяций.
Сравнительный анализ популяций показал, что, несмотря на значительное сходство их генетических структур, обусловленное большим числом общих аллелей, многие из которых имеют высокую частоту встречаемости во всех популяциях, практически каждая из исследованных популяций ели сибирской характеризуется той или иной степенью своеобразия по числу, составу и частотам встречаемости аллелей. Так, общее число выявленных в отдельных популяциях аллелей варьирует от 36 до 49, редких - от 2 до 10, уникальных -от 0 до 4 (табл. 4.2). Наибольшее аллельное разнообразие наблюдается в популяции ели из Енисейского района Красноярского края (Ялань). Как видно из данных, представленных в таблице 4.2, более высокое по сравнению с другими популяциями аллельное разнообразие в этой популяции обеспечивается в основном за счет нечастых и редких аллелей. Доля редких аллелей выявленных в популяции Ялань составляет 20.41%. Кроме того, в этой популяции обнаружено самое большое число уникальных аллелей (8.16%). В популяциях, расположенных южнее Ялани, наблюдается постепенное уменьшение аллельного разнообразия. Наиболее низкое число аллелей выявлено в популяциях из южных горных районов исследуемой части ареала ели сибирской (Хандагайты 1, Хандагайты 2, Туран, Ручей, Арадан). Существенно варьировали в изученных популяциях ели и частоты выявленных аллелей. В ряде случаев различия в частотах достигали 20% и более. Однако выраженного географического тренда в изменении частот аллелей не прослеживается ни для одного из проанализированных полиморфных локусов.
Анализ изменчивости частот аллелей с помощью %2-теста на гетерогенность показал, что наблюдаемая гетерогенность аллельных частот у ели сибирской в исследованном регионе является статистически достоверной, причем на очень высоком уровне значимости (%2 = 900.589, df = 559, Р 0.001). Наиболее значительный вклад в формирование межпопуляционного аллельного разнообразия вносят локусы Got-1, Got-2, Got-3, Lap-1, Lap-2, Skdh-1, Skdh 2, Idh-2, Gdh, Pgm-2, 6-Pgd-2 (табл. 4.3).
