Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Систематика рода Polygonum L s. str 9
1.1. Подсекция Polygonum 11
1.2. Подсекция Maritima Tzvel 19
1.3. Подсекция Patula Tzvel 21
1.4 Подсекция Humifusa Tzvel 25
1.5. Подсекция Salsuginea Tzvel 25
1.6. Подсекция Arenaria Tzvel 27
1.7. Подсекция Floribunda Tzvel 27
Глава 2. Значение гибридизации в эволюции рода Polygonum L s. str 28
Глава 3. Современная систематика как интегрирующая наука. молекулярные методы в систематике растений 33
3.1. Маркеры полиморфизма ДНК 38
3.2. Биохимические и молекулярно-биологических методы в систематике и филогении Polygonum L 50
Глава 4. Материалы и методы 53
4.1 Выделение ДНК 57
4.2. RAPD-анализ полиморфизма ДНК 59
4.3. ISSR-анализ полиморфизма ДНК 60
4.4. Определение нуклеотидных последовательностей ITS1-2 участка рибосомного оперона яДНК оперона яДНК 60
4.5. Определение нуклеотидных последовательностей trnGuuc интрона и trnSUGA-trnGGCC участка хлоропластного генома 62
4.6. Электрофорез в агарозном геле 63
4.7. Очистка ПЦР продуктов в агарозных гелях и определение нуклеотидных последовательностей 63
4.8. Филогенетический анализ 64
4.9. Анализ вторичной структуры 65
Глава 5. Систематика рода polygonum l s. str. по данным молекулярного маркирования методами RAPDHISSR 66
5.1. Внутривидовая генетическая вариабельность видов Polygonum L s. str 67
5.2. Генетический полиморфизм близкородственных видов P.aviculare, P. arenastrum и P. calcatum 68
5.3. Оценка отношений между близкородственными видами P.aviculare, P. arenastrum и P. calcatum 74
5.4. Генетический полиморфизм P. patulum, P. arenastrum и их гибридов 79
5.5. Оценка отношений между P. patulum и P. arenastrum 80
5.6. Генетический полиморфизм P.salsugineum, P.aschersonianum, P.patulum, P.aviculare,
P.arenastrum и P.samarense 83
5.7. Оценка отношений между видами P. salsugineum, Р. aschersonianum, P. patulum, P. aviculare, P. arenastrum и P.samarense 92
5.8. Генетический полиморфизм P. aviculare, P.boreale и Р.га/7 96
5.9. Оценка отношений между видами
P. aviculare, P.boreale и P.raii. 98
5.10. Генетический полиморфизм P. novoascanicum, P.arenarium и их гибридов 100
5.11. Оценка отношений между видами
P. novoascanicum, P.arenarium 103
Глава 6. Филогения рода polygonum l s. str. на основе исследования нуклеотидного полиморфизма ядерных и хлоропластных участков генома 104
6.1. Характеристика гена 5.8S и транскрибируемых спейсерных участков (ITS1, ITS2) рибосомной ДНК представителей Polygonum L s. str 104
6.2. Характеристика участков хпДНК (tmSUGA-trnGGCC участка и интрона гена trnGuuc) представителей Polygonum L. s. str...106
6.3. Филогенетические связи в роде Polygonum L. s. str 108
6.4. Анализ вторичной структуры ITS2 ядерной рибосомной ДНК 112
Выводы 115
Список литературы 117
Приложение 151
- Подсекция Polygonum
- Маркеры полиморфизма ДНК
- RAPD-анализ полиморфизма ДНК
- Внутривидовая генетическая вариабельность видов Polygonum L s. str
Введение к работе
Актуальность проблемы. Однолетние виды Polygonum L s.str. (Polygonaceae Juss.), не раз служили объектом специальных исследований (Комаров, 1936; Клоков, 1952; Ворошилов, 1954; Scholz, 1958, 1959, 1960; Styles, 1962; Webb, Chater, 1964; Schmid, 1983; Wolf, McNeill, 1986; Webb et al., 1993; Цвелев, 1979, 1989, 1996; Юрцева, 2003; Юрцева, Крамина, 2003, 2004). Однако, учитывая чрезвычайный полиморфизм спорышей, следует отметить, что остается множество неразрешенных систематических и таксономических вопросов, нет ясности в понимании числа и объемов видов. Трудности в распознавании видов вызваны высокой пластичностью морфологических признаков, связанной с различиями в условиях питания, увлажнения и степени вытаптывания. Другая причина - распространение спорышей по всему земному шару, разнообразие эколого-климатических условий в пределах обширных ареалов видов, что привело к образованию множества фенотипически разнообразных рас. Предполагается, что видовое разнообразие спорышей в большей мере возникло в результате межвидовой гибридизации нескольких исходных видов. Благодаря преобладанию самоопыления и большой семенной продуктивности новые гибриды, многим из которых присвоен видовой ранг, способны возобновляться, не смешиваясь с исходными видами, и увеличивать свою численность. Они либо занимают переходное местообитание, либо вытесняют родительские виды из их природных местообитаний.
Исключительная роль в образовании гибридов принадлежит Polygonum aviculare L. s. str. Широкий ареал вида, перекрывающий ареалы большинства других, большая экологическая амплитуда,
наличие разнообразных цитотипов позволяют P. aviculare выступать в качестве одного из родителей.
До сих пор выводы о межвидовой гибридизации спорышей основывались на анализе морфологической изменчивости и хромосомных чисел предполагаемых родителей и гибридов. Однако для получения дополнительных свидетельств гибридизации необходимо использование молекулярных методов анализа. В настоящее время весьма актуально и привлечение молекулярно-генетического подхода для ревизии системы и филогении рода Polygonum.
Цели и задачи исследования. Основной целью работы является молекулярный анализ меж- и внутривидового полиморфизма, сравнение уровней вариабельности геномов в популяциях спорышей, состоящих из нескольких видов, оценка возможности их межвидовой гибридизации и сопоставление результатов молекулярной филогении с с существующей системой рода Polygonum (Цвелев, 1979, 1996), морфологическими признаками и известными хромосомными числами, что позволит уточнить природу полиплоидных видов группы. Данные методы и подходы широко приняты в мировой практике при решении подобных задач, однако в секции Polygonum рода Polygonum осуществлены впервые.
В связи с поставленными целями решались следующие задачи:
Используя молекулярно-генетического методы (ISSR- и RAPD-анализ) определить уровни внутри- и межвидовой вариабельности у представителей рода Polygonum L s.str.
Рассмотреть проблемы таксономии и идентификации представителей секц. Polygonum, подсекции Polygonum (Цвелев,
1979). Установить какие виды участвовали в формировании Р. arenastrum, P.aschersonianum, P. boreale, P. samarense.
Охарактеризовать последовательности внутренних транскрибируемых спейсерных участков (ITS1, ITS2) рибосомной ДНК и гена 5,8S рРНК у видов Polygonum L s.str. Исследовать нуклеотидный полиморфизм данных последовательностей.
Определить последовательности участка trnS-trnG и интрона гена тРНК глицина хлоропластной ДНК Polygonum L s.str. и оценить полиморфизм данных последовательностей.
Проанализировать информативность исследуемых участков ядерной и хлоропластной ДНК для молекулярно-эволюционного анализа.
Построить филогенетические деревья по последовательностям ITS1-2, сравнить их топологии и оценить соответствие полученных результатов с существующей системой рода Polygonum (Комаров, 1936; Цвелев, 1979, 1996).
Проанализировать вторичную структуру ITS2 яд-рДНК и оценить возможность ее использования как дополнительного маркера для молекулярно-эволюционного анализа.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Впервые применены молекулярно-генетических методы для решения эволюционно-таксономических задач в роде Polygonum L s.str. Актуальность такого подхода связана с повышенной морфологической изменчивостью, сложностью идентификации видов и недостаточным пониманием видообразовательных процессов в группе. Впервые с использованием систем молекулярного маркирования проведен анализ генома видов Polygonum L. s.str., для которого характерна сетчатая эволюция. Определены уровни внутри- и межвидового полиморфизма,
различия по геномной вариабельности у видов рода, а также показана гибридная природа некоторых видов. Полученные данные сопоставлены с уже существующими морфологическими представлениями о гибридизации внутри рода.
Впервые проанализирован полиморфизм нуклеотидных последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1, ITS2 и гена 5.8S рРНК ядерного рибосомного оперона, участка trnSGGA-trnGuuc хлоропластного генома, интрон гена trnG у видов Polygonum L s.str. Получены дендрограммы, отражающие филогению группы по последовательности ITS1-2; положение видов в них сопоставлено с положением этих видов в системе рода Polygonum. Построена модель вторичной структуры ITS2 яд-рДНК.
Показана перспективность использования ISSR- и RAPD-маркирования как источника дополнительной информации при изучении гибридизации внутри рода.
Автор выражает искреннюю признательность и благодарность научному руководителю Ю.К. Виноградовой; О.В. Юрцевой, А.В. Троицкому, В.К. Бобровой, И.А. Милютиной, М.С. Игнатову, И.А. Шанцеру, О.А. Новожиловой, Л.П. Арефьевой, В.Ф. Семихову, Д.Е. Герус за ценные замечания, обсуждение, а также за содействие при выполнении экспериментальных исследований.
Подсекция Polygonum
Включает в себя преимущественно сорные растения с тонкими листовыми пластинками. Верхние листья часто сильно уменьшенные, но всегда длиннее цветков. Плоды 1,2-3,5 (4) мм дл., зрелые обычно матовые от продольных морщинок или слабо блестящие. В подсекции Polygonum выделяют P.aviculare L. (P.heterophyllum Lindm.), P. neglectum Besser, P. calcatum Lindm., P. arenastrum Boreau (P. aequale Lindm.), P.monspeliense Thieb. ex
Pers., P. boreale (Lange) Small, P. rurivagum Jord. ex Boreau, P. patuliforme Worosch., P. propinquum Ledeb. (Boreau, 1857; Lindman, 1904, 1913, Цвелев, 1996) и еще несколько видов, самостоятельность которых вызывает сомнение. Большинство из них распространены в полярных и умеренных областях северного полушария и обладают сходной экологией, нередко произрастая совместно по нарушенным местообитаниям и газонам, на незадернованных пространствах или сильно утоптанных местах, вдоль шоссе и грунтовых дорог. Некоторые являются полевыми сорняками. В эту группу также входят виды, имеющие пастбищное значение, а также применяемые в качестве лекарственных средств (как кровоостанавливающее (гинекология), противовоспалительное, диуретическое, капилляроукрепляющее, спазмолитическое и т.д.), для получения красителей и пр. (Головкин, 2001).
Многие представители данной подсекции обладают мелкими, но устойчивыми отличиями в строении цветков и плодов, которые сохраняются в культуре и передаются из поколения в поколение (Ворошилов, 1954). Это дает основание считать их самостоятельными видами. Но иногда при совместном произрастании различия стираются, и можно встретить растения с промежуточными признаками или их мозаичной комбинацией. Такие ситуации наблюдали для P. aviculare и P. calcatum, которые обладают стойкими признаками, и P. arenastrum, предполагаемого их гибрида. По строению околоцветника, форме роста и листьев P.arenastrum сходен с P. calcatum, но по длине долей околоцветника, размерам плодов приближается к P. aviculare (Юрцева, Крамина, 2003).
P. aviculare L. s. str. (Linnaeus, 1753) - циркумбореальный плюризональный вид, преимущественно континентальный, но изредка встречается по морским берегам. Мясистые листья приморских рас послужили причиной описания многих разновидностей P. aviculare, однако, в культуре этот признак исчезает, и В. Styles (1962) не считает нужным выделять их в особый таксон. Вид произрастает на богатой влажной почве по нарушениям - газонам, в садах, огородах, на обочинах дорог. Для него характерны вертикальные или восходящие главные побеги, выраженная гетерофиллия, локализация цветков на концах побегов, относительно мелкие цветки и плоды, околоцветники, расчлененные на 2/3 - 3/4, 8 тычинок, почти правильно трехгранные плоды с полосато-бородавчатой поверхностью и выступающей из околоцветника верхушкой. У него два типа плодов — летние, темно-бурые, с полосато-бородавчатым кожистым околоплодником, и осенние, гладкие, с тонким околоплодником, выступающие из околоцветника. В Мурманской области и в Карелии P. aviculare часто уже летом быстро дает осенние плоды, созревающие вместо месяца за 2 недели, что можно связать с длинным днем на Севере. (Юрцева и др., 1999; Юрцева, Крамина, 2003).
P. calcatum Lindm. произрастает на песчаной почве по дорогам и в трещинах асфальта, на сильно вытаптываемых газонах. Для него характерно множество отходящих от основания распростертых побегов, отсутствие гетерофиллии, околоцветник, свободные доли которого составляют 1/2 общей длины, 5 тычинок, неравно-трехгранные или почти двухгранные плоды с гладкой поверхностью, полностью спрятанные в околоцветнике.
P. arenastrum Boreau растет на легкой суглинистой или песчаной почве, вдоль грунтовых дорог и по нарушенным газонам. Отличается большой изменчивостью признаков. По общим размерам и параметрам занимает промежуточное положение между
P. aviculare и P. calcatum. Однако по результатам многомерного анализа признаков достаточно хорошо обособлен от них, что говорит о его морфологическом своеобразии (Юрцева, Крамина, 2003). Судя по частому нахождению в природе совместно с выше перечисленными видами, характеру изменчивости признаков, часто пониженной фертильности пыльцы, числам хромосом он вполне может быть их гибридом, а более крупные околоцветники и плоды его могут быть проявлением гетерозиса (Grant, 1975; Юрцева, Крамина, 2003)
Взгляд на ранг выше перечисленных трех таксонов и взаимоотношения между ними различны. Видовой ранг за ними признавал С. Lindman (1904, 1913), описавший для территории Швеции P. heterophyllum Lindm. (= P. aviculare L), P. aequale Lindm. (= P. arenastrum Boreau) и P. calcatum Lindm. На территории России их также рассматривают в ранге видов (Цвелев, 1979, 1989, 1996; Тупицына, 1992; Юрцева, Крамина, 2003).
На территории Европы и Северной Америки обычно признают 2 вида — P. aviculare и P. arenastrum, включая P. calcatum в состав последнего (Styles, 1962; Webb, Chater, 1964; Scholz, 1977; Schmid, 1983; Wolf, McNeill, 1986, 1987; Akeroyd et al., 1993).
Маркеры полиморфизма ДНК
Полиморфизм обнаружен в ядерной, митохондриальной и хлоропластной ДНК, в кодирующей и не кодирующей участках, в ее уникальных и повторяющихся последовательностях. Кодирующая часть ДНК, которая у растений составляет очень малую часть всего генома, является более консервативной, тогда как некодирующая часть более изменчива, так как в меньшей степени подвержена селективным ограничениям (Nei, 1987).
В зависимости от методов получения маркеры подразделяют на полученные с помощью рестриктаз, полученные с помощью ПЦР и маркеры смешанного типа.
Мини- и микросателлиты. Значительная часть повторяющейся ядерной ДНК всех эукариот состоит из тандемно повторяющихся копий последовательностей. Мутации типа инсерции/делеции, возникающие из-за сдвига и неточного спаривания цепей ДНК при репликации и из-за неравного кроссинговера, изменяют число повторов, т.е. общую длину такой многокопийной последовательности (Levinson, Gutman, 1987). Подобная изменчивость, наблюдаемая для разных индивидуумов, получила название «варьирующего числа тандемных повторов» (англ. VNTR - variable number of tandem repeats). В семействах таких тандемных повторов особое внимание исследователей в качестве генетических маркеров получили минисателлиты, состоящие из повторяющихся копий длиной от 9-Ю до сотни нуклеотидов каждая (Jeffreys et al., 1985 a, b), и микросателлиты, повторяющиеся копии которых обычно имеют длину от 1 до 4, иногда 6 нуклеотидов (Tautz, 1989; Wright, Bentzen, 1994; Wright, 1994); последние обозначаются также как SSR (simple sequence repeat) или STR (short tandem repeat). Минисателлитный локус может насчитывать от двух до нескольких сотен повторов, микросателлитный локус - от 10 до 100 повторов.
Эти локусы весьма удобны для генетического маркирования и обладают большими возможностями (Wright, 1993): 1. Оба типа локусов в большом количестве рассеяны по геному. 2. Эти локусы в основном локализованы в некодирующих регионах генома и, следовательно, селективно нейтральны. 3. Для этих локусов характерна быстрая эволюция. Скорости спонтанного мутирования мини- и микросателлитных локусов составляют около 10"2-10"4 на локус за поколение (Weber, Wong, 1993). 4. Микросателлиты обладают менделевским кодоминантным наследованием (Zane et al., 2002). 5. Микросателлиты одинаковы у близких видов, что позволяет использовать одни и те же праймеры.
В геноме растений наибольшее число микросателлитных повторов представлено динуклеотидными повторами, в то время как моно-, три- и тетрануклеотидные повторы встречаются реже (Wang et al., 1994). В настоящее время микросателлитные локусы очень широко используют при анализе растительного генома (Mort et al., 2003; Archibald et al., 2004).
Маркеры RFLP (restriction fragment length polymorphism) основаны на выявлении полиморфизма по длине гомологичных рестрикционных фрагментов ДНК, обусловленного различиями по сайтам рестрикции. Метод регистрирует вариации в последовательности ДНК, которые приводят к изменению или исчезновению сайтов рестрикции. RFLP-маркеры являются кодоминантными маркерами, которые используют в ряде генетических исследований растений для создания генетических карт. Однако, несмотря на это, RFLP-маркеры имеют ряд недостатков, связанных с большими затратами времени и средств, а также необходимостью больших количеств ДНК и достаточно высокими требованиями к ее качеству. В то же время к достоинствам этих маркеров относится их высокая консервативность, что позволяет использовать их при сравнительном картировании родственных видов (Малышев, Картель, 1997).
RAPD, AFLP-маркеры. В отличие от микросателлитов, с помощью которых исследуются отдельные локусы генома, маркеры RAPD и AFLP позволяют охарактеризовать геном в целом.
RAPD {random amplified polymorphic DNA) ПЦР-амплификация ДНК с использованием единственного декануклеотидного праймера с произвольной последовательностью. GC-состав таких праймеров обычно составляет 50%. Для выявления полиморфизма и идентификации продуктов реакции, представляющих собой фрагменты ДНК разной длины, используется электрофорез в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием (Williams et al., 1990)
RAPD-анализ полиморфизма ДНК
RAPD-анализ ДНК проводили с использованием 12 праймеров (табл. 5), ранее успешно использовавшихся для выявления полиморфизма и выяснения гибридной природы у представителей рода Fallopia (Polygonaceae) (Hollingsworth et al., 1998).
Предварительно были оптимизированы условия реакции амплификации, включая подбор концентраций ДНК, MgCI2 и режима амплификации, позволяющие получить максимально информативные наборы RAPD-фрагментов.
Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала 10-20 нг ДНК, 10 пмолей праймера, 200 мкМ каждого dNTP, 2.5 мМ MgCI2, 1.5 ед. Taq-полимеразы (Диалат ЛТД, Россия) в рекомендованном производителем буфере. Амплификацию ДНК проводили в приборе «Терцик МС-11» (ДНК-технология, Россия) в следующем режиме: 2 цикла денатурация 95С, 3 мин отжиг праймера 37С, 30 с элонгация 72С, 1 мин денатурация отжиг элонгация 94С, 30 с 37С, 30 с 72С, 40 с циклов денатурация 94С, 30 с отжиг 37С, 30 с элонгация 72С, 40 с заключительный цикл
Специфичность реакции проверяли в контрольных опытах в отсутствии ДНК. Для проверки воспроизводимости амплификацию проводили на одних и тех же препаратах, но с разными партиями фермента, а также с использованием готовой реакционной смеси MaGMix (Диалат ЛТД, Россия).
В качестве праймеров для исследования полиморфизма межмикросателлитных участков генома были использованы 8 олигонуклеотидных праймеров, последовательности которых комплементарны микросателлитным повторам (табл.5). Температуру плавления для каждого праймера рассчитывали по формуле Т = 4 х (G+C) + 2 х (А+Т).
ПЦР проводили в стерильных 0,5 мл пробирках в 25 мкл смеси, содержащей 10-20 нг ДНК, 10 пмолей каждого праймера и MaGMix (Диалат ЛТД, Россия), содержащий: 200 мкМ каждого dNTP, 2,0 мМ MgCI2, 2,5 ед. SmarTaq полимеразы. На реакционную смесь наслаивали стерильное минеральное масло во избежание выкипания.
Участок рибосомного оперона ядерной ДНК, включающий ITS1 и ITS2, амплифицировали с помощью внешних праймеров (L, А и 4, В). При необходимости он мог быть амплифицирован по частям с интрона и trnSUGArnGGCC участка хлоропластного генома
ПЦР проводили в условиях, описанных выше в протоколе для ITS1-2 рибосомного оперона яДНК за исключением температуры отжига праймеров - 60С.
Продуктом реакции амплификации с использованием праймеров 3 tmGuuc и 5 trnG2G является trnGuuc интрон. Амплификат, полученный с применением праймеров tmSGCU, 3 trnGuuc состоит из 48 нуклеотидов гена trnSUGA, гена psbZ (ycf9), 26 нуклеотидов гена trnGGCC и двух спейсеров, окружающих ген psbZ (УСЙ).
Процесс электрофоретического фракционирования продуктов ISSR- и RAPD реакций осуществляли в зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК и требуемого разрешения, используя 1,7 % -ный агарозный гель в трис-боратном буфере (100 мМ трис-HCI, 80 мМ Н3В03, 0,1 мМ ЭДТА, рН 8,2) с бромистым этидием (0,5 мкг/мл) при 90 v. Для определения размеров фрагментов использовали маркер длины Gene Ruler 100+ п.н. (Fermentas). Электрофорез проводили в горизонтальной камере Sub Cell 192 (Bio-Rad). Ход электрофореза контролировали по движению двух красителей, добавленных к образцам в составе буфера для нанесения. Продукты реакции фотографировали в УФ-свете.
Продукты специфической амплификации (ITS1-2, trnSrnG и интрона trnG) детектировали электрофорезом в 1 % агарозном геле, используя в качестве буфера 1хТАЕ (Sambrook et al., 1989).
Внутривидовая генетическая вариабельность видов Polygonum L s. str
Для определения уровня различий между видами методами RAPD- и ISSR-маркирования было использовано 108 образцов 12 видов Polygonum (P. aviculare, P.arenastrum, P. calcatum, P. monspeliense, P. patulum, P. salsugineum, P. aschersonianum, P. samarense, P. boreale, P. rail, P. novoascanicum, P. arenarium) и 27 образцов трех гибридов, не имеющих специального названия.
По результатам анализа были определены генетические расстояния. Наиболее полиморфными являются гибриды. Генетические расстояния для гибридов из популяций 4-М, 5-S+SH, 8-А составляли 0,14-0,38; 0,07-0,25; 0,07-0,44 соответственно; для Р. arenastrum (P. aviculare х P. calcatum) в объединенной выборке достигает 0,16-0,51; P.boreale {P.aviculare х P.raii) - 0,12-0,37. Высокий уровень внутривидового полиморфизма также наблюдается у полиплоидных видов: P.raii- 0,18-0,39; P.aviculare -0,08-0,24. Выявленные различия между образцами диплоидных видов P. calcatum (0,03-0,12/0,18) и P.salsugineum (0,04-0,17) с 2п=40 были заметно меньше. Компактную группу представляет диплоид Р. patulum (0,09-0,27) с 2п=20. Прослеживается соответствие между уровнем геномного полиморфизма видов и степенью внутривидовой вариабельности морфологических признаков.
Интересные результаты были получены для P. aviculare и P.monspeliense. Геномы этих двух видов по результатам RAPD- и ISSR-маркирования оказались весьма близки, и не было выявлено строгих различий между ними. P. aviculare и P. monspeliense очень сходны морфологически, и многие исследователи не рассматривают их как два самостоятельных вида. Исходя из полученных результатов, мы склонны считать P. monspeliense экологической формой P. aviculare.
Для проверки гипотезы о гибридной природе P. arenastrum, чье происхождение связывают со скрещиванием P. aviculare и P.calcatum, были исследованы три смешанные популяции из разных мест произрастания (табл. 2). Первоначально для определения внутривидового и межвидового полиморфизма были исследованы образцы из каждой смешанной популяции (прил., рис. 19, 20, 21, 22, 23). По результатам этого анализа из трех популяций было отобрано по 3 образца P. aviculare, P. arenastrum и P. calcatum с максимально различающимися спектрами, которые затем анализировали совместно.
Всего при молекулярном анализе геномов P. aviculare, Р. arenastrum, P. calcatum и P. monspeliense получено: 147 RAPD-фрагментов — для популяции №1-N, 104 — для популяции №2-Z, 120 — для популяции №3-V и 146 — для смешанной выборки образцов P. aviculare, P. arenastrum и P. calcatum из всех трех популяций.
Популяция NQ1-N. На дендрограмме UPGMA (рис. 4, а) выявляются 3 хорошо поддерживаемые бутстрепом кластера, соответствующие P. calcatum (I), P. arenastrum (II) и P. aviculare + Р. monspeliense (III) При этом в кластере III выделяется с высокой поддержкой группа P. monspeliense и 2 субкластера, образованных девятью экземплярами P. aviculare и тремя экземплярами Р. arenastrum.
Следует отметить, что уровень бутстреп-поддержки для этих субкластеров невысок.
Экземпляры, входящие в кластер III, в целом генетически более полиморфны, чем P. calcatum и P. arenastrum, однако генетическое расстояние для особей P. aviculare + P. monspeliense сравнимо с таковым для P. aviculare из прочих популяций (табл. 6).
Популяция 2-І. На дендрограмме UPGMA (рис. 4, б) выделяются два кластера, имеющие высокий уровень бутстреп-поддержки. Первый включает образцы P. calcatum и часть образцов P. arenastrum, тогда как второй — образцы P. aviculare и остальные образцы P. arenastrum. Растения P. calcatum образует единый субкластер. Образцы P. arenastrum генетически более вариабельны, чем P. calcatum и P. aviculare, что проявляется в более высоком значении среднего генетического расстояния между ними (табл. 6).
Популяция 3-V. Дендрограмма UPGMA (рис. 5, а) представлена двумя кластерами: P. calcatum и P. arenastrum (I), и Р. aviculare и P. arenastrum (II). P. calcatum и P. aviculare образуют отдельные субкластеры, тогда как образцы P. arenastrum входят в состав как I, так и II субкластеров. Образцы P. arenastrum генетически более гетерогенны, чем образцы P. calcatum и P.aviculare (табл. 6).
Объединенная выборка из трех популяций (1-3). В объединенной выборке из 27 образцов P. calcatum, P. aviculare и P.arenastrum из трех популяций фрагменты длиной 1200 пн (праймер ОРА-08), 900, 800 и 450 пн (АЕ13), 620 и 300 пн (R03) присутствовали в спектрах всех видов и характеризовали группу таксонов в целом (табл. 3).
Кроме того, были выявлены видоспецифичные фрагменты, присутствующие в спектрах только одного вида, которые могут служить его молекулярными маркерами. Это фрагмент длиной 750 пн (ОРА-08), присутствующий у P. aviculare, фрагмент длиной 500 пн (ОРА-08), присутствующий у P. calcatum. Обнаружены также фрагменты, общие для P. aviculare и P. arenastrum (1100 пн — ОРА-16, 700 пн — R03, 750 — АЕ13, 850 — ОРА-08); общие для Р. calcatum и P. arenastrum (450 пн — ОРА-16, 1200 пн — R03, 500 — АЕ13, 500 — ОРА-08) (прил., рис. 24, 25, 26).
На дендрограмме UPGMA (рис. 5, б) выделяются 2 кластера: в первый попадают представители P. calcatum и P. arenastrum, во второй — P. aviculare и P. arenastrum. Кластер І, в свою очередь, можно разделить на 2 субкластера, один из которых включает исключительно образцы P. calcatum (5 из 6), а второй - 6 из 9 образцов P. aremastrum и образец V-C4 P. calcatum. Кластер II также делится на субкластеры, и один из них объединяет только все образцы P. aviculare. Образцы P. arenastrum отличаются большей генетической гетерогенностью по сравнению с образцами Р. calcatum и P. aviculare (табл. 6).
