Содержание к диссертации
Введение
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ:МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ:
1. Культивирование гриба и состав используемых сред 37
2. Приготовление обессоленных культуральных фильтратов 38
3. Методы определения активности пектолитических ферментов 39
4. Определение способности пектолитических ферментов вызывать мацерацию и гибель протопластов в тканях растений 42
5. Выделение препаратов клеточных стенок из растений и определение пероксидазы и окси-дазы индолилуксусной кислоты, солгобилизиро-ванных под действием пектолитических ферментов грибов 42
6. Определение фитоалексинов в тканях корнеплодов сахарной свеклы 44
III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ:
I. Состав пектолитических ферментов Rhizoctonia aderholdii (Ruhl. ) Kolosh. ( syn. R. solani Kuhn ), их свойства и влияние условий культивирования на продщирование:
1) Выявление состава ферментов, расщепляющих пектиновые вещества, определение субстратной специфичности, оптимума рН, отношения к ионам кальция 46
2) Определение эндо-типа действия пектолитических ферментов гриба на пектиновые полимеры ... 52
3) Зависимость активности ПГ и ПТЭ R. aderholdii от концентрации субстрата и количества фермента 52
4) Зависимость продуцирования пектолитических ферментов от источника углерода и величины рН
в среде 55
5) Влияние на продщирование пектолитических ферментов культивирования в стационарной и качалочной культуре и возраста колонии гриба, используемого в качестве посевного материала. . . 60
6) Сравнение продщирования пектолитических ферментов у двух изолятов R.aderholdii, различающихся по патогенным свойствам 62
2. Изучение действия пектолитических ферментов
R.aderholdii на развитие патологических процессов в тканях растений:
1) Получение очищенных препаратов пектолитических ферментов R» aderholdii 70
2) Испытание способности пектолитических ферментов R.aderholdii вызывать мацерацию клеток и гибель протопластов в тканях растений 76
3) Солгобилизация окислительных ферментов при действии пектолитических ферментов Е. ader-holdii на изолированные клеточные стенки растений сахарной свеклы ... .80
4) Действие пектолитических ферментов к. ader-holdii на клеточные стенки растений картофеля и хлопчатника и сопоставление с действием пектолитических ферментов грибов, вызывающих заболевания различного типа 84
5) Индуцирование образования фитоалексинов в тканях корнеплодов сахарной свеклы пектолити-ческими ферментами R. aderholdii 90
ІV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ... 94
ВЫВОДЫ 96
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 98
- Культивирование гриба и состав используемых сред
- Приготовление обессоленных культуральных фильтратов
- Состав пектолитических ферментов Rhizoctonia aderholdii (Ruhl. ) Kolosh. ( syn. R. solani Kuhn ), их свойства и влияние условий культивирования на продщирование:
Культивирование гриба и состав используемых сред
В работе использовали два изолята гриба R.aderholdii, различающиеся по морфолого-культуральным и патогенным свойствам, выделенные из пораженных растений сахарной свеклы Т.Ф.Аль-ховской (Киргизская опытно-селекционная станция по сахарной свекле). Культуру гриба поддерживали на агаризованной карто-фельно-сахарозной среде.
Цультивирование гриба проводили на жидкой солевой питательной среде, приготовленной по прописи, используемой Бейтма-ном с сотрудниками для R.solani ( Bateman et al., 1969). раздельно при следующих условиях: раствор глюкозы автокла-вировали при 0,5 атм - 15 мин; раствор пектина - при 0,5 атм -30 мин; растворы солей - I атм - 30 мин.
Гриб выращивали на качалке со скоростью вращения 220 об/мин при 28С в качалочных колбах объемом ЯЗО мл с 200 мл питательной среда и в стационарных условиях при 22 и 28С в колбах объемом 250 мл со 150 мл питательной среды и в матрасах объемом 1,5 мл со 150 мл питательной среда. Посев осуществляли внесением в среды дозированных высечек 4-дневной культуры гриба с края активнорастущей колонии мицелия до начала образования покоящихся структур. При культивировании V.uaiiliae использовали среду ( Malca et al., 1966) с добавлением пектина, a P.infestans - по прописи ( Grossmatm, 1968), добавляя ткани из клубней картофеля.
Приготовление обессоленных культуральных фильтратов
После определенных сроков роста гриба на бумажном фильтре мицелий гриба отделяли от культуральной жидкости, промывали дистиллированной водой, высушивали предварительно при Ю5С в течение 10 мин, а затем при 60С до постоянного веса, определяя вес сухой массы мицелия гриба.
В работе с фильтратами культуральной жидкости использовали колонки следующих размеров: 1,5 х 8,0 см; 1,8 х 10,0 см; 2,4 х 57,0 см.
Фильтраты культуральной жидкости после отделения от мицелия подвергали обессоливанию через сефадекс G - 25 ( Pharmacia, Швеция), колонку калибровали голубым декстраном ( Pharmacia, Швеция) и раствором CuSO .
Гельфильтрацию фильтратов культуральной жидкости проводи - 39 -ли на колонке с сефадексом G -1 (Pharmacia, Швеция), калиброванной голубым декстраном (М.В. 2 000 000), пероксидазой (ПО) (М.В. 40 000), цитохромом С (М.В. 12 500). Для ионообменной хроматографии использовали КМ-целлголозу (СМ-52) (Whatman, Англия), уравновешенную 0,02М ацетатным буфером при рН 5,2. Элю-циго связавшихся с ионообменником белков проводили раствором NaCl при градиенте 0-0,5М. В обессоленных культуральных фильтратах и фракциях, элюированных с колонок, определяли активность пектолитических ферментов (3), а также содержание белка и углеводов. Содержание белка определяли по методу Лоури ( Lowxy et al.,I95I) или по поглощению света при 280 нм (при анализе фракций с колонок).
Состав пектолитических ферментов Rhizoctonia aderholdii (Ruhl. ) Kolosh. ( syn. R. solani Kuhn ), их свойства и влияние условий культивирования на продщирование
Для определения состава пектолитических ферментов у E.aderholdii, способных расщеплять разные связи в пектиновых веществах, наличия пектинметилэетеразы (ПМЭ) - пектин-пектил-гидролазы (КФ 3.I.I.II), вызывающей гидролитический распад слож-ноэфирной связи между метиловым спиртом и карбоксильной группой полигалактуроновых кислот, а также деполимераз, расщепляющих о6-1,4-гликозидные связи в полигалактуроновых цепях полимеров, использовали экспериментальные подходы, изложенные в методических указаниях для изучения роли пектолитических ферментов в патологических процессах в растениях, вызываемых фитопатогенны-ми грибами (Васильева, Гладких, 1976).
Присутствие ПМЭ определяли испытанием культуральных фильтратов, полученных после разных сроков роста гриба в средах, содержащих пектин, на их способность вызывать изменение окраски в агаризованных реакционных смесях, содержащих пектин при разной величине рН и соответствующие индикаторы, обусловленное подкис-лением среды в результате освобождения карбоксильных групп галактуронових кислот при отщеплении метилового спирта. Нам удавалось обнаруживать лишь следа активности ПЮ. Слабая активность не позволила четко выявить оптимум рН для этого фермента.
Испытанием действия культуральных фильтратов, полученных после роста гриба в указанных средах, на растворы пектиновых веществ разной степени метоксилированности, забуференных при двух значениях рН, в присутствии и отсутствии ионов кальция, выявили наличие в составе пектолитических ферментов гриба как гидролаз, так и лиаз, специфичных к полипектату и пектину, соответственно. О природе присутствующих в составе гриба пектолитических ферментов судили по соотношению данных определения активности, проводимых различными методами, позволившими характеризовать положение разрываемых связей в пектиновых полимерах разной степени метоксилированности, а также накапливающиеся продукты расщепления субстратов, т.е. тип разрывов связей.
О способности гриба к продуцированию полигалактуроназы (ПГ) - поли 1,4- od- D -галактуронид] гликаногидролазы (КФ 3.2.1.15) - свидетельствовало снижение вязкости при действии культуральных фильтратов на растворы свекловичного пектина, а также деметоксилированного яблочного пектина при рН 5,2, в отсутствие ионов кальция, сопровождающееся накоплением продуктов расщепления со свободными редуцирующими группами (табл.3). Подтверждением способности гриба продуцировать ПГ служил тот факт, что продукты ферментативного расщепления давали при проведении реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТЕК) образование хромогенов с характерным для галактуроновои кислоты максимумом поглощения света при 515 нм (Heukom, I960).
