Введение к работе
Актуальность проблемы. Последние десятилетия характеризуются увеличением заболеваемости атопическими болезнями (A3). Эти заболевания называют ещё экологически обусловленными, так как наблюдается положительная корреляция заболеваемости с увеличением химической нагрузки на среду обитания человека [Авдеенко, 1990; Балаболкин, 1994; Шамов и др. 1997; Brunekreef, 1997; Schaid, Rowland, 1998; Ciccone et al, 1998; Norris et al., 1999; Gavett, Koren, 2001; Burr et al., 2003; Соломон, 2003]. По своей генетической природе эти заболевания являются полигенными, или многофакторными с аддитивно-полигенным наследованием с пороговым эффектом [Holgate, 1997; Пузырев и др., 1998; Hall, 1999]. Идентификация в различных популяциях специфичных генов и средовых факторов, взаимодействие которых формирует норму реакции человека и его адаптацию к меняющейся среде обитания, приобретает в последние десятилетия всё большую актуальность [Спицын и др., 2006].
Атонический дерматит (АД) является первым по срокам возникновения атоническим заболеванием. Наличие атопнческого дерматита у ребёнка считается одним из факторов высокого риска развития бронхиальной астмы (БА) [Wahn, 2002]. В настоящее время известен ряд полиморфных генов, определённые варианты и генотипы которых обнаруживают связь с A3 [Фрейдин, 2001; Cookson, 2005; Lee et al., 2006]. В их число входят гены, функции белковых продуктов которых тесно связаны с развитием изучаемой патологии. К ним относят гены факторов антигенного распознавания и гуморального иммунного ответа; гены факторов воспаления, среди которых большую важность имеют гены ферментов метаболизма медиаторов воспаления; гены рецепторов цитокинов и агентов воспаления, гены внутриклеточных сигнальных молекул. Гены ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК) также являются кандидатными в формировании предрасположенности к данным патологиям, так как их белковые продукты осуществляют взаимодейсгвие со средой, детоксицируя или токсифицируя чужеродные химические соединения, попадающие в организм, в том числе и лекарственные препараты [Jacqz-Aigrain, Cresteil, 1992; Ingelman-Sundberg, 1995; Mancinelli et al., 2004]. Но они ещё недостаточно исследованы в качестве генетических факторов предрасположенности к этим заболеваниям. Эти гены являются достаточно сложным объектам исследования в силу ряда их специфических особенностей. Это и перекрывающаяся субстратная
4 специфичность, и индуцибельность, и участие в метаболизме эндогенных соединений. Но именно эти особенности ФБК и позволяют предполагать, что они могут быть генетическими маркёрами на всех этапах развития заболевания от его инициации к исходу и, соответственно, позволят выявить предрасположенность, помочь в ранней диагностике заболевания, зная генотип больного, составить прогноз течения заболевания, выбрать наиболее оптимальную терапию.
Кроме того, в случае A3, диапазон проявления генотипа в фенотипе для генов ФБК может быть очень широким. Показано, что фенотипические эффекты проявления генов могут различаться для разных рас, этнических групп одной расы, у мужчин и женщин, в разных возрастных группах, при воздействии различных внешних факторов. В связи с этим ясно, что каждая конкретная популяция должна быть обследована для того, чтобы выявить ту группу людей, в которой исследуемый полиморфизм играет важную роль в развитии заболевания [Garte, 2001; Ляхович и др., 2006].
Так как гены ФБК участвуют в метаболизме лекарств, то они часто являются ответственными за побочные эффекты лекарственной терапии [Ryan et al., 1985; Huang et al., 2002; Bhaiya et al., 2006; Vuilleumier et al., 2006]. Трудностями медикаментозного лечения такого социально значимого заболевания, как туберкулёз лёгких, являются частые побочные реакции. Изониазид, метаболизируемый в основном N-ацетилтрансферазой 2 (NAT2), со времени начала его использования остаётся одним из наиболее широко используемых препаратов в лечении туберкулёза. МАТ2-зависимый метаболизм изониазида в нетоксичный ацетилизониазид и далее в ацетилгидразин и диацетилгидразин служит противовесом для амидазо-зависимого пути, в результате которого образуется токсичный гидразин [Huang, 2002]. Несмотря на длительный период времени, в течение которого известны быстрый и медленный фенотип ацетилирования и полиморфизм гена NAT2 как его основа, попытки сопоставления фенотипа ацетилирования и генотипа NAT2 в целях оптимизации терапии туберкулёза лёгких являются немногочисленными, выполнены на небольших группах здоровых добровольцев и с дозами изониазида в 2-4 раза более низкими, чем используемые в клинической практике лечения туберкулёза в Росиии [Kita et al., 2001; Kinzig-Schippers et al., 2005; Chen et al., 2009]. В то же время больные часто имеют целый ряд сопутствующих хронических заболеваний желудочно-
5 кишечного тракта, бронхо-лёгочной и эндокринной систем, алкоголизм, наркоманию, а также ВИЧ-инфекцию [Зарецкий, 1997; Колпакова, 2002; Montoro, Rodriguez, 2007].
Решение этих задач является особо важным для России, учитывая широкое распространение атопических заболеваний среди детей, а также высокий уровень побочных эффектов при медикаментозной терапии туберкулёза. В настоящее время информация о роли полиморфизма генов ФБК в предрасположенности к атипическим заболеваниям и развитии побочных эффектов лекарственной терапии туберкулёза является достаточно ограниченной не только в России, но и во всём мире. Учитывая это, целесообразным было проведение настоящего исследования.
Цель работы: Изучение полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков как возможных генетических факторов риска возникновения атонических заболеваний у детей (бронхиальной астмы и атопического дерматита) и некоторых клинических проявлений этих заболеваний, а также гепатотоксичности при лечении туберкулёза лёгких у взрослых.
Задачи исследования:
1. Изучить ассоциацию полиморфных вариантов генов ферментов
биотрансформации ксенобиотиков (цитохрома Р4501А1 (CYP1AI), глутатион S-
трансфераз Ml (GSTM1), ТІ (GSTT1) и PI (GSTP1), ариламин N-
ацетилтрансферазы 2 (NAT2)) с атоническим дерматитом и бронхиальной астмой.
-
Сравнить величины показателей ассоциации с бронхиальной астмой полиморфных вариантов генов ФБК (CYP1A1, GSTM1, GSTT1, GSTP1, NAT2) и полиморфных вариантов генов интерлейкинов (IL4, IL5), их рецепторов (IL4R, IL5R) и антагониста рецептора (1L1RA).
-
Оценить возможное увеличение показателей ассоциации полиморфных вариантов генов ФБК с бронхиальной астмой у детей с наследственной отягощённостью в семейном анализе и в исследовании «случай - контроль», как проявление феномена антиципации.
4. Изучить межгенные взаимодействия в формировании
предрасположенности и особенностей течения атопических заболеваний у детей.
5. Изучить влияние курения на показатели ассоциации полиморфных
вариантов генов ФБК (GSTMI, GSTT1, GSTP1, NAT2) с риском возникновения
атопических заболеваний.
6. Изучить влияние комплексных конститутивных признаков (пол и возраст)
на ассоциацию полиморфных вариантов генов ФБК с атопическими
заболеваниями.
7. Охарактеризовать генетический полиморфизм гена NAT2 у больных
туберкулёзом с сопутствующими заболеваниями и оценить связь полиморфных
вариантов с развитием побочных реакций на противотуберкулёзные препараты.
8. Сопоставить скорости ацетилирования тестовых препаратов с генотипами
NAT2 у больных бронхиальной астмой и туберкулёзом легких.
9.0ценить фармакокинетику изониазида у больных туберкулёзом лёгких и ассоциацию показателей элиминации препарата с развитием побочных реакций на противотуберкулёзные препараты.
10. Оценить информативность фенотипа ацетилирования и генотипа NAT2 в оценке предрасположенности к побочным эффектам лекарственной терапии туберкулёза лёгких.
Научная новизна: Впервые определены частоты встречаемости полиморфных вариантов генов ФБК и интерлейкинов в выборках детей -европеоидов, в основном русских, больных АД и БА и, соответствующей контрольной группы без атопических заболеваний г. Новосибирска. В исследованиях «случай - контроль» показана ассоциация полиморфных локусов генов ФБК и генов интерлейкинов с атопическими заболеваниями. Показано, что в формировании предрасположенности к БА преимущественно задействованы полиморфные варианты генов ФБК, тогда как в развитии клинических форм заболевания большую роль играют полиморфные варианты генов интерлейкинов. Показано, что и для АД, и для БА одни и те же полиморфные варианты генов ФБК являются факторами риска заболевания и изменения клинико-лабораторных показателей атопии, общих для A3, таких как повышенный уровень иммуноглобулина Е в сыворотке крови и количество эозинофилов.
Впервые было показано, что такие показатели атопии, как уровень общего IgE в сыворотке крови, процент эозинофилов и диаметр пятна в кожном прик-тесте у детей, больных БА, возрастают с накоплением нулевых аллелей в генотипе GSTM1.
Показано, что величина показателя ассоциации полиморфных вариантов генов ФБК с БА зависит от возраста и модифицируется полом. Установлено, что группами максимальной подверженности атопическому дерматиту являются девочки с гомозиготным генотипом GSTPl(105Ile/Ile), подвергавшиеся воздействию курения в семьях (OR = 6,38**), особенно девочки младше 11 лет
7 (OR = 26,25***). Гомозиготный генотип NAT2(C481T)(CC) также вносит наибольший вклад в предрасположенность к бронхиальной астме в группе девочек младше 11 лет, как подвергавшихся (OR = 20,0***), так и не подвергавшихся воздействию курения в семьях (OR > 35, 5**).
Показано, что гетерозиготные генотипы по исследованным признакам являются факторами устойчивости к атопическим заболеваниям.
Выявлена значительная вариабельность элиминации изониазида у больных туберкулёзом и процента ацетилированіїя сульфадимезина у больных бронхиальной астмой с одинаковым генотипом NAT2. Наиболее широкая вариабельность фенотипа ацетилирования показана у пациентов с гетерозиготным генотипом NAT2.
Показано, что медленный фенотип ацетилирования предрасполагает к гепатотоксичности при противотуберкулёзной терапии как в группах с отсутствием, так и в группах с наличием сопутствующих заболеваний.
Научно-практическая значимость работы: Результаты исследования ассоциаций полиморфных вариантов генов ФБК с многофакторными заболеваниями могут быть использованы в профилактической медицине для формирования групп повышенного риска заболевания.
Знание показателей ассоциации полиморфных вариантов генов ФБК с клиническими особенностями течения БА и АД у детей и последствий противотуберкулёзной терапии у взрослых дают возможность прогнозирования течения заболевания у конкретного больного и оптимизации терапии. Результаты исследования ассоциаций генотипов при воздействии курения могут быть использованы для профилактической работы с родителями.
Результаты проведённого анализа гепатотоксичности противотуберкулезных препаратов у лиц с разным генотипом NAT2 и его фенотипом, определённым по элиминации изониазида, могут быть применены в лечебных противотуберкулёзных учреждениях для выявления среди больных лиц с высоким риском развития гепатотоксических реакций.
Теоретической значимостью данной работы можно считать получение экспериментальных подтверждений важного положения популяционной генетики о приспособительном значении гетерозиготных генотипов на примере устойчивости гетерозиготных генотипов генов ФБК к атопическим заболеваниям у детей.
8 Основные положения, выносимые на защиту:
1. Полиморфизм генов ФБК является важной составляющей генетической основы
как предрасположенности, так и устойчивости к атопическим заболеваниям.
2. Величина показателей ассоциации полиморфных вариантов генов ФБК с
предрасположенностью к БА сравнима с таковой для генов цитокинов,
вовлечённых в основной патогенетический механизм.
-
Пассивное курение, пол и возраст существенно влияют на величины показателя ассоциации полиморфных вариантов генов ФБК с предрасположенностью к A3 у детей.
-
Гены ФБК играют роль не только в развитии предрасположенности к A3, но и в формировании некоторых клинических проявлений этих заболеваний.
-
Вариабельность скорости ацетилирования тестовых препаратов у пациентов с гетерозиготными генотипами NAT2 превышает таковую у пациентов с гомозиготными генотипами.
-
Фенотип ацетилирования изониазида и генотип NAT2 могут служить маркёрами возможного развития гепатотоксичности при противотуберкулёзной терапии.
Апробация работы: Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 7-м Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1997), IV, V Национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 1997, 1998), 2-м, 3-м и 4-м съездах Российского Биохимического общества (Москва, 1997; Санкт-Петербург, 2002; Новосибирск, 2008), 6-м Европейском съезде международного общества изучения ксенобиотиков (ISSX) (Готеибург, Швеция, 1997), Международных конгрессах «Interasthma 97» (Канары, 1997), «Интерастма» (Москва, 1998), 12-м международном симпозиуме по микросомам и окислению лекарств (Монпелье, Франция, 1998), конгрессе Европейского общества респиратологов (ERS) (Мадрид, Испания, 1999), 13-м международном симпозиуме по микросомам и окислению лекарств (Стреза, Италия, 2000), III съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Екатеринбург, 2000), Всероссийской научной конференции с международным участием «Север -человек: Проблемы сохранения здоровья» (Красноярск, 2001), 1-й Всероссийской конференции с международным участием «Влияние загрязнения окружающей среды на здоровье человека» (Новосибирск, 2002), XVII Всемирном конгрессе по астме (Санкт-Петербург, 2003), 6-й научно-практической конференции врачей «Современные лечебные и диагностические методы в медицинской практике» (Новосибирск, 2005), Международной конференции «Фундаментальные науки для
9 биотехнологии и медицины» (Новосибирск, 2006), 16-м Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2006), 3-й международной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2007), 4-ом международном рабочем совещании по ариламин N-ацетилтрансферазе (Александрополис, Греция, 2007), Международном рабочем совещании «Research on Tuberculosis/ State of Art in Russia» (Москва, 2007), 2-й международной конференции «Erlich II Magic Bullets» (Нюрнберг, Германия, 2008), Всероссийской конференции, посвященной 10-летию кафедры генетики БГПУ им. М. Акмуллы, приуроченной к ежегодным Вавиловским чтениям (Уфа, 2009), 2-м съезде клинических фармакологов Сибирского федерального округа (Барнаул, 2009).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 53 работы, в том числе в журналах из Перечня ВАК РФ - 17, из них в журналах из международной базы цитирования - PubMed. - 10.
Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трёх глав собственных результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 356 страницах, иллюстрирована 98 таблицами н 37 рисунками. Список литературы содержит 498 источников, из них 364 зарубежных.
