Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Характеристика объекта 11
1.1.1. Ботаническая классификация 11
1.1.2. История интродукции клематисов 14
1.1.3. Отечественная история интродукции и селекции клематисов 19
1.1.4. Международная садоводческая классификация 23
1.2. Вегетативное размножение 26
1.3. Клональное микроразмножение: достоинства, этапы, необходимые условия 36
1.3.1. Факторы, влияющие на микроразмножение растений 40
1.3.2. Трудности, возникающие при клональном микроразмножении растений 44
1.3.3. Особенности культивирования клематисов в условиях in vitro 47
1.4. Промышленное производство клематисов 52
1.5. Методы.выявления полиморфизма ДНК 54
Глава 2. Материалы и методы исследований 58
Глава 3. Формирование коллекции клематисов ГУВРБС 64
3.1. Структура коллекции 64
3.2. Первичное сортоизучение коллекции 66
Глава 4. Особенности вегетативного размножения клематисов в условиях искусственного тумана 72
4.1. Зависимость укоренения от сроков черенкования и температуры 72
4.2. Зависимость укоренения-от принадлежности к сортовым группам...73
4.3. Зависимость,укоренения от других факторов 80
Глава 5. Разработка технологии микроклонального размножения клематисов 83
5.1. Изолирование и стерилизация первичных эксплантов ; 83-
5.2. Оптимизация состава питательных сред и.условий культивирования» на этапе размножения 85
5.2.1. Подбор оптимальных концентраций фитогормонов 85
5.2.2. Изучение влияния генотипа на коэффициент размножения 89
5.2.3 Изучение влияния экзогенных факторов на коэффициент размножения 95
5.3. Укоренение in vitro и адаптация регенерантов клематисов к условиям in vivo 97
5.3.1. Укоренение регенерантов клематисов in vitro 97
5.3.2. Адаптация укорененных микропобегов 103
Глава 6. Днк идентификация коллекции клематисов ГУВРБС 106
Глава 7. Экономические аспекты использования метода клонального микроразмножения клематисов и расчет себестоимости посадочного материала 114
Заключение 119
Выводы 120
Список литературы 122
Приложение 142
- Отечественная история интродукции и селекции клематисов
- Структура коллекции
- Зависимость укоренения от сроков черенкования и температуры
- Изолирование и стерилизация первичных эксплантов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Селекционная работа с клематисами.в.бывшем СССР впервые начата в 1958 г. в Государственном Никитском ботаническом саду Александром Николаевичем Волосенко-Валенис (Бескаравайная, 1998). В 1985 г. коллекция, насчитывала 58 видов, 35 сортов иностранной селекции, свыше 100 новых сортов и гибридных форм селекции сада (Бескаравайная, Донюшкина, 1989). С 1979 г. работой по получению зимостойких и устойчивых к фитопатогенам сортов клематиса начал заниматься эстонский селекционер У.Я. Кивистик и его супруга А.. Кивистик. Результатом их труда: стало появление более 150 сортов. В общей сложности в бывших республиках СССР было выведено более 360 сортов клематиса, что позволяло нашей стране занимать ведущие позиции в мировой селекции этой культуры. Только японские селекционеры вывели большее количество сортов - 630. На счету французской школы селекции 221 сорт, Швеции - 143, Голландии - 105, Великобритании - 97. Однако, после распада Советского Союза традиции отечественной школы селекции были утрачены. Последний сорт клематисов отечественной селекции зарегистрирован в международном регистре в 1989 г.
Кроме того, в течение последних лет были частично или полностью утрачены коллекции клематисов в различных ботанических садах на территории стран СНГ. Так, в Киевском ботаническом саду полностью утрачена уникальная коллекция, включающая 40 сортов селекции М. И. Орлова, в Ботаническом саду БИНа отсутствуют 16 сортов, зарегистрированных Международным обществом клематисоводов, селекции В. М. Рейнвальда. Коллекция сортов, выведенных селекционером любителем М.Ф. Шароновой (37 сортов), сохранена не полностью, некоторые сорта еще встречаются в ботанических садах и частных коллекциях, но требуют дополнительной идентификации. Никитский ботанический сад, к большому
7 сожалению, также не смог сохранить, некогда крупнейшую коллекцию видов, сортов и гибридных форм в полном объеме. По; данным инвентаризации коллекционных фондов Российских ботанических садов, от 20 до 30 % сортов, выведенных отечественными селекционерами, утрачены безвозвратно.
Культура клематисов приобретает все большую популярность/в мире. Традиционное вегетативное размножение (черенкование, отводки и др.) позволяет получить ограниченное количество посадочного материала, что препятствует распространению этой культуры. В России отсутствуют крупные хозяйства по производству посадочного материала клематисов. В то же время в странах Европы, США, Японии, в некоторых питомниках производят до 1 млн. саженцев клематисов ,в> год, находящих своего потребителя*ш в нашей? стране. Преодолеть подобныетрудности возможно^ с применением метода клонального микроразмножения. О чем говорит наличие крупных биотехнологических фирм в таких странах как Индия, Канада, Италия, Голландия и др., производящих,,в том числе посадочный материал клематисов. Одним из направлений' биотехнологии растений является разработка ш внедрение: технологий клонального микроразмножения в производство -получение в условияхin vitro, неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру. В; основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, т.е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растению. Этот метод имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способамиразмножения:
1) получение генетически однородного материала;
освобождение растений от вирусов, грибковых и бактериальных инфекций;
высокий коэффициент размножения (105-Г07 ед. - для травянистых, цветочных растений, 104-105 ед. - для кустарниковых, древесных);
сокращение продолжительности селекционного процесса;
ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;
6) размножение медленно растущих и плохо размножаемых
традиционными способами видов и сортов;
7) возможность проведения работ в течение всего года и экономия
площадей, необходимых для выращивания маточного посадочного материала.
Технологии клонального микроразмножения представляют
исключительную ценность для поддержания и сохранения коллекций клематисов ботанических садов, сохранения генофонда растений, особенно в тех случаях, когда вид или сорт представлен ограниченным числом экземпляров или находится под угрозой исчезновения.
Ситуация, сложившаяся с некоторыми коллекциями в ботанических садах, делает особенно актуальной проблему сохранения генофонда декоративных растений отечественной селекции и, в частности, культуры клематиса. Одним из наиболее эффективных методов сохранения является создание генетических банков in vitro. Хотя этот метод считается более дорогостоящим из-за необходимых капитальных затрат на строительство -г лабораторий, тем не менее расчеты экономической эффективности содержания коллекций различных садовых культур in vitro показывают его неоспоримые преимущества. В связи с возрастающим спросом в России на посадочный материал клематисов, развитием озеленения, отсутствием питомников по производству посадочного материала, утратой коллекций, становится актуальной проблема их массового размножения.
Разработка эффективных методов микроклонального размножения является основой работ по сохранению генофонда клематисов, одним из перспективных направлений сохранения биоразнообразия.
Создание банков in vitro делает особо актуальной проблему сохранения генетической стабильности хранящихся образцов. Открытие методов, позволяющих выявить различия между объектами непосредственно в генетическом материале, дало большой скачок в картировании геномов растений. ДНК-маркеры обладают существенными преимуществами по сравнению с морфологическими маркерами: они позволяют выявлять
9 полиморфизм в любом участке генома, дают возможность вести анализ по неограниченному числу локусов. (Малышев, Картель, 1997; Saliba-Colombani et al., 2000).
Цель и задачи исследования. Цель исследований - создание наиболее репрезентативной национальной коллекции клематисов (род Clematis L.), комплексное изучение биологических особенностей размножения и сохранение ex situ.
Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:
- создание крупнейшей на территории России коллекции клематисов;
отработка технологии вегетативного размножения в условиях искусственного тумана;
- усовершенствование системы производства посадочного материала с
использованием методов биотехнологии;
создание генетического банка клематисов in vitro',
изучение возможности молекулярно-генетической идентификации сортов клематиса;
расчет себестоимости посадочного * материала клематисов, полученного методом клонального микроразмножения.
Научная новизна. Впервые на территории России создана крупнейшая коллекция клематисов, содержащая около 290 видов и сортов отечественной и зарубежной селекции. Выявлены общие закономерности и специфические особенности культивирования in vitro различных сортовых групп клематиса; разработана универсальная технология клонального микроразмножения ПО сортов на основе прямой регенерации растений путем активации пазушных меристем. Впервые для стерилизации использовался препарат "Лизоформин", что позволило сделать метод клонального микроразмножения экономически более эффективным.
Впервые в России создан банк ДНК клематисов, представленный 90 образцами.
Проведен RAPD-анализ 74 видов и сортов клематиса, который может служить своеобразным экспресс-методом выявления генетического полиморфизма, что крайне актуально для малоизученных таксономических групп, к которым относится род Clematis. В дальнейшем метод может быть использован для проверки генетической стабильности образцов, хранящихся в банке in vitro, для исследования сомаклональной изменчивости, а также паспортизации коллекций клематисов.
Практическая ценность работы и реализация результатов исследований. Разработана промышленная технология производства клематисов, сочетающая традиционные методы вегетативного размножения с биотехнологическими методами, что делает ее экономически' более эффективной. Технология внедрена в производство на базе тепличного хозяйства в г. Волжский и отмечена золотой медалью «За научные/инновации года» на Международной выставке «Цветы 2006».
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на Международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика Н.В. Смольского (Минск 2005), на Международной конференции «Цветоводство без границ» (Харьков 2006), на Всероссийской конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия» (Волгоград 2006), на IV Международной конференции «Биологическое разнообразие. Интродукция растений» (Санкт-Петербург 2007), на II Семинаре по реинтродукции растений (Волгоград 2007). Научные разработки экспонировались на различных выставках, в том числе на Международной выставке «Зеленая неделя» в Германии, где были отмечены почетным дипломом и серебряной медалью выставки, были отмечены золотой медалью Международной выставки «Цветы 2006», серебряной медалью Международной выставки «Цветы 2007», золотой медалью выставки «Дача, сад, огород 2007».
Отечественная история интродукции и селекции клематисов
Несмотря на то, что во многих литературных источниках первопроходцем в области работы по интродукции клематисов, с первых лет основания (1812г.), упоминается ГНБС (Бескаравайная, 1998), по нашему мнению, первенство в этой области принадлежит Ботаническому саду Ботанического института им. В.Л. Комарова. В Никитском ботаническом саду С. orientalis L, так же как и С. recta L, впервые был интродуцирован при первом директоре - X. Стевене (1817 г.) (Любименко, 1909; Бескаравайная, 1998). Однако, С. vitalba L и С. viticella L. упоминаются в каталогах Императорского Ботанического сада, начиная с 1796 г. и с 1816 г. соответственно. Не вызывает сомнений появление в вышеназванной коллекции в 1793 г. полукустарника C.integrifolia L.
Нет информации и об интродукции видов рода Atragene L. в Никитском ботаническом саду. Первое упоминание видов рода Atragene в коллекции Ботанического сада Ботанического института им. В.Л. Комарова встречается в каталоге 1816 г.; A. alpina L., A. ochotensis Pall, (возможно 1816). До 1852 г. начали выращивать и A. macropetala Ledeb. Начиная с 1858 г. и до настоящего времени, в открытом грунте постоянно растет A. sibirica L. (1858—2005). В разные годы в каталогах Сада в открытом грунте упоминались садовые формы A. alpine L: f. /lore albo (1881—1926), I/lore rubro (1881 — 1927), f. albida (1870—1910) (Связева, 2005). Клематисы стали известны в России только в начале XIX в. как оранжерейные растения.
Из работ ученых Никитского ботанического сада XIX в., каталогов растений, путеводителей по саду видно, что и мелкоцветковые виды, и крупноцветковые сорта иностранной селекции этого периода (например, в 1878 г. — 22 сорта)- успешно произрастали в Никитском ботаническом саду в открытом грунте. А также использовались для вертикального озеленения, широко размножались и распространялись в южных районах России. Однако в 1857 г. в Императорском Ботаническом саду было интродуцировано уже 18, а к 1878 г. 28 видов и форм. По ряду причин коллекция клематисов в Никитском ботаническом саду резко сократилась после 1878-г., и к 1909 г. сохранилось, только 6 видов, в: то время- как в Санкт-Петербурге введение в коллекцию новых таксонов ломоноса продолжалось и в начале XX в.
Первые упоминания о гибридных клематисах появились в журнале «Садоводство» за 1858 г. Ермолаич в журнале «Вестник садоводства» за-1873 г. указывает, что садовые клематисы, которые растут в Англии в открытом грунте, в России могут расти лишь в.оранжереях. В-Санкт-Петербурге большой вклад в размножении клематисов в России внесла известная русская фирма «Regel и Keslering». Их каталог 1908 г. состоял из 15" видов и 20 сортов клематисов. Большинство из них все еще популярно и сегодня, и их можно найти в садах даже сейчас: «Star of India», «The President», «Proteus», «Madame Baron Veilard», «Daniel Deronda» и другие.
После окончания Великой Отечественной войны, в связи с активизацией работ по интродукции растений, коллекции мелкоцветковых видов клематиса начинают вновь пополняться. Так 1955 г. в Никитском ботаническом саду, в результате интродукционного испытания 33 видов и форм, имелась коллекция из 22 наименований, к 1958 г. она составила 31 вид и форму. К 1964 г. коллекция насчитывала уже 82 вида и сорта и 23 гибридные формы селекции Никитского ботанического сада. Сад, по праву, стал считаться центром по изучению и распространению клематисов, и с конца 1950-х гг., центром селекции и массового размножения новых сортов, форм и перспективных видов. К 1988 г. здесь трудами А.Н. Волосенко-Валениса и М.А. Бескаравайной создана крупнейшая и уникальная коллекция, состоящая из 58 видов, 35 сортов иностранной селекции, свыше 100 новых сортов и гибридных форм собственной селекции.
В бывшем СССР интродукцией клематисов начали активно заниматься с 1950 г. С клематисами работали и продолжают их изучение в таких ботанических садах, как Центральный республиканский ботанический сад (ЦРБС АН Украины), Алма-Атинский, Каунасский, Днепропетровский, Куйбышевский, Донецкий, Ташкентский, Саратовский (Невесенко, 1969; 1971; Белинская, 1972; Белинская, Шоково, 1977; Костырко, 1983; Бескаравайная, Донюшкина, 1988; Бранденбург, Ван де Ворен, 1988; Рогинский, 1988; Дорофеева, Мамаев, 1998, 2001). Кроме того, эта работа проводилась в ботанических садах Кишинева, Минска, Львова, Ужгорода, Фрунзе, Йошкар-Олы и др.. Изучением биологии и культуры клематисов занимались М.И. Орлов, А.Н. Волосенко-Валенис, М.А. Бескаравайная, Н.К. Белинская, А.Р. Богушявичюте, Н.Г. Вахновская, Д.Р. Костырко, Е.С. Моисеева, З.И. Невесенко, СИ. Потапов, В.Э. Риекстиня, Е.А. Донюшкина и др.
Селекционная работа с клематисами в бывшем СССР впервые начата в 1958 г. в Государственном Никитском ботаническом саду Александром Николаевичем Волосенко-Валенис. В 1962 г. коллекция насчитывала 138 видов и сортов, в том числе 11 собственной селекции. Работу по интродукции и селекции продолжила Маргарита Алексеевна Бескаравайная, автор 52 сортов, зарегистрированных Международным обществом клематисоводов. Практически одновременно (1959) селекцией клематисов стали заниматься5 в ЦРБС АН Украины. Михаил Иванович Орлов является автором более 40 сортов. С 1972 г. эта работа была продолжена известным цветоводом-селекционером М.Ф. Шароновой из Московской области. Ей выведено 37 сортов клематисов. В.М. Рейнвальдом из БС им. Комарова выведено!6 сортов. Отдельных слов заслуживает прибалтийская школа селекции клематисов. С 1979 г. работой по получению зимостойких и устойчивых к фитопатогенам сортов клематиса начал заниматься эстонский селекционер У .Я. Кивистик и его супруга А. Кивистик. Результатом их труда явилось создание более 150 сортов. Селекцией клематисов в Эстонии занимались также Е. Кала, Э. Пранно и А. Вайгла, автор первой книги о клематисах на эстонском языке. Несмотря на то, что в Латвийской ССР селекция начата раньше, чем в Эстонии, успехи латвийских селекционеров значительно скромнее, 35 сортов, зарегистрированных Международным обществом. Первые гибриды были получены М. Таурите в 70-х годах. Авторами латвийских сортов являются Я. Рупленс и А. Ирбе, по инициативе которого в 1978 г. в г. Сигулда была организована постоянная экспозиция клематисов, а также В. Риекстиня, автор не только 9 сортов, но и двух книг по культуре клематиса. Автором 11 из 13 сортов, выведенными литовскими селекционерами, является Л. Бакявичус.
В общей сложности в бывших республиках СССР было выведено более 360 сортов клематиса, что позволяло нашей стране занимать ведущие позиции в мировой селекции этой культуры. Только японские селекционеры вывели большее количество сортов - 630. На счету французской школы селекции 221 сорт, Швеции - 143, Голландии - 105, Великобритании - 97. Однако после распада Советского Союза традиции отечественной школы селекции были утрачены. Кроме того, в течение последних лет были частично или полностью утрачены коллекции клематисов в различных ботанических садах на территории стран СНГ. Так, в Киевском ботаническом саду полностью утрачена уникальная коллекция, включающая 40 сортов селекции М. И. Орлова, Ботаническом саду БИНа отсутствуют 16 сортов, зарегистрированных Международным обществом клематисоводов, селекции В. М. Рейнвальда. Коллекция сортов, выведенных селекционером любителем М.Ф. Шароновой (37 сортов), сохранена не полностью, некоторые сорта еще встречаются в ботанических садах и частных коллекциях, но требуют дополнительной идентификации.
Структура коллекции
В Волгоградской? области- интродукцией1 клематисов стали заниматься после создания в 1965 г. Дендрария Волжского судоходного канала. Но данным И. П. Дударева в коллекции дендрария в разные годы были? интродуцированы-следующие: клематисы: С. vitalba, G.flammula, Є. integrifoliaC.paniculata- G.S tangutica, Є. viticella, Є. songarica, а также: сорт- селекции. M;A\ . Бескаравайной «Лютер Бербанк»: В? начале . 80 годов в?, частных коллекциях, садоводов начинают появляться сортовые клематисы,. в основном: из Прибалтики: А в 1996 г. начинает формироваться; коллекция клематисов Ботанического сада ВГПУ, которая1 сегодня, насчитывает 30/ сортов- и: 3; вида. Так: же в? 1997 г. агрофирмой «Семко-Волга» завозится і в Волгоград, 18s сортов,, в основному отечественной: селекции;. из. г. Сигулда. (Латвия), которые послужили основой крупнейшей в:Волгограде частной коллекции, насчитывающейболеё 40 сортов. Эти две коллекции и послужили не только началом интродукционных испытаний новых для Волгограда сортов, и более серьезного изучения культуры клематиса, но и легли в основу формируемой коллекции FY ВРБС.
В 2004 г. была сформирована коллекция ГУ ВРБЄ, которая насчитывала 17 видов и 113: сортов. В-настоящее время коллекционный: фонд ГУ "ВРБС представлен 38 видами рода Clematis, 3 видами рода Atragene и 246 сортами-отечественной и: зарубежной селекции (приложение Y)y принадлежащими: к. 14 сортовым группам по международной садовой: классификации (рис. 1): Максимально представлены в коллекции группы: Ранняя крупноцветковая-36%; Поздняя крупноцветковаяг20%; Группа Atragene-8%; Группа Viticella-7%; Группа Integrifolia-6%; Группа Tangutica-5%. Остальные группы представлены в коллекции менее 5% каждая.
В коллекции ботанического сада представлены сорта как отечественной, так и зарубежной селекции. В сортовой структуре коллекции 31 % (74 сорта) занимают сорта, выведенные в Великобритании, 9 % (22 сорта) - сорта выведенные в Польше, 8 % (18 сортов) - сорта выведенные во Франции. Представлены сорта селекционных центров Японии, Швеции, Голландии, США, Канады и др. По одному сорту из Аргентины, Дании и Южной Кореи (рис. 2).
Отечественная селекция представлена 69 культиварами, что составляет 30% сортовой коллекции ГУ ВРБС и около 20 % от всех сортов, выведенных на территории бывшего СССР. Условные обозначения: 1. Швеция. 2. Великобритания. 3. Япония. 4. Новая Зеландия. 5. Польша. 6. США. 7. СССР. 8. Германия. 9. Голландия. 10. Канада. 11. Франция. 12. Другие.
В коллекции имеются 35 сортов Никитского ботанического сада селекционеры М.А. Бескаравайная и А.Н. Волосенко-Валенис, 10 сортов селекции М.И. Орлова, 8 - М.Ф. Шароновой, 9 - У.Я. Кивистик и А. Кивистик, 2 - Л. Бакявичуса, 1 сорт, выведенный А. Вайгла.
Для Волгоградской области аборигенами являются только три вида из коллекции —C.integrifolia L. из одноименной группы, C.orientalis L. из группы Tangutica и С.recta L. из группы Flammula.
Продолжительность периода роста вегетативных побегов у разных мелкоцветковых групп клематиса неодинаковая. Обычно в последней декаде марта, первой декаде апреля начинают вегетировать клематисы групп Atragene Viorna, Viticella, на неделю позже — Tangutica, Texensis, Montana, Integrifolia, еще позже Heracliefolia, Vitalba. В Волгоградской области в течение июня— июля у многих видов клематиса обычно заканчивается рост побегов.
Период роста вегетативных побегов у разных групп не одинаков — от 1,5 до 5 месяцев. Нередко у одних и тех же видов он колеблется по годам.
Как и мелкоцветковые группы, сорта клематиса входящие в Раннюю и Позднюю крупноцветковые группы различаются между собой по продолжительности периода роста вегетативных побегов. В третьей декаде марта начинают вегетировать такие сорта как: Victoria; Лесная Опера; Никитский Розовый; Asao и др. Большинство г же сортов и форм начинает вегетацию в течение первой декады апреля. Позже других, в конце апреля, приступают к росту Ramona, Салют Победы, Paul Farges, Брызги Моря. Большинство сортов и форм заканчивает рост побегов в течение июня, и только Ville de Lyon и Paul Farges заканчивают его к середине июля.
Зависимость укоренения от сроков черенкования и температуры
Практически во всех работах по вегетативному размножению используется процент укоренения, как основная количественная характеристика, однако, на наш взгляд, эта величина не дает полного представления о процессе ризогенеза. Поэтому, кроме процента укоренения нами учитывались следующие данные - минимальная и максимальная, а также суммарная длина корней каждого черенка. Результаты, полученные в ходе эксперимента, показали 100 % укоренение черенков с 09.08 по 06.09, однако, средняя длина корней была разной в зависимости от среднедневных температур, что можно видеть при наложении на температурный график (рис. 3) графика зависимости длины корней от сроков черенкования (рис. 4).
В периоды увеличения температуры выше критической (30С) темпы ризогенеза заметно снижались, хотя процент укоренения черенков и достигал максимального. Отрицательное влияние на процессы ризогенеза оказывало и снижение среднедневной температуры ниже 25С, а также увеличение температурного градиента до 15-20С.
В ходе исследований был поставлен эксперимент по укоренению 106 видов и сортов (табл. 3), в том числе 6 сортов, прошедших стадию адаптации после культуры in vitro. Полученные результаты показали существенные отличия, как между сортовыми группами, так и между сортами внутри групп.
Полученные результаты существенно отличаются от данных ГНБС. 100% укореняемость получена у 47 сортов, что составляет 44% от общего числа сортов используемых в эксперименте, у 28 сортов - от 80 до 100%. У 16 сортов - от 60 до 80%. От 40 до 60% у 9% и только 6% сортов показали укореняемость менее 40%.
Распределение по группам достаточно равномерное, исключение составляют группа Flammula - С. recta L. (28,57%) и группа Texensis у которой также не удалось добиться 100% укоренения черенков.
Как отмечалось ранее, процент укоренения, как основная количественная характеристика, не дает полного представления о процессе ризогенеза. Так, например, сорта Toki, Will Godwin, Paul Farges, Asao и др. имеют 100% укоренение, однако суммарная длина корней варьирует от 28 до 181,5 мм., что говорит о разных способностях к ризогенезу. Для получения более точного представления об укоренении нами оценивались также количество корней, min., max., а также их суммарная длина. Кроме этого процент укоренения фиксировался через 3, 4 и 5 недель (табл. 4).
В ходе проведенного эксперимента максимальную способность к ризогенезу показали сорта Ранней крупноцветковой и Поздней крупноцветковой групп. Сорта Franziska Marie, Minister, Гибрид Орлова, Махровый, Ernest Markham, Huldin через 3 недели показали 100% укореняемость. Также через 3 недели начинал укореняться сорт Emilia Platter группы Viticella. Через 4 недели все сорта Ранней крупноцветковой имели 100% укореняемость, в то время как сорта Поздней крупноцветковой достигали такого же показателя только через 5 недель. Через 4 недели максимального показателя достигали сорта групп: Integrifolia; Tangutica; Vitalba.
В ходе наблюдений было установлено, что, не смотря на все попытки подобрать черенки одного размера, укоренение, тем не менее, происходит по-разному. В связи с этим был проведен эксперимент по выявлению зависимости средней длины корней от массы черенка (рис. 5). Полученная графическая зависимость показывает, что с увеличением массы черенка увеличивается способность к корнеобразованию, что обусловлено эндогенным содержанием питательных веществ. Можно предположить, что функциональная зависимость f(x), где х - масса черенка, f(x) суммарная длина корней является линейной на некотором интервале, т.е. имеет вид f(x)=kx+b. Однако, для получения такой зависимости необходимо максимально расширить интервал области определения функции, что и планируется сделать в ходе следующих экспериментов.
В литературных источниках даются рекомендации по уменьшению листовой пластинки при черенковании. Однако, в данном случае значительно уменьшается количество питательных веществ образованных в черенке в процессе фотосинтеза. С целью уточнения этих данных был заложен эксперимент по влиянию величины листовой пластинки на укоренение черенков клематиса в условиях искусственного тумана.
Зависимость суммарной длины корней черенка от величины листовой пластинки Результаты показывают, что при отсутствии транспирации наблюдается четкая зависимость: увеличения корнеобразования с увеличением площади листовой пластины. На графике данные представлены 3 точками, для выявления функциональной зависимости необходима закладка эксперимента с максимально возможным количеством значений переменной х и последующим построением графика f(x) . Причем функция может быть нелинейной.
Полученные экспериментальным путем данные позволяют заложить основу для дальнейшего математического анализа процессов корнеобразования при зеленом черенковании. Кроме этого данные, полученные в ходе исследования, значительно отличаются от многих работ по данной тематике, и позволяют сделать вывод о возможности черенкования клематисов в условиях Волгоградской области на протяжении всего вегетационного периода, не смотря на периодическое влияние высоких температур (до 38), являющихся основным лимитирующим фактором в указанном регионе.
Изолирование и стерилизация первичных эксплантов
На этапе микроразмножения и укоренения in vitro осуществлялся подбор оптимальных концентраций ауксинов и цитокининов. Изучалось влияние их на динамику развития регенерантов, коэффициент размножения, каллусогенез, ризогенез, и определялась оптимальная продолжительность пассажа. Изучались. другие факторы, влияющие на пролиферацию.
По данным некоторых авторов (Муратова, Янковская, 2003), сочетание цитокининов_ _с ауксинами обеспечивает —увеличение—коэффициента" размножения. На предварительном этапе работы, с целью подбора оптимального сочетания, было использовано 42 варианта питательной среды с различным комбинациями фитогормонов (табл. 5). В качестве основы, использовали модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга (1962), содержащую аскорбиновую кислоту (100 мг/л), тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту по 0,5 мг/л, 2 % сахарозы.
Полученные экспериментальным путем данные, подтвердили наличие положительного эффекта при совместном использовании 6-БАП и ИУК. При использовании сред с концентрацией 6-БАП — 2,5 мг/л максимальный коэффициент размножения был получен при добавлении ОД мг/л ИУК и был равен 7, на среде без ауксинов - 6,25. Коэффициент размножения увеличился на 11 %. На среде с концентрацией 6-БАП- 5 мг/л увеличение составило 8,3%, с концентрацией 6-БАП - 1 мг/л только 3,6%.
Полученная графическая зависимость (рис. 9) коэффициента размножения от двух переменных представляет собой поверхность, имеющую экстремум-в - точке-с координатами" (2, 5; ОД; 7). Данная точка на графике характеризует оптимальное сочетание фитогормонов.
Полученные нами результаты- показывают, что максимальный положительный эффект при совместном использовании 6-БАП и ИУК составляет 11% по отношению к средам без ауксинов. Разница является незначительной, а наличие в среде даже небольших концентраций ИУК приводит к более активному процессу каллусогенеза уже на ранних этапах
В ходе эксперимента было установлено, что максимальный коэффициент размножения достигается на среде с концентрацией 6-БАП 2,5 мг/л., однако, увеличение концентрации с 1 до 2,5 мг/л приводит к увеличению коэффициента всего на 14%, и в тоже время частично приводит к образованию витрифицированных побегов. Дальнейшее увеличение концентрации до 5 мг/л приводит к витрификации 100% регенерантов и снижению коэффициента размножения. Таким образом, можно сделать вывод, что оптимальная концентрация 6-БАП на этапе микроразмножения лежит в интервале от 1 до 2,5 мг/л. Учитывая совокупность данных по относительному приросту регенерантов и каллусогенезу (рис. 10), следует остановиться на концентрациях приближенных к началу этого интервала. 120 2,5 3 3,5
С целью уточнения полученных данных был заложен эксперимент с представителями трех сортовых групп: Montana — С. montana Buch.-Ham. ex. DC; Viticella - Purpurea Plena Elegans; Ранняя крупноцветковая - Multi Blue. Концентрации 6-БАП менялись в интервале от 1,0 мг/л до 2,4 мг/л с шагом 0,2 мг/л (табл. 6).
Полученные данные, не только подтвердили вывод о нахождении оптимальной концентрации 6-БАП в интервале (1;2,5), но и показали существенное влияние генотипа на коэффициент размножения в культуре in vitro, что и было продемонстрировано в ходе последующих экспериментов.
На этапе размножения отчетливо проявились видовые и сортовые особенности клематиса, что выражалось в различном количестве дополнительно заложенных почек и развивающихся из них в последствии побегов. Коэффициент размножения некоторых представителей садовых групп представлены в таблице 7.
Hanajima I. Group 2,0±0,26 Zoin (Inspiration) I. Group 3,1 ±0,28 Baltyk L. L. Group 1,6±0527 Comtesse de Bouchaud L. L. Group 1,9±0,18 Pink Fantasy L. L. Group 2,4±0,16 Ядвига Валенис L. L. Group 2,5±0,22 Viola L. L. Group 2,7±0,30 Лесная Опера L. L. Group 2,8±0,29 Юбилейный 70 L. L. Group 2,8±0,25 Roko-Kolla L. L. Group 3,0±0,26 Ялтинский Этюд L. L. Group 3,0±0,21 Никитский Розовый L. L. Group 3,3±0,15 Polish Spirit L. L. Group 3,4±0,27 Rouge Cardinal L. L. Group 3,7±0,26 Альпинист L. L, Group 4,0±0,21 Blekitny Aniol L. L. Group 4,6±0,22 Duchess of Albany(18..) Tex. Group 2,0±0,26 Princess Diana Tex. Group 1,9±0,18 Clematis serratifolia Rehder Tg. Group 1,3±0,21 Anita Tg. Group 3,0±0,21 91 Таблица 7 (продолжение) Clematis montana Buch.-Ham. ex. M. Group 3,8±0,29 Clematis pitcheri Torr. & A. Gray Vior. Group 2,0±0,26 Odoriba Vior. Group 2,6±0,16 Clematis brevicaudata DC. Vit. Group 1,4±0,27 Clematis vitalba L. Vit. Group 3,1 ±0,28 Alba Luxurians Vitic. Group 1,0±0,00 Etoile Violette Vitic. Group 1,8±0,00 Kermesina Vitic. Group 2,3±0,15 Minuet Vitic. Group 2,3±0,21 Pagoda Vitic. Group 3,4±0,27 Cicciolina Vitic. Group 3,7±0,21 Rapina Roosa Vitic. Group 4,2±0,20 Purpurea Plena Elegans Vitic. Group 4,9±0,23 I. E. L. Group - Ранняя крупноцветковая группа. 2. F. Group - Flamraula группа 3. For. Group - Forsteri группа. 4. I. Group - Integrifblia группа. 5. L. L. Group - Поздняя крупноцветковая. 6. M. Group - Montana группа 7. Tex. Group - Texensis группа 8. Tg. Group - Tangutica группа 9. Vior. Group - Vioma. группа 10. Vit. Group - Vitalba группа 11. Vitic. Group -Viticella группа.
Самая большая вариабельность коэффициента размножения наблюдалась в Ранней крупноцветковой группе, от 1,6 у сортов Evipo024(N)(Picardy), Mevrouw Le Coultre до 5,5 у сорта Полярный. От 1,0 у сорта Alba Luxurians до 4,9 у сорта Purpurea Plena Elegans варьировал коэффициент размножения в группе Viticella. Поздняя крупноцветковая группа также отличалась большим разбросом значений от 1,6 до 4,0 у сорта Альпинист.
Промежуточное положение занимают группы Vitalba, Montana, Integrifolia. Максимальное значение коэффициента размножения - 3,8 у С. montana Buch.-Ham. ex. DC. из группы Montana. У сорта Zoin (Inspiration) из группы Integrifolia и С. vitalba L. из одноименной группы коэффициент равнялся 3,1. Минимальные значения коэффициента размножения были отмечены в группах: Flammula - 2,7 С. recta L.; Forsteri - 1,8 Pixie; Texensis — 1,9 Princess Diana.
Полученные данные дают основание считать, что индивидуальные особенности сортов клематисов оказывают значительное влияние на интенсивность пролиферации в культуре меристем in vitro. Для некоторых сортовых групп необходимо подбирать оптимальные концентрации цитокининов, макро -и микроэлементов, углеводов.
Также был поставлен опыт по выявлению наиболее эффективных цитокининов для трудно размножаемых сортов.
В исследованиях использовали изолированные апексы сорта Princess Diana группы Texensis. В модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга (1962) добавляли: 6-БАП и 6-БАПр в концентрациях 0,5 мг/л; Z, Zp и 2 ip в концентрациях 1 мг/л; TDZ в концентрации 0,2 мг/л; ЦФ в концентрации 0,5 мг/л и К в концентрации 1 мг/л. Контролем являлась среда, свободная от гор- - монов. В ходе эксперимента учитывали следующие показатели: Кг " (коэффициент размножения) - количество микрорастений, развившихся из одного экспланта; Кг і - коэффициент размножения с учетом возможного микрочеренкования; L - суммарная длина микрорастений (табл. 8).
На безгормональной среде меристематические верхушки развивались в одиночные растения со строгим апикальным доминированием. Кг равнялся 1, но за счет суммарного прироста эксплантов до 64 мм, появлялась возможность микрочеренкования.
При использовании в качестве цитокининов, 6-БАП и 6-БАПр, в сравнении с контрольным вариантом коэффициент размножения увеличился с 1,0 до 2,0 растений из одной меристемы; однако суммарная длина отличалась более чем в два раза. На среде с использованием 6-БАП Кгі равнялся 6,4, а на среде с 6-БАПр - Кг достигал 10,2.
