Введение к работе
Актуальность проблемы
Рассеянный склероз (PC) - распространенное аутоиммунное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС), которое поражает в основном лиц молодого возраста и почти неизбежно приводит на определенной стадии своего развития к инвалидизации [Compston A., Coles А., 2002].
В основе патогенеза PC лежит аутоиммунный процесс, который выражается
в активации, дифференцировке и пролиферации Т-клеток, имеющих
специфические рецепторы к компонентам миелина, т.е. в образовании аутореактивных Т-клеток, индуцирующих развитие демиелинизирующего процесса. Причем, ведущая роль в развитии иммунопатологического процесса при PC принадлежит популяции CD4 Т-клеток. Считается, что CD4 Т-лимфоциты первыми встречаются с антигеном и приобретают свойства эффекторных миелин-специфических клеток [Delgado S., Sheremata W.A., 2006; Hemmer В. et al., 2002].
Активация Т-клеток происходит при взаимодействии соответствующего рецептора Т-лимфоцита и аутоантигена, связанного с молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса, который экспрессируется на антиген-презентирующих (АПК) клетках, после чего происходит пролиферация и дифференцировка аутореактивных Т-клеток. В результате Т-лимфоциты приобретают аутоагрессивные свойства. На следующем этапе происходит проникновение активированных Т-лимфоцитов через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) в ЦНС и их взаимодействие с антигенами собственного миелина, в результате развивается воспалительный процесс, который приводит к повреждению миелина головного и спинного мозга.
По современным представлениям, развитие аутоиммунных заболеваний связано не только с дифференцировкой, пролиферацией и активацией эффекторных Т-клеток, но и с нарушением супрессорных механизмов, которые контролируют толерантность Т- и В-лимфоцитов к аутоантигенам [Mills К.Н. et al., 2004].
Ключевую роль в механизмах иммуносупрессии играют регуляторные Т-клетки с фенотипом CD4+CD25+Foxp3+ (Т per). Т per в норме составляют 3-5 % от
общего числа CD4 Т-клеток в периферической крови и лимфоидных тканях. Т per созревают в тимусе и на 3-4 день неонатального развития расселяются в кровь и периферические лимфоидные органы [Sakaguchi S. et al., 1995].
У больных аутоиммунными заболеваниями выявлено значительное снижение количества и нарушение функции Т per. Так, дефект Т per показан у больных системной красной волчанкой [Lyssik E.Y. et al., 2007], сахарным диабетом 1 типа [Dejaco С. et al., 2006], псориазом [Sugiyama Н. et al., 2005], ревматоидным артритом [Pohlers D. et al., 2007].
Проведенные в настоящее время исследования показали, что имеется возможность увеличить количество Т per, выделенных из крови пациента, культивированием их в условиях ex vivo [Selvaraj R.K., Geiger T.L., 2008; Allan S.E. et al., 2008]. При этом, полученные культивированием Т per высоко стабильны, долго живущие, обладают супрессорными свойствами, неспецифичны и неиммуногенны и введение этих клеток пациенту с целью восстановления Т per в крови больного до уровня нормы может стать инструментом коррекции иммунных нарушений при аутоиммунных заболеваниях [Peters J.H. et al., 2008; Thornton A.M. el., 2010].
Проведены пилотные испытания по введению аутологичных культивированных Т per больным системной красной волчанкой [Lyssik Е. Y. et al., 2007], диабетом 1-го типа [Godetm Е., Summers-Torres D. et al., 2008], пациентам с реакции трансплантант-против хозяина после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток [Корсунский И.А. и соавт., 2008; Riley J.L. et al., 2009]. При этом, получено достоверное увеличение количества Т per в периферической крови этих больных, которое коррелировало с улучшением клинических показателей и не вызывало побочных реакций у больных.
В последнее время появились работы, посвященные изучению роли Т per в патогенезе рассеянного склероза [Haas J. et al., 2005, 2007; Venken К. et al., 2007, 2008, 2010; Feger U. С et al., 2007].
Установлено, что T per играют определенную роль в нарушении регуляторных механизмов в аутоиммунитете, приводящих к развитию и прогрессированию PC. В то же время, результаты исследований количества и функциональной активности при PC отличаются значительной разноречивостью,
что обусловлено недостаточностью сопоставлений количества и функциональной активности Т per с клинической картиной заболевания. Помимо этого, в настоящее время имеются лишь единичные описания результатов культивирования Т per больных PC, а попыток использования Т per в терапевтических целях при этом заболевании не проводилось.
В связи с вышеизложенным были сформулированы цели и задачи исследования.
Цели и задачи исследования
Целью настоящего исследования является изучение роли регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ в патогенезе рассеянного склероза. Задачи исследования:
Исследовать состояние клеточного иммунитета больных ремитирующим PC путем изучения содержания основных субпопуляций лимфоцитов (фенотипы CD3+, CD4+, CD8+, CD16+56+, CD19+) на различных этапах заболевания.
Изучить количество регуляторных Т-клеток CD4 CD25 Foxp3 в крови больных PC в зависимости от стадии заболевания (обострение, ремиссия), длительности и тяжести его течения.
Изучить функциональную активность Т per у больных PC в стадии обострения и ремиссии.
Провести культивирование ауто логичных Т per, выделенных из крови больных PC, с целью получения линий этих клеток (индукция Т per ex vivo) и сравнить их фенотипические и функциональные характеристики с нативными Т per.
Выполнить введение выращенных ex vivo регуляторных Т-клеток CD4 CD25 Foxp3 для коррекции иммунных нарушений у больных PC, от которых эти клетки были получены.
Научная новизна. Впервые исследовано количество и функциональная активность регуляторных Т-клеток CD4 CD25 Foxp3 в крови больных PC в зависимости от стадии заболевания. При этом, установлены значимые корреляции стадии демиелинизирующего процесса с количеством Т per. Проведено культивирование аутологичных Т per путем их индукции ex vivo и доказана идентичность культивированных и нативных клеток. Впервые выполнено введение выращенных ex vivo аутологичных регуляторных Т-клеток с целью коррекции иммунных
нарушений у больных PC. Выявлено, что введение таких аутологичных клеток больным приводит к увеличению содержания Т per в крови и хорошо переносится пациентами, и может в дальнейшем рассматриваться как новый подход к терапии этого заболевания.
Практическая и теоретическая значимость работы. На основании проведенного исследования расширены представления о взаимосвязи количественного и функционального дефекта регуляторньгх Т-клеток в механизмах формирования иммунопатологического процесса при PC, что имеет значение для понимания роли регуляторньгх механизмов в патогенезе этого заболевания. Результаты проведенного исследования имеют важное практическое значение в плане диагностического показателя наступающего обострения PC при снижении количества Т per и формирования ремиссии заболевания при повышении числа этих клеток в крови больных. Выявлено, что регуляторные Т-клетки CD4 CD25 Foxp3 можно выделить из периферической крови больного и вырастить в лабораторных условиях достаточное количество клеток, которое может компенсировать их дефицит в организме и соответственно применяться для коррекции иммунных нарушений при PC. Основные положения, выносимые на защиту:
Иммунофенотипическое исследование крови больных PC выявило дисбаланс CD4 и CD8 Т-клеток за счет повышения количества CD8 Т-клеток.
Выявлено снижение количества Т per в крови больных PC в целом по группе. Установлено, что в стадии обострения PC количество Т per значительно снижено, а переход в стадию ремиссии заболевания характеризуется ростом их числа.
Отмечено снижение функциональной активности Т per, выделенных из периферической крови больных PC, как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии заболевания.
Установлена обратная зависимость между количеством Т per и степенью инвалидизации и длительностью PC, что является отражением степени активности иммунопатологического процесса.
В результате культивирования аутологичных Т per больных количество этих клеток увеличивается в десятки раз. При этом, культивированные Т per по
фенотипическим и функциональным характеристикам идентичны нативным. Введение выращенных ex vivo аутологичных Т per больным PC позволяет повысить уровень Т per в крови больных и не вызывает побочных эффектов. Апробация работы. Работа апробирована и рекомендована к защите на совместном заседании сотрудников I, II, III, V, VI неврологических, нейрореанимационного и научно-консультативного отделений, отделения лучевой диагностики, лабораторий нейрохимии, гемореологии и гемостаза, эпидемиологии и профилактики заболеваний нервной системы, клинической нейрофизиологии и патоморфологии Научного центра неврологии РАМН 06 апреля 2011 г.
Материалы диссертации были представлены и обсуждены на: заседании XVII Всероссийской конференции «Нейроиммунология. Рассеянный склероз» (Санкт-Петербург, 2009 г.), IX Международном конгрессе «Новые направления иммуносупрессии и иммунотерапии" (Женева, 2010 г.), Совете молодых ученых НЦН РАМН (Москва, 2011 г.), V Сибирской межрегиональной научно-практической конференции «Рассеянный склероз: 30 лет спустя» (Новосибирск 2011 г.), V Международной конференции по иммунологической регуляции (Давос,
2011г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5 в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 120 страницах
