Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы.
1.1. Представление о стрессе и его роли в процессе срочной адаптации военнослужащих.
1.2. Современные концепции патогенеза пиодермии
1.3. Состояние иммунной системы при пиодермии
1.4. Система цитокинов и ее роль в межклеточных взаимодействиях при воспалительных процессах
1.5. Современные методы лечения пиодермии
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Дизайн исследования
2.2. Характеристика обследуемых военнослужащих
2.3. Антропометрические и физиометрические методы исследования
2.4. Лабораторные методы исследования
2.5. Иммунологические и цитохимические методы исследования
2.6. Психологические методы исследования.
2.7. Статистические методы исследования
Глава 3. Результаты исследования здоровых военнослужащих
3.1. Определение уровня соматического здоровья
3.2. Изучение адаптационных реакций, показателей гормонального фона и вегетативного тонуса в зависимости от уровня здоровья
3.3. Оценка психоэмоционльного статуса и уровня тревожности
3.4. Анализ динамики иммунологических показателей в разных группах здоровья
Глава 4. Результаты исследования больных пиодермиями
4.1. Результаты бактериологического исследования.
4.2. Клиническая характеристика больных пиодермиями.
4.3. Динамика показателей функциональной активности клеточного, гуморального и фагоцитарного звеньев иммунитета.
4.4. Оценка и сравнительный анализ цитокинового профиля в разных группах больных.
Глава 5. Изучение клинико-иммунологической эффективности Стемокина у больных пиодермиями .
5.1. Сравнительная оценка клинической эффективности различных методов лечения
5.2. Динамика иммунологических и физиометрических показателей у больных пиодермиями при различных методах лечения
5.3. Результаты профилактического лечения иммунокомпрометированных военнослужащих
Заключение
Выводы
Практические рекомендации
Список литературы
- Состояние иммунной системы при пиодермии
- Лабораторные методы исследования
- Изучение адаптационных реакций, показателей гормонального фона и вегетативного тонуса в зависимости от уровня здоровья
- Динамика иммунологических и физиометрических показателей у больных пиодермиями при различных методах лечения
Введение к работе
Актуальность темы
Проблема профилактики и лечения пиодермий продолжает оставаться одной из основных в современной дерматологии, в том числе и в военной медицине. Распространенность и неуклонный рост числа больных с этой патологией определяют актуальность данной проблемы.
Пиодермии составляют 1/3 всей инфекционной патологии и занимают первое место среди заболеваний дерматовенерологического профиля. По данным ряда авторов, инфекции кожи составляют около 30-40% всей дерматологической патологии у лиц трудоспособного возраста [Белькова Ю.А., 2005; Курбонбекова П.К., 2005; Гладько В.В., 2006; Старцева С.В., 2009; Полякова А.А. 2009, Масюкова С.А., 2010].
У военнослужащих срочной службы заболеваемость пиодермиями гораздо выше и составляет 52,8 - 66,5 % от общей заболеваемости дермато-венерологического профиля и 63,8 - 75,2 % от всей заболеваемости болезнями кожи и подкожной клетчатки. Высокая заболеваемость является наиболее частой причиной трудопотерь в ВС РФ и негативно отражается на подготовке молодых бойцов [Скорик И.А., 2006; Васько Ф.В., 2008; Тутельян А.В., 2010].
В этиологии пиодермии ведущее место отводится стафилококку и его ассоциации с другими микроорганизмами, вирулентность и инвазивность которых определяет развитие воспалительного процесса. Бактериальные патогены, обладая иммуномодулирующей активностью, вызывают иммунодефицитные состояния, степень выраженности которых влияет на тяжесть заболевания. Данные литературы свидетельствуют о влиянии микрооргнизмов на систему врожденного иммунитета, что проявляется в частности нарушением продукции иммуннокомпетентными клетками цитокинов, которым принадлежит ключевая роль в реализации противоинфекционной защиты. Синтез цитокинов подавляется либо при непосредственном воздействии бактериальных патогенов, либо опосредованно, путем супрессии внутриклеточных сигналов активации и механизмов сигнальной трансдукции и транскрипции. [Симбирцев А.С., 2005; Menzies B. et al., 2006; Tsao N. et al., 2006; Hair P. et al., 2008; Terao Y. et al., 2008].
Исход взаимодействия патоген - организм во многом зависит от функционального состояния последнего [Зима А.П., 2008], который, у 35% молодых военнослужащих имеет низкие резервные способности [Мосягин И.Г., 2007; Миняйлов Н.А., 2009; Разинкин С.М., 2010].
Известно, что условия и специфика служебной деятельности военнослужащих сопряжены с целым рядом неблагоприятных факторов. Перенапряжение динамического стереотипа, обусловленное значительной разницей с прежним жизненным укладом и этническими особенностями, необходимость выполнения служебных обязанностей независимо от метеоусловий и времени суток, что ведет к нервно-психическим перегрузкам. Перенапряжение организма молодого бойца на фоне низких резервных возможностей ухудшает функциональное состояние организма и не позволяет в приемлемые сроки адаптироваться к армейским условиям [Руженков В.А., 2007; Семенцов В.К., 2010; Шамрей В.К., 2010].
Срыв адаптационных механизмов является дополнительным фактором, способствующим развитию пиодермий, так как нарушения физиологических процессов (нейроэндокринная регуляции, иммунитет, адаптация и др.) способствуют активации условно-патогенной микрофлоры.
В сложившихся условиях одной из важнейших задач военной медицины является снижение заболеваемости пиодермиями путем укрепления здоровья военнослужащих и поиск новых эффективных средств для их лечения и профилактики. [Быков И.Ю., 2006; Белевитин А.Б., 2007].
Учитывая вышеизложенное, представляется актуальным изучение функциональных изменений, происходящих в организме молодых военнослужащих на начальном этапе пребывания в воинской части, и их связи с бактериальными поражениями кожи.
Цель работы: Изучить связь между степенью адаптации, уровнем соматического здоровья и клинико-иммунологическими особенностями течения пиодермии у военнослужащих срочной службы, оптимизировать методы лечения и профилактики.
Задачи исследования:
-
Изучить антропометрические, физиометрические и гемодинамические показатели у военнослужащих первого года службы и на основе проведенного скринингового обследования определить уровень их соматического здоровья.
-
Определить адаптационные возможности, особенности вегетативной регуляции, гормональный и психоэмоциональный статус военнослужащих и связь изучаемых параметров с уровнем соматического здоровья.
-
Оценить влияние стресса на функциональное состояние иммунокомпетентных клеток у военнослужащих с разным уровнем здоровья.
-
Изучить клинико-иммунологические особенности течения пиодермии у военнослужащих с разным уровнем здоровья, в том числе определить содержание цитокинов в периферической крови и выявить общие закономерности цитокинопосредованной регуляции иммунного ответа.
-
Изучить терапевтические возможности нового отечественного синтетического трипептида Стемокин и на основе полученных клинико-иммунологических данных разработать патогенетически обоснованный комплексный метод лечения больных пиодермией.
-
Оценить результаты иммунопрофилактики пиодермии у военнослужащих первого года службы препаратом Стемокин и определить возможность его включения в комплекс профилактических мероприятий, направленных на снижение заболеваемости пиодермиями в ВС.
Научная новизна
-
Впервые на основании данных комплексного психофизиологического обследования проведено изучение адаптационных возможностей, гормонального фона, психологических характеристик и иммунологических параметров в группах военнослужащих с разным уровнем здоровья. Показано, что процесс адаптации новобранцев к условиям воинской службы характеризуется активацией гипофизарно-надпочечниковой системы и повышением уровня стрессорных гормонов: АКТГ и кортизола, динамика изменения которых определяется уровнем соматического здоровья.
-
Впервые показано, что особенности клинического течения пиодермии у военнослужащих срочной службы зависят от уровня их соматического здоровья. У военнослужащих с низким уровнем здоровья пиодермии возникают в 4 раза чаще и протекают менее благополучно по сравнению с военнослужащими с высоким уровнем здоровья. Среди клинических форм пиодермии в 1,5-2 раза чаще встречаются фурункулез, карбункулы, гидрадениты. Язвенная пиодермия наблюдается только среди военнослужащих с низким уровнем здоровья.
-
Впервые показано, что психоэмоциональный стресс у военнослужащих с низким уровнем здоровья вызывает дисбаланс в иммунной системе, что проявляется угнетением клеточного и стимуляцией гуморального звеньев иммунитета. Течение пиодермии у таких военнослужащих приводит к усугублению имеющихся иммунных нарушений и формированию вторичной иммунной недостаточности с угнетением всех звеньев иммунного ответа. У военнослужащих с высоким уровнем здоровья стресс не влияет на состав иммунокомпетентных клеток и течение пиодермии и проявляется у данной категории больных незначительной активацией Т-клеточного звена иммунитета.
-
Впервые показана высокая клиническая эффективность и безопасность применение нового отечественного синтетического трипептида Стемокин в лечении и профилактике больных пиодермиями. Применение Стемокина способствует коррекции показателей Т-клеточного звена иммунитета, восстанавливает соотношение Th1/Th2 цитокинов и приводит к нормализации иммунного ответа.
Практическая значимость
Определение соматического здоровья и уровня тревожности военнослужащих позволяет прогнозировать степень адаптации и вероятность развития пиодермий. Высокая личностная тревожность и низкий уровень здоровья способствуют срыву адаптационных механизмов, развитию пиодермии и являются показанием к проведению иммунопрофилактики.
Определение соотношение Th1/Th2 цитокинов при пиодермии позволяет оценить тяжесть течения заболевания и решить вопрос о целесообразности иммунокоррекции. Высокий уровень IL-4 и IL-10, на фоне низких значений IFN- и IL-2 является патогенетическим обоснованием для назначения иммуномодулирующей терапии.
Показано, что профилактическое, интраназальное применение Стемокина повышает адаптационно-компенсаторные возможности военнослужащих, снижает риск возникновения заболевания в 3,5 раза и способствует более легкому течению пиодермии. Высокая клиническая эффективность и безопасность Стемокина позволяют рекомендовать его в качестве профилактического средства у иммунокомпрометированных военнослужащих.
Включение препарата Стемокин в комплексное лечение больных пиодермией повышает эффективность терапии, способствует быстрому разрешению клинических проявлений болезни и нормализует показатели клеточного и гуморального звеньев иммунитета. Высокий терапевтический и иммуномодулирующий эффект Стемокина, отсутствие осложнений и побочных реакций при его применении позволяют рекомендовать широкое использование препарата в комплексном лечении больных пиодермией.
Реализация результатов исследования
Данные диссертационного исследования внедрены в учебный процесс и используются при чтении лекций и проведении практических занятий клиническим интернам, ординаторам, врачам-слушателям циклов повышения квалификации на кафедре дерматовенерологии ГИУВ МО РФ. Комплекс лечебно-профилактических мероприятий внедрен в клиническую практику Лечебно-диагностического центра МО РФ № 9, ГВКГ им. Н.Н.Бурденко МО РФ, ЦВКГ им. А.А.Вишневского, клиники «Астери Мед».
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
Экстремальные условия военной службы у военнослужащих с низким уровнем здоровья вызывают развитие стресс-реакции, для которой характерны: активация гипофизарно-надпочечниковой системы с повышением уровня стресс-гормона кортизола и снижением АКТГ, повышение уровня тревожности, нарастание симпатической активности и нарушение механизмов иммунной защиты.
Стресс-индуцированная иммуносупрессия является фактором риска развития пиодермии, способствует тяжелому клиническому течению воспалительного процесса и является показанием для проведения пиммунопрофилактики и иммунотерапии.
Особенностью стресс-индуцированных пиодермий является цитокин-опосредованная дисрегуляция иммунокомпетентных клеток, обусловленная одновременным повышением Th1 и Th2 цитокинов и торможением иммунного ответа любого типа.
Включение отечественного иммуномодулирующего препарата Стемокин в комплекс лечения больных пиодермиями, повышает эффективность терапии, способствует быстрому разрешению кожного процесса, позволяет стабилизировать нейрогуморальные и психофизиологические процессы и восстанавливает трудоспособность у военнослужащих.
Апробация диссертации
Материалы исследования доложены и обсуждены на V научно-практической конференции «Терапия социально значимых заболеваний в дерматовенерологии. Новые лекарственные препараты и средства в дерматологии и косметологии» (Москва, 2005); плановых конференциях кафедры дерматовенерологии ГИУВ МО РФ (Москва, 2007-2009); Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петенрбург, 2007); научно-исторической конференции «Роль Московской гошпитали в становлении и развитии отечественного государственного больничного дела, медицинского образования и науки» (Москва, 2007); XXVI научно-практической конференции «Рахмановские чтения. Современная неинвазивная диагностика и аппаратная терапия в дерматовенерологии» (Москва, 2009); всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы оказания специализированной медицинской помощи в условиях стационара и применение стационарозамещающих технологий» (Москва, 2009); Московском научном обществе дерматовенерологов им.А.И.Поспелова (Москва, 2010).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 25 научных работ, из них 15 – в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 243 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав (обзор литературы, описание материала и методов исследования, собственные результаты и их обсуждение), заключения, выводов, списка литературы из 379 источников (250 отечественных и 129 иностранных авторов) и приложений. Работа иллюстрирована 29 таблицами и 18 рисунками.
Состояние иммунной системы при пиодермии
Термин «стресс» впервые ввел H.Selye (179) для описания общего адаптационного синдрома (ОАС) или совокупности неспецифических реакций и психофизиологических изменений, возникающих при чрезмерном действии раздражителя, не зависящего от его природы. В настоящее время стресс понимается как совокупность стереотипных, филогенетически запрограммированных реакций при воздействии на индивида экстремальных факторов (172, 223).
До недавнего времени к числу экстремальных факторов в основном относили климатические условия циркумполярных областей, высокогорья, космические пространства, боевые действия, промышленные аварии, стихийные бедствия, информационные и энергоинформационные воздействия. Однако в последние годы в психологической литературе экстремальными называют условия жизни человека, характеризующиеся высокой неизвестностью будущего при несформированности для субъекта способов достижения текущих и перспективных целей. (147, 178, 320). Экстремальность выявляется только при взаимодействии конкретного фактора с конкретным индивидом (5, 8, 82, 105, 120). Экстремальные факторы подразделяют на физико-химические и информационные. Для первых экстремальность определяется дозой воздействия, для вторых -новизной или когнитивной оценкой реального или прогнозируемого воздействия, представляющего угрозу для человека. Границы, отделяющие обычные условия от экстремальных не определены.
Условия служебной деятельности офицерского и рядового состава ВС России в различных климатогеографических регионах страны сопряжены с целым рядом неблагоприятных эколого-профессиональных факторов, считающихся стрессовыми. Эти условия в большинстве своем экстремальны, так как имеют обязательный характер и не учитывают потребности и желания призывников (149, 173). Каждый новобранец по прибытии в учебное подразделение любой воинской части вынужден адаптироваться к жизнедеятельности в новых условиях, где число стрессорных факторов велико. Наиболее сложным в этом плане представляется начальный период вхождения в воинский коллектив, когда призывник впервые сталкивается со строгой субординацией, с общевоинскими требованиями, регламентирующими повседневное поведение военнослужащих к жизни в условиях казармы; с изоляцией от привычной культурной и бытовой среды, с физическими и моральными перегрузками; когда отсутствие опыта, служебной деятельности и навыков общения в социальной общности, ограниченной параметрами гарнизона или корабля, вызывает чувство тревоги, неуверенности, стремление замкнуться в себе или конформистически приспособиться к микроокружению (60, 126). Каждый из вышеперечисленных факторов в отдельности является незначительным для человека в молодом возрасте, но в комплексе приобретает характер экстремального воздействия и способствует проявлению имеющейся компенсированной патологии и развитию дезадаптационных расстройств. (33, 228).
Известно, что около 15% военнослужащих испытывает трудности в военно-профессиональной деятельности плохо переносят физические нагрузки и плохо выполняют служебные обязанности, нарушают дисциплину, отличаются отрицательной (низкой) мотивацией к служебной деятельности, характеризуются нервно-психической неустойчивостью, повышением заболеваемости (142). Егоров (69) отмечает, что непосредственными ситуационными причинами расстройств адаптации у военнослужащих, проходящих службу по призыву, являются не чрезвычайные дистрессовые обстоятельства, а обыденные трудности воинской службы. При чрезвычайно сильных воздействиях или при низких резервах адаптации возникают дизадаптационные расстройства, клинические проявления которых зависят как от генетической предрасположенности организма, так и от характера повреждающего фактора. Наиболее частыми клиническими проявлениями дизадаптационных расстройств являются: неязвенная диспепсия, синдром вторичного иммунодефицита с частыми инфекционными и респираторными заболеваниями, нейроциркуляторная дистония, астения и реактивные состояния. Именно эти состояния занимают ведущее место в структуре заболеваемости личного состава с их неуклонным ростом в течение нескольких лет.
Адаптация к экстремальным воздействиям - необходимое условие сохранения и укрепления здоровья военнослужащих. Комплекс экстремальных раздражителей, воздействующий на организм новобранца, наносит повреждения и порождает императивную необходимость новой организации физиологически детерминированных противодействующих функциональных систем (ФС) защитно-приспособительного (саногенетического) назначения (223).
В процессе адаптации происходит формирование определенной, функциональной доминирующей системы, или т.н. адаптивной функциональной доминанты (АФД) (ПО). Ухтомский (208) определяет доминанту как - констелляцию нервных центров, подчиняющих себе исполнительные органы, определяющую направление поведенческих реакций организма - его вектор. Старченко А.А. (192) определил АФД как совокупность психо-нейроиммуноэндокринных связей, формирующих различные ФС приспособительного назначения.
АФД может иметь адекватный характер и тогда она соответствует характеру патологического процесса и формирует в организме строго синхронизированные во времени и между собой ФС и их иерархии, или иметь неадекватной характер и проводить к дезадаптации и болезни (8, 33). Так как процесс адаптации происходит путем изменения уровней функционирования отдельных систем и требует расходования определенных ресурсов (информационных, энергетических и метаболических), то совершенно очевидно, что для его нормального течения необходимо наличие изначального потенциала - определенного функционального резерва, дающего помимо вещественных пластических материалов еще и достаточное количество энергии — так называемого адаптивного потенциала (АП) (129, 223). Чем выше функциональные резервы, тем ниже степень напряжения этих механизмов регуляторных механизмов (20).
Учитывая неблагоприятную тенденцию последних 15—20 лет в состоянии здоровья детско-подростковой популяции, наличие у большинства призывников адекватного АП представляется весьма сомнительным. За 5 лет общая заболеваемость среди подростков 15—17 лет увеличилась на 20,3%. Многие авторы отмечают ухудшение здоровья призывного контингента (56). По данным здравоохранения России здоровых школьников, т.е. будущих призывников всего лишь 10% в стране (231). По данным статистических отчетов около 70% подростков страдают хронической патологией. Исследования специалистов Центральной военно-врачебной комиссии МО РФ показывают, что в настоящее время до 35% молодых военнослужащих не способны в приемлемые сроки адаптироваться к армейским условиям (114).
В структуре заболеваемости, по которой, военнослужащие признаются негодными и ограниченно годными к военной службы, ведущей причиной, являются психические расстройства — 47,8%. У каждого 3-го подростка диагностируются нервно-психические заболевания и у более значительной части отмечаются дезадаптивные формы поведения (114, 231).
Лабораторные методы исследования
Известно, что для эффективной антибактериальной защиты важна не только концентрация антител, но и их аффинность. При агрегировании антител на корпускулярном антигене имеется несколько Fc-валентностей для взаимодействия с Fc-рецепторами фагоцитирующих клеток. Каждая отдельная связь Fc-фрагмента антител с соответствующим рецептором, характеризующаяся низкой аффинностью взаимодействия, неэффективна для провокации фагоцитарного захвата антигена. Однако, поскольку бактериальные антигены агрегируют значительное количество антител, точек взаимодействия Fc-фрагмента иммуноглобулинов с Fc-рецепторами на поверхности фагоцитирующей клетки будет много, что повышает авидность взаимодействия и, как следствие, успешное прохождение фагоцитоза.
Исследование антител больных хроническими пиодермиями, в частности хроническим фурункулезом, показало снижение их аффинности к общей антигенной детерминанте бактерий. Снижение специфичности антител и их роль при различных бактериальных инфекциях кожи отмечено и другими авторами (92).
Все те изменения которые наблюдаются при длительно текущих процессах как в В так и Т звене обусловлены структурными изменениями в центральных и периферических имму некомпетентных органах (41). Длительная, истощающая клеточная пролиферация Т и В-зависимых зон лимфатических узлов (в результате антигенной стимуляции), приводит к развитию атрофических процессов, что проявляется запустеванием лимфатического узелка и мозгового вещества, очагами фиброза, частичным или полным жировым перерождением (125). В последние годы значительная роль в патогенезе пиодермии отводится цитокинам (247, 253, 271, 317). Цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов, которые инициируют и регулируют основные этапы развития воспалительного ответа в организме (101, 128, 186, 247, 342).
Эти полипептидные медиаторы межклеточных взаимодействий, к которым относятся - иптерфероны, интерлейкины, группа фактора некроза опухолей, колониестимулирующие факторы, хемокины, трансформирующие ростовые факторы, и некоторые другие - на сегодняшний день, могут быть выделены в новую, самостоятельную систему регуляции организма, существующую наряду с нервной и эндокринной системами и направленную в первую очередь на поддержание гомеостаза.
Особенностью цитокинов является то что основная их часть не синтезируется клетками вне воспалительной реакции и иммунного ответа. Экспрессия цитокинов начинается в ответ на проникновение в организм патогена и/или антигенное раздражение. Наиболее сильными индукторами синтеза цитокинов являются компоненты клеточных стенок бактерий: липополисахариды, пептидогликаны и лгурамилдипептиды.
После инфицирования и/или повреждения тканей в организме человека разворачивается сложная и многокомпонентная последовательность реакций, направленных на предотвращение дальнейшей тканевой деструкции, изоляцию и уничтожение патогена, активацию репаративных процессов и восстановление исходного гомеостаза. Инициация и основные этапы развития воспалительного ответа контролируются, главным образом, провоспалительными цитокинами, которые продуцируются макрофагами, нейтрофилами и Т-клетками в ответ на стимуляцию бактериальными антигенами. Так, эндотоксин грамотрицательных бактерий стимулирует макрофаги и нейтрофилы к продукции TNFa, IL-1, IL-12, IL-8 и IL-6. Экзотоксины, суперантигены грампозитивных бактерий активируют Т-клетки и моноциты к продукции IL-2, IFNg, TNFa и IL-1 (150, 186, 286).
Провоспалительные цитокины играют защитную роль, поскольку обеспечивают рекрутирование в очаг ршфекции эффекторных клеток (нейтрофилов, макрофагов), стимулируют их фагоцитарную, бактерицидную активность и индуцируют запуск антигенспецифического иммунного ответа, что в совокупности способствует элиминации патогена.
Бактериальный антиген, попав в организм, связывается с макрофагами, что приводит к активации последних и высвобождению ими провоспалительных цитокинов - ИЛ-1, ФНО, ИЛ-6, хемокинов и некоторых других. Провоспалительные цитокины играют защитную роль, они вызывают активацию эндотелия, приводящую к увеличению проницаемости, повышению экспрессии адгезионных молекул и усилению прокоагулянтной активности (186, 302). При этом происходит выброс низкомолекулярных медиаторов воспаления, таких, как гистамин, простагландины и др., ответственных за развитие воспалительной реакции в полном объеме (260). Хемокины усиливают направленную миграцию лейкоцитов в очаг воспаления и вместе с другими цитокинами увеличивают их функциональную активность: фагоцитоз и продукцию кислородных радикалов, направленную на элиминацию патогена (186, 258). Одновременно провоспалительные цитокины активируют метаболизм соединительной ткани, стимулируют пролиферацию фибробластов и клеток эпителия, что чрезвычайно важно для заживления повреждения и восстановления целостности ткани. Таким образом, на местном уровне цитокины ответственны за все последовательные этапы развития адекватного ответа на внедрение патогена, обеспечение его локализации и удаления, а затем восстановления поврежденной структуры тканей, где бы ни развивалась воспалительная реакция.
Изучение адаптационных реакций, показателей гормонального фона и вегетативного тонуса в зависимости от уровня здоровья
Иммунологические исследования v Фагоцитарную активность моноцитов и нейтрофилов определяли по их способности поглощать биологически инертные частицы монодисперсного латекса. Моноциты инкубировали в присутствии частиц латекса в течение 1 ч, затем их отмывали окрашывали по Романовскому-Гимза и микроскопировали. Определяли фагоцитарный показатель (ФП) - процент фагоцитирующих клеток; фагоцитарное число (ФЧ) - количество частиц латекса, поглощенных одной клеткой и интегральный фагоцитарный индекс (ИФИ), который рассчитывали по формуле: ИФИ = ФП х ФЧ / 100 (214).
Состояние кислородзависимых систем микробицидной активности нейтрофилов определяли по результатам теста восстановления нитросипего тетразолия (НСТ-теста), который ставили в спонтанном и индуцированном варианте. Степень восстановления нитросинего тетрозолия до диформазана оценивали спектрофотометрически при длине волны 540 нм. Для постановки индуцированного теста во время инкубирования добавляли убитые автоклавированием культуры st. aureus (158, 219). Индекс стимуляции (ИС) определяли по соотношению стимулированного к спонтанному НСТ-тесту.
Фенотипирование лимфоцитов проводили с использованием моноклональных антител фирмы "Сорбент" (Россия) иммунофлюоресцентным методом согласно рекомендациям производителя. Определяли субпопуляции лимфоцитов: CD3+ (зрелые Т-лимфоциты), CD4+ (Т-хелперы/индукторы) и CD8+ (Т-киллеры /супрессоры), CD 16+ (натуральные киллеры), CD25+, CD71+ и CD95+ (активированные лимфоциты), CD19+ (В-лимфоциты), HLA-DR+ (моноциты, В-лимфоциты и активированные Т-лимфоциты), и иммунорегуляторный индекс по отношению процентного содержания CD4 к CD8. Лимфоциты выделяли из гепаринизированной крови общепринятым методом на градиенте Ficoll-Paque (плотность 1,077 г/мл). 1-0,1 млн лимфоцитов в объеме 50 мкл вносили в лунки планшет и добавляли 5 мкл тестируемого моноклонального антитела. Инкубировали 30-45 мин при +4С. Добавляли 150 мкл раствора Хенкса и центрифугировали 5 мин при 1200 об/мин на центрифуге с радиусом 15 см. Удаляли супернатант. Затем вносили 50 мкл раствора Хенкса, клегки суспендировали, после добавляли 150 мкл раствора Хенкса и опять центрифугировали. После заключительного центрифугирования добавляли 50 мкл 1% параформальдегида на забуференном физиологическом растворе. Клетки суспендировали. Суспензию переносили на предметное стекло, накрывали покровным стеклом и просматривали под иммерсией на флуоресцентном микроскопе (объектив х 90 окуляр хЗ). Количество антиген позитивных клеток определяют как % флуоресцирующих клеток при просматривании 200 лимфоцитов за вычетом % флуоресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля. В качестве отрицательного контроля использовали препараты, подготовленные аналогичным образом, за исключением того, что вместо моноклональных антител клетки обрабатывают раствором Хенкса или нормальным Ig мыши. Содержание иммуноглобулинов (М, G и А классов) в сыворотке крови определяли стандартным методом простой радиальной пммунодиффузпи в геле по Манчини (325).
Определение содержания цитокинов в сыворотке крови проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Содержание IL-13, IL-4, TL-6, IL-10, TNF-a и IFN-y определяли с использованием отечественны тест-систем НПО «Протеиновый контур» (Россия); IL-2- и IL-8 с использованием тест-систем ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург); IL-12 — наборами фирмы «Biosource» (США) согласно рекомендациям производителя.
Цитохимические исследования
Выявление катионных белков в цитоплазме лейкоцитов производили с помощью бромфенолового синего по методу Шубнча (241). Фиксировали мазки в 5 % растворе сульфосалициловой кислоты в течение 60 - 90 с. Тщательно промывали дистиллированной водой и высушивали. Окрашивали 0,1 % раствором бромфенолового синего в боратном буфере (реактив № 5) в течение 1-2 мин. Промывали в трех сменах 0,05 М боратного буфера (реактив № 4) по 1-3 мин. Высушивали и докрашивали 0,05 % раствором основного фуксина в течение 1-2 с. Промывали проточной водопроводной водой и высушивали. Катионный белок выявляли в цитоплазме клеток в виде синих гранул.
Исследование миелопероксидазы в пейтрофилытых лейкоцитах проводили методом Graham-Knoll по модификации Нарциссова (136) с добавлением в инкубационную среду перекиси водорода и основного бензидина. Свежеприготовленные мазки фиксировали в 60 % водном растворе ацетона в течение 30с. Промывали дистиллированной водой. Инкубировали в инкубационной среде в течение 1 ч в термостате при 37 С. Промывали дистиллированной водой. Докрашивали мазки метиленовым синим в течение 10 мин.
Динамика иммунологических и физиометрических показателей у больных пиодермиями при различных методах лечения
В 1-й группе военнослужащих показатели гемограммы не отличались от таковых в группе контроля (табл. 16). Отмечено более низкое содержание сегментоядерных нейтрофилов (на 14,38%) и более высокое содержание лимфоцитов (на 15,99%).
Такого рода изменения лейкоцитограммы соответствуют реакции спокойной активации по Гаркави (сегментоядерные нейтрофилы в пределах нижней границы нормы, лимфоциты в пределах верхней границы нормы). Остальные показатели гемограммы в основном не отличались от таковых в контрольной группе, что свидетельствует о нормальном течении процесса адаптации без напряжения регуля горных механизмов и подтверждает отсутствие стрессовой реакции.
Исследование иммунологических показателей начали с изучения фагоцитарного звена, как филогенетически наиболее древнего механизма защиты организма от чужеродных агентов (3, 9). Фагоциты (нейтрофилам и моноцитам) первыми мигрируют из сосудов в. очаг воспаления, быстро активируются, секретируют радикалы кислорода и литические ферменты, а также некоторые цитокины, способствующие элиминации микробного агента из организма. Во вторых, весьма противоречивыми литературными данными: одни указывают на их угнетение, другие - на повышение этих показателей, участвующих в противоинфекциошюй защите при "пиодермии (2, 4, 9).
Исследование фагоцитарной функции проводилось по следующим параметрам: фагоцитарный показатель (ФП) - процент активированных нейтрофилов; фагоцитарное число (ФЧ) - поглотительная способность нейтрофилов; индекс завершенности фагоцитоза (ИФИ), и активности внутриклеточного переваривания (НСТ-тест). НСТ-тест (теста восстановления нитросинего тетразолия) ставили в двух вариантах: спонтанный и индуцированный, подсчитывали индекс стимуляции (ИС). ИС= ст.НСТ/сп.НСТ.
Исследование показало, что у военнослужащих 1-й группы показатели активности и интенсивности фагоцитоза были незначительно выше, чем в контрольной группе (табл. 17). ФП и ФЧ нейтрофилов превышали аналогичные показатели контрольной группы в 1,08 (на 7,8 %) и 1,19 раз (на 18,9 %). Для моноцитов кратность превышения составила - ФП в 1,12 (на 11,58%о), а ФЧ в 1,21 раз (на 21,15%). ИФИ превышал контрольные данные на 23,98% (в 1,24 раз) и составил 2,74±0,38 у.е. против 2,21±0Д2 у.е. в контроле. О кислородзависимом метаболизме нейтрофилов судили по результатам НСТ теста и активности миелопероксидазной системы.
У военнослужащих 1-й группе фагоцитарная активность нейтрофилов, в спонтанном НСТ-тесте не отличалась от контрольных данных - 82,25±9,88 у.е. и 86,64±8,34 у.е. соответственно, а в индуцированном была чуть выше чем в контрольной группе - средний показатель составил 253,72±21,29 у.е. против и 227,61±36;30 у.е. в контроле. Индекс стимуляции, характеризующий способность нейтрофилов адекватно отвечать на патологический процесс на 13,08% превышал показатель контрольной группы и составил 2,16±0,09 у.е. против 1,91±0,07 у.е. Данные представлены в табл.. 17.
Нормальное состояние кислородзависимых микробицидных систем нейтрофилов подтверждалась и высокой миелопероксидазной (МПО) активностью, которая в 1-й группе не отличалась от показателя в группе здоровых лиц (203,47±19,53 у.е. и 198,46±11,04 у.е. соответственно). Данные представлены в таблице 18.
Однако уничтожение микроорганизмов фагоцитами осуществляется не только кислородзависимыми, но и кислороднезависимыми механизмами. Нейтрофплы содержат множество биологически активных веществ ферментной и неферментной природы, которые содержатся в гранулах и опосредуют развитие воспаления. К таковым относятся исследуемые нами катионные белки (КБ), кислая фосфатаза (КФ), а таюке суммарный индекс люминесценции лизосом (СИЛ).
КБ и КФ - локализуются в лизосомах нейтрофилов и участвуют в процессах кислороднезависимой бактерицидносте (36, 171, 214). СИЛ отражает состояние лизосомного аппарата мононуклеарных фагоцитов. Именно лизосомы обеспечивают клеточное пищеварение в моноцитах и тем самым защиту от чужеродных агентов. Таким образом, именно эти два параметра наиболее точно отражают состояние кислороднезависимых систем фагоцитов, и позволяетсудить об их функциональной активности.
Проведенное цитохимическое исследование выявило незначительное повышение СИЛ, значение которого было чуть выше, чем в контрольной группе (1,06 раз) но достоверной разницы не выявлено. Среднее значение по группам составило 331,72±24,09% и 313,69±16,25% соответственно.
