Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Современные представления о бактериальном вагинозе 10
1.2. Методы диагностики бактериального вагиноза 24
1.3. Клиническое течение и факторы риска развития бактериального вагиноза 36
1.4. Лечение бактериального вагиноза 38
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2. Методы и материалы
2.1. Общая характеристика обследованных пациенток 46
2.2. Лабораторные методы обследования 48
2.3. Метод исследования бактериальной микрофлоры вагинального содержимого с помощью ДНК-чипа 51
2.4. Использованные схемы лечения пациенток с бактериальным вагинозом 55
2.5. Методы статистической обработки 56
ГЛАВА 3. Клинико-лабораторная характеристика пациенток с жалобами на выделения из влагалища
3.1. Общая характеристика данных анамнеза обследованных групп 58
3.2. Результаты клинико-лабораторного обследования рассматриваемых групп пациенток 65
3.3. Результаты клинико-лабораторного обследования пациенток с бактериальным вагинозом в зависимости от длительности течения заболевания 67
ГЛАВА 4. Анализ микрофлоры влагалища у пациенток с патологическими выделениями
4.1. Исследование микрофлоры влагалища с использованием культуральных методов исследования 70
4.2. Исследование микрофлоры влагалища с использованием ДНК-чипов у пациенток с патологическими выделениями 72
4.3. Сравнительная характеристика выявленного спектра микроорганизмов с использованием ДНК-чипов и с помощью культурального метода исследования 82
ГЛАВА 5. Роль A. vaginae в развитии бактериального вагиноза
5.1. Ассоциация A. vaginae с бактериальным вагинозом и другими микроорганизмами, выявляемыми при БВ (G. vaginalis, Mobiluncus spp, U. urealyticum, М. hominis) 88
5.2. Лечение бактериального вагиноза, ассоциированного cA.vaginae 94
ГЛАВА 6. Обсуждение полученных результатов
6.1. Клинико-анамнестическая характеристика пациенток 97
6.2. Исследование с помощью ДНК-чипа 101
6.3. Роль A. vaginae при бактериальном вагинозе 105
ВЫВОДЫ 108
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 109
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 111
- Современные представления о бактериальном вагинозе
- Результаты клинико-лабораторного обследования рассматриваемых групп пациенток
- Исследование микрофлоры влагалища с использованием ДНК-чипов у пациенток с патологическими выделениями
Введение к работе
Актуальность проблемы
Патологические выделения из влагалища являются одной из ведущих причин обращения женщин к врачу. При обследовании у таких пациенток часто обнаруживают ИППП, в этом случае тактика врача достаточно полно определена в соответствующих инструкциях. Значительно сложнее ситуация обстоит с пациентками, обратившимися с жалобами на выделения из влагалища, при которых отсутствует безусловный патогенный микроорганизм, а также грибы рода Candida. Классическим примером таких состояний и ведущей по частоте причиной патологических выделений из влагалища является нарушение нормального микробного состава вагинального содержимого - бактериальный вагиноз (БВ). БВ обнаруживают по разным данным у 4,9% - 36% пациенток с выделениями, включая 20-25% среди беременных, регистрируется в 17-19% случаев среди обратившихся в клиники планирования семьи. В структуре заболеваний репродуктивной системы БВ встречается в 40-60% случаев [1, 11, 15, 18, 24, 33, 85]. Этиологические факторы, приводящие к развитию БВ, до сих пор до конца не изучены, но бесспорной является полимикробная этиология этого состояния.
Наличие БВ у женщин, особенно в течение длительного времени,
повышает риск развития воспалительных заболеваний органов малого таза,
создает серьезные проблемы после гинекологических оперативных
вмешательств. Кроме того, БВ может явиться причиной осложнений
беременности и родов, способствуя невынашиванию беременности и
преждевременным родам. Описаны случаи, когда БВ приводил к развитию
хориоамнионита, послеродового эндометрита, внутриутробного
инфицирования плода, перитонита. Есть публикации, свидетельствующие о том, что БВ ассоциирован с инфекцией уретрального тракта, цервицитами [1,6, 11, 15, 18, 19,55].
Доказано, что БВ является фактором риска заражения ЖПТП и ВИЧ-инфекцией. Условия низкой рН создают благоприятные условия для колонизации мочеполовой системы патогенными микроорганизмами, а также обострению скрыто протекающей вирусной инфекции урогенитального тракта. Смешанные инфекции или инфекции, развившиеся на фоне выраженного дисбаланса состава микроценоза влагалища, наблюдаются в 20-30% случаев клинически выраженных инфекций влагалища [3, 47, 51, 55, 87, 71, 109].
БВ негативно сказывается на качестве жизни женщин. Показано, что при наличии длительно существующих и обильных выделений из влагалища у пациенток возможно развитие психосоматических нарушений, у 1/3 -снижается работоспособность, нарушается половая и детородная функции, снижается качество жизни [36].
По данным некоторых авторов особенностью БВ является его склонность к рецидивированию после проведенного лечения, что наблюдают не менее чем в 50% случаев [15, 18].
Классическими методами лабораторного обследования при постановке диагноза БВ являются культуральное исследование материала, взятого из заднего свода влагалища, и микроскопическое исследование мазка. Однако при исследовании с помощью световой микроскопии, невозможно провести видовую идентификацию микроорганизмов, а при культуральном исследовании считается, что можно выделить не более 15%) микроорганизмов из числа тех, что действительно присутствуют во влагалище при наличии выделений [15]. Методы генодиагностики позволяют решить проблему быстрого и качественного обнаружения любой микрофлоры, как аэробной, так и анаэробной микрофлоры, а также микроаэрофилов непосредственно в мазках.
Цель исследования
С использованием методов генодиагностики (стандартная ПЦР и ДНК-чипов) и бактериологических методов исследования изучить спектр
микроорганизмов у пациенток при выделениях из влагалища и на основании полученных данных повысить эффективность проводимой терапии. Задачи исследования
Апробировать систему идентификации бактериальной микрофлоры влагалища путем универсальной амплификации генов 16 S РНК бактериальных геномов с последующей видовой идентификацией возбудителей путем гибридизации с видоспецифическими зондами (олигонуклеотидный ДНК-чип).
Оценить возможность использования ДНК-чипа для относительной оценки количественного соотношения идентифицированных микроорганизмов.
Изучить особенности микробиоценоза влагалища с определением аэробной и анаэробной флоры при БВ, в зависимости от длительности течения.
4. Оценить терапевтическую эффективность интравагинального
применения метронидазола или клиндамицина при патологических
выделениях из влагалища с наличием признаков БВ, в зависимости от
идентифицированных микроорганизмов.
Положения, выносимые на защиту
ДНК-чип - динамическая система, которая может быть использована для исследования микробного спектра вагинального содержимого у пациенток с выделениями из влагалища. Использование ДНК-чипа наиболее оправдано при диагностике состояний, когда ожидается обнаружение широкого спектра микроорганизмов, в том числе трудно культивируемых анаэробных. Метод позволяет провести относительную количественную оценку идентифицированных микроорганизмов в исследуемой пробе.
Идентификация Atopobium vaginae у пациенток с выделениями из влагалища является дополнительным критерием БВ и прогностическим фактором длительного рецидивирующего течения заболевания.
3. Для лечения БВ, ассоциированного с A.vaginae, приоритетным является назначение клиндамицина интравагинально. Научная новизна
1. Впервые в клинической практике апробирована система
идентификации микрофлоры влагалища методом ДНК-чипа.
2. Впервые оценена возможность использования ДНК-чипов при
постановке диагноза бактериальный вагиноз.
Впервые путем динамического анализа вагинальной микрофлоры на олигонуклеотидных ДНК-чипах оценен состав микробиоценоза влагалища при БВ, резистентном к терапии.
Впервые в России оценена роль A. vaginae при патологических выделениях из влагалища. Установлена высокая корреляция A. vaginae с БВ. Впервые обнаружено, что у всех пациенток с A. vaginae, течение БВ носит длительный рецидивирующий характер.
5. Впервые в России доказана более высокая эффективность
интравагинального применения клиндамицина для лечения БВ,
ассоциированного с A. vaginae, и БВ, течение которого носит длительный
рецидивирующий характер.
Практическая значимость
На основании полученных результатов даны рекомендации по спектру микроорганизмов, целесообразных для включения в ДНК-чип при исследовании вагинального содержимого у пациенток с патологическими выделениями из влагалища. Уточнены рекомендации по прогнозу и ведению пациенток с бактериальным вагинозом, течение которого носит упорный рецидивирующий характер. Даны рекомендации по лечению бактериального вагиноза, ассоциированного с Atopobium vaginae.
Внедрение полученных результатов практику
Основанные на результатах диссертации рекомендации по лечению используются в клинической работе: ГУЗ НО «Кожно-венерологический
диспансер Сормовского района г. Нижний Новгород» и ГКБ № 14 им В.Г.Короленко г. Москвы.
Апробация работы
Основные положения работы доложены на II Всероссийском конгрессе дерматовенерологов, г. Санкт-Петербург, 24-27 сентября 2007 г и на школе урогинекологов, 11-12 сентября 2007 г. Одинцово.
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано 10 печатных работ, из них 8 в соавторстве.
Структура и объем диссертации
Работа выполнена на 122 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований (включая обсуждение полученных результатов), выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Список литературы включает 115 зарубежных и российских авторов. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 8 рисунками.
Современные представления о бактериальном вагинозе
Уже более 100 лет продолжается поиск путей решения проблем диагностики и лечения бактериального вагиноза (БВ). Впервые это состояние было выделено в отдельную нозологию еще в 1892 г. Тогда Додерлейн впервые выделил и описал Lactobacillus как представителя нормальной микрофлоры влагалища. Он выдвинул тезис, что нормальная микрофлора влагалища гомогенна и состоит из грамположительных бактерий. Гетерогенная флора им рассматривалась как признак нездоровья и для такого состояния, когда появляются патологические выделения из влагалища, и они не связаны с такими патогенами как N. gonorrhea, Т. vaginalis или Candida, был предложен термин «неспецифический вагинит» [57].
В 1955 г. Gardner и Dukes описали микроорганизм, являющийся причиной развития неспецифического вагинита - Haemophilus vaginalis. В 1963 г, учитывая обнаруженные свойства, отличающие этот микроорганизм от вида Haemophilus, микроорганизм был переименован в Corynebacterium vaginalis. В 1980 г в честь ученого Herman a Gardner а, подробно описавшего строение и свойства этого микроорганизма, микроб получил название Gardnerella vaginalis, и был выделен в отдельный род. Таким образом, состояние не могло называться неспецифическим процессом и по мере получения новых данных называлось: вагинит, вызванный Haemophilus, вагинит, вызванный Corynebacterium и гарднереллез [66, 69, 115].
Позже, когда появились новые более чувствительные методы диагностики, ученые пришли к выводу, что G. vaginalis может быть выявлена у более чем 50% женщин без признаков патологии, к тому же описываемое состояние может быть ассоциировано и с другими микроорганизмами, в основном анаэробами. В 1982 г. Blackwell с соавторами ввел термин «анаэробный вагиноз», который был предопределен видовыми свойствами флоры и отсутствием воспалительной реакции при этом состоянии. А в 1983 г. появился термин «неспецифический вагиноз». В 1984 г. на 1-ой Международной конференции по вагинитам в Швеции был предложен современный термин «бактериальный вагиноз». В настоящее время под этим термином понимают - инфекционный невоспалительный синдром полимикробной этиологии, обусловленный дисбактериозом вагинального биотопа, который характеризуется резким увеличением количества облигатно- и факультативно-анаэробных условно-патогенных микроорганизмов и снижением количества или полным отсутствием лактобактерий, преимущественно перикисьпродуцирующих [4]. Бактериальный вагиноз не вошел в МКБ - X пересмотра как отдельная нозология. Это состояние может быть включено в группу «Бели неуточненные, как инфекционные» (N89.5) или «Другие виды воспаления влагалища и вульвы» (N76). Тем не менее, жалобы на патологические выделения из влагалища входят в число наиболее частых жалоб, с которыми пациентки обращаются к врачам. Европейское руководство по заболеваниям, передаваемым половым путем, выделяет состояния, сопровождающиеся патологическими выделениями из влагалища в одну группу, и в этом разделе рассматривает: бактериальный вагиноз наряду с урогенитальным кандидозом и урогенитальным трихомониазом, состояниями с известными этиологическими агентами [11].
Микрофлора влагалища здоровых женщин репродуктивного возраста характеризуется многообразием, динамичностью и включает в себя широкий спектр бактерий: грамположительные и грамотрицательные, аэробные, факультативно-анаэробные, облигатно-анаэробные, микроаэрофилы и анаэробные микроорганизмы. Жизнедеятельность микроорганизмов зависит от их адгезивной способности к эпителиальным клеткам влагалища, конкуренции за места обитания и продукты питания между представителями микробиоценоза, синергизма, паразитизма. Состав микрофлоры регулируется эндокринной, нервной, иммунной системами, а таюке на него оказывают влияние факторы окружающей среды. [15, 35, 81]. Состав микрофлоры влагалища в значительной степени эстрогензависим, особенности нормоценоза различаются в зависимости от возраста. Общее количественное содержание микроорганизмов составляет 10-10 КОЕ/мл, спектр вагинальной флоры широкий и в него входят следующие микроорганизмы. Микроаэрофильные микроорганизмы: Lactobacillus spp., G. vaginalis; облигатно-анаэробные грамположительные бактерии: Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp., Clostridium spp., Propionibacterium spp., Mobiluncus spp., Peptostreptococcus spp.; облигатно анаэробные грамотрицательные бактерии: Bacteroides spp., Prevotella spp., Porphyromonas spp., Fusobacterium spp., Veilonella spp.; факультативно анаэробные грамположительные бактерии: Cory neb acterium spp., Staphylococcus spp. (S. epidermidis, S. saprophyticus), Streptococcus spp (S. viridans, E. fecalis, E. faecium, S. agalactiae), Enterobacteriaceae (E. coll, Enterobacter spp., Klebsiella spp., Proteus spp.j, M. hominis, U. urealyticum, M. fermentans, дрожжеподобные грибы рода Candida. Условно-патогенные микроорганизмы присутствуют в определенном количестве, а при их чрезмерном росте (выше 10 КОЕ/мл) могут вызывать различные патологические состояния, сопровождающиеся патологическими выделениями из влагалища (см. таблицу №1) [19,76, 82].
Результаты клинико-лабораторного обследования рассматриваемых групп пациенток
Жалобы на выделения из влагалища на момент обследования либо на периодически возникающие выделения предъявляли все пациентки с БВ -группа I (п=80). Жалобы на зуд или жжение предъявляли 19 (23,7%) пациенток этой группы. При клиническом обследовании среди признаков патогмоничных для БВ гомогенные выделения в заднем своде влагалища были выявлены в 68 (85%) случаях, рН выше нормальных для вагинального содержимого показателей (выше 4,5) в 62 (77,5%) случаев и положительный аминный тест в 51 (63,8%).
При осмотре патология шейки матки выявлялась в 33 случаях (41,3%). При микроскопии мазка окрашенного по Граму «ключевые клетки» были обнаружены в 64 (80%) случаях.
В группе пациенток с жалобами на патологические выделения без признаков БВ (группа II, п=20). Жалобы на патологические выделения предъявляли все пациентки. Жалобы на зуд или жжение на момент обращения две пациентки. В этой подгруппе также отмечались жалобы на различные дизурические явления (неприятные ощущения при мочеиспускании, учащенные мочеиспускания).
Гомогенные выделения в заднем своде влагалища наблюдались в 10 (50%) случаев, рН выше нормальных для вагинального содержимого показателей в 10 (50%) случаев, положительный аминный тест был отмечен в трех случаях.
При осмотре патология шейки матки выявлялась в 6 (30%) случаях. «Ключевые клетки» при микроскопии мазка окрашенного по Граму не обнаруживались.
В контрольной группе (группа III, п=20) жалоб пациентки на момент обращения не предъявляли. Гомогенные выделения в заднем своде влагалища при осмотре были обнаружены в одном случае. Положительный аминный тест ни в одном случае отмечен не был. Показатель рН вагинального содержимого в цифрах выше нормы была обнаружен в 5 (20%) случаях.
При осмотре патология шейки матки выявлялась в 6 (30%) случаях. «Ключевые клетки» при микроскопии мазка окрашенного по Граму не обнаруживались. Из таблицы № 12 видно, что клиническое обследование пациенток позволяет обнаружить признаки, в большей степени характерные для пациенток с БВ, но эти признаки не являются строго патогомоничными для этого заболевания.
Исследование микрофлоры влагалища с использованием ДНК-чипов у пациенток с патологическими выделениями
С использованием ДНК-чипа и стандартной ГЩР был исследован материал, полученный от 45 пациенток с жалобами на патологические выделения из влагалища. В качестве контрольной группы обследовано 8 здоровых женщин, жалоб на момент обращения не предъявлявших. У всех обследованных материал для исследования брали из заднего свода влагалища.
Состав зондов в чипе корректировали по ходу исследования. Так, на первом этапе работы наличие A. vaginae в исследуемых образцах анализировали с помощью метода стандартной ПЦР, поскольку этот микроорганизм не был включен в спектр 41 других, выявляемых с помощью ДНК-чипа. Ввиду высокого процента выявления A. vaginae уже в ходе проводимого исследования в ДНК-чип был добавлен 42-ой зонд, соответствующий A. vaginae. Диагностика с помощью стандартной ПЦР и с помощью ДНК-чипа осуществляется с помощью одного и того же принципа -амплификации нуклеиновых кислот. Поэтому мы посчитали возможным суммировать результаты выявления A. vaginae с помощью стандартной ПЦР и с использованием ДНК-чипов при последующем анализе полученных данных.
В материале, полученном от пациенток с жалобами на выделения из влагалища (п=45) с помощью ДНК-чипа нам удалось идентифицировать 29 различных микроорганизмов из 42 возможных, включая трудно-культивируемые анаэробные бактерии. Спектр выявляемой микрофлоры составили как условно-патогенные микроорганизмы, так и микроорганизмы, входящие в нормальный состав микробиоценоза влагалища. В ДНК-чип, который использовали в данном исследовании, наряду с условно-патогенными микроорганизмами было включено три патогенных: N. gonorrhoeae, С. trachomatis, М. genitalium. Следует отметить, что целью данного исследования было изучить спектр только условно-патогенных микроорганизмов при патологических выделениях из влагалища, несвязанных со строгим патогеном как этиологическим агентом. Поэтому обнаружение патогенных микроорганизмов, на этапе формирования основной группы при стандартном лабораторном обследовании, являлось критерием исключения из исследования. Патогенные микроорганизмы при анализе микробного состава с помощью ДНК-чипа не выявлялись. Также не обнаруживались, включенные в ДНК-чип условно-патогенные и непатогенные микроорганизмы: Actinobacillus spp и некоторые представители Lactobacillus spp и Bacteroides spp.
Среди 29 выявленных с помощью чипов микроорганизмов обнаруживали различные группы бактерий. Микроаэрофильные бактерии -G. vaginalis в 30 (66,7%) случаях. Облигатно-анаэробные грамположительные и грамотрицательные бактерии: Bacteroides spp в 37 (82,2%) случаях , А. vaginae в 34 (75,5%) случаях, Lactobacillus spp в 25 (55,5%) случаях, Clostridium spp в 9 (20%) случаях, Prevotella spp в 9 (20%) случаях, Porphyromonas spp в 8 (17,8%) случаях, Fusobacterium spp в 7 (15,5%) случаях, Peptostreptococcus spp в 5 (11,1%) случаях, Mobiluncus spp в 4 (8,8%) случаях, Veilonella spp в 3 (б,6% ) случаях. Факультативно-анаэробные грампложительные бактерии (M.hominis, U.urealyticum в 15 (33,3%) случаев, Streptococcus spp в 3 (6,7 %) случаев, Staphylococcus spp в 1 (2,2%) случае) (см. Таблицу №15). Идентифицированный спектр во многом предопределен составом исследуемой группы, в которой из 45 пациенток у 39 (86,7%) был установлен диагноз БВ (согласно критериям Амсела), а у 6 (13,3%) пациенток, у которых признаков БВ обнаружено не было, в качестве единственной причины патологических выделений из влагалища были выявлены генитальные микоплазмы (U. urealyticum и/ или М. hominis) при культуральном исследовании.
При обследовании группы контроля (п=8) с использованием ДНК-чипа было выявлено всего 5 различных микроорганизмов, среди которых чаще всего (в 5 случаях) обнаруживали представителя нормальной микрофлоры влагалища Lactobacillus fermentus.
