Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОСТОЯНИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ ПРИ ИНФЕКЦИОННЫХ И НЕИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 11
1.1. Цитохимическая характеристика основных микробицидных компонентов нейтрофилов 11
1.2. НСТ-тест - показатель фагоцитарной и функционально-метаболической
функции нейтрофилов 24
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 27
2.1. Клинико-лабораторная характеристика больных диффузными болезнями соединительной ткани 27
2.2. Цитохимические и иммунологические методы исследования микробицидных компонентов нейтрофильных лейкоцитов 38
2.3. Количественное изучение цитохимических показателей 45
2.4. Математическая обработка и анализ полученных данных 47
ГЛАВА 3. ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ У ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ 48
3.1. Миелопероксидаза 49
3.2. Катионный белок 50
3.3. Липиды 50
3.4. Кислая фосфатаза 51
3.5. Гликоген 52
3.6. Показатели спонтанного НСТ - теста у здоровых людей 53
ГЛАВА 4. СОДЕРЖАНИЕ КОМПОНЕНТОВ МИКРОБИЦИДНОИ СИСТЕМЫ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ ДИФФУЗНЫМИ БОЛЕЗНЯМИ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ 55
4.1. Миелопероксидаза 55
4.2. Катионный белок 75
4.3. Липиды 87
4.4. Кислая фосфатаза 97
4.5. Гликоген 107
ГЛАВА 5. СОСТОЯНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ ФУНКЦИИ НЕИТРОФИЛОВ ПРИ ДИФФУЗНЫХ БОЛЕЗНЯХ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ 118
5.1. Спонтанный НСТ-тест 118
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 129
ВЫВОДЫ 140
ЛИТЕРАТУРА 143
- Цитохимическая характеристика основных микробицидных компонентов нейтрофилов
- Кислая фосфатаза
- Кислая фосфатаза
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основоположниками учения о кол-лагенозах - болезнях соединительной ткани, объединенных сходными клинико-морфологическими изменениями явились в 1941 г. P. Klemperer, A. Pollack и G. Bathr [89]. Из заболеваний этой группы наибольшее значение для дерматологов имеют красная волчанка, склеродермия, дерматомиозит.
Повсеместно отмечается рост заболеваемости красной волчанкой, особенно ее системной формой [89]. Заболеваемость красной волчанкой по данным различных авторов составляет от 4 до 250 новых случаев на 100 тыс. населения в год [85, 179]. Красная волчанка встречается во всех климато-географических зонах. Отмечаются возрастные и расовые различия в частоте заболевания. Более 70% больных с системной красной волчанкой заболевают в возрасте 14-40 лет, а «пик» заболеваемости приходится на 14-25 лет [179]. Соотношение мужчин и женщин, заболевших системной красной волчанкой, составляет от 1:8 [179] до 1:10-15 [85]. Однако среди детей соотношение мальчиков и девочек составляет 1:3 [179]. Склеродермия - второе по частоте, вслед за красной волчанкой, заболевание из группы диффузных болезней соединительной ткани. Ее распространенность составляет 32-45 случаев на 100 тыс. населения [89].
Этиология и патогенез красной волчанки и склеродермии остаются не выясненными. Однако, одной из основных гипотез в патогенезе склеродермии является роль иммунных нарушений, а системная красная волчанка согласно исследованиям В.А. Насоновой, А.И. Сперанского и N. Sonnichsen признана классическим примером аутоиммунной болезни, характеризующейся широким спектром нарушений иммунного гомеостаза [89]. Р!В. Петров считает эталоном неорганоспецифических аутоиммунных болезней не только системную, но и дискоидную красную волчанку, склеродермию, дерматомиозит [89].
Несмотря на многочисленные исследования в области изучения патогенеза диффузных болезней соединительной ткани, многие вопросы остаются не решенными. В связи с этим значительный интерес представляет изучение иммун-
ного статуса, включающего в себя оценку клеточных факторов неспецифической защиты организма. Одним из показателей неспецифической резистентности организма является функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов, ответственных за процесс фагоцитоза в очаге воспаления и опосредованное участие в В-клеточном иммунитете [112, 133, 168, 174, 297]. Состояние микробицидной активности нейтрофилов оценивается по содержанию-и активности в цитоплазме азурофильных и специфических гранул (миелопе-роксидазы, катионных белков, кислой и щелочной фосфатазы, липидов, гликогена и др.). Комплексному исследованию интралейкоцитарных компонентов нейтрофилов при диффузных болезнях соединительной ткани не уделялось достаточного внимания. Поэтому, изучение активности катионных белков, липидов, гликогена, а также миелопероксидазы, кислой фосфатазы нейтрофильных лейкоцитов, содержания в них и определение показателей спонтанного тетразолиевого теста в динамике течения диффузных болезней соединительной ткани с различными клиническими формами является актуальным в.процессе изучения неспецифической резистентности организма при этой группе заболеваний.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Провести клинико-цитохимическую оценку неспецифической резистентности организма при диффузных болезнях соединительной ткани с помощью изучения состояния функциональной и метаболической активности лейкоцитов.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.
1. Изучить у больных диффузными болезнями соединительной ткани с помо
щью цитохимических методов исследования функциональную активность лей
коцитов по изменению уровня катионного белка, липидов, гликогена, активно
сти миелопероксидазы и кислой фосфатазы.
2. Установить закономерности изменения интралейкоцитарных компонентов
у больных диффузными болезнями соединительной ткани в. зависимости от
клинической формы, тяжести и распространенности патологического процесса,
а также наличия сопутствующих заболеваний.
Оценить метаболическую и фагоцитарную активность лейкоцитов в динамике у больных диффузными болезнями соединительной ткани путем проведения HGT-теста.
Установить значение функционально-метаболической активности лейкоцитов в патогенетических механизмах диффузных болезней соединительной ткани, а также показать клинико-диагностическую информативность и практическую значимость комплексного определения основных биологически активных интралейкоцитарных компонентов.
Провести сопоставление цитохимических показателей нейтрофильных гранулоцитов (миелопероксидазы, катионного белка, липидов, кислой фосфата-зы, гликогена и НСТ-теста) с данными гемограммы (количеством лейкоцитов, палочкоядерным сдвигом, СОЭ).
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Проведено комплексное динамическое- изучение основных компонентов интралейкоцитарной микробицидной системы нейтро-филов и их функционально-метаболической активности у больных диффузными болезнями соединительной ткани в зависимости от периода, клинической формы, тяжести и распространенности патологического процесса, а также наличия' сопутствующих заболеваний.
Установлено, что у пациентов диффузными болезнями соединительной ткани происходит угнетение ферментативной активности миелопероксидазы, снижение уровня цитоплазматических катионных белков, липидов и повышение активности кислой фосфатазы, содержания гликогена, возрастание показателей спонтанного теста с нитросиним тетразолием.
Установлено, что у больных с ограниченными формами диффузных болезней соединительной ткани в стадии разгара заболевания отмечается умеренное снижение уровня миелопероксидазы, катионного белка, липидов и повышение уровня кислой фосфатазы, спонтанного НСТ-теста, а также гликогена с постепенной нормализацией данных показателей по мере исчезновения клинических проявлений кожного процесса. У пациентов с системной красной волчанкой в стадии разгара заболевания и на начальных этапах лечения зарегистрированы
8 выраженные отклонения показателей функциональной и метаболической активности лейкоцитов. Восстановление показателей функциональной и метаболической активности лейкоцитов у данной категории больных не происходит.
У больных диффузными болезнями соединительной ткани с сопутствующими хроническими заболеваниями выявлены более выраженные и стойкие изменения состояния функциональной и метаболической активности лейкоцитов, проявляющиеся угнетением активности миелопероксидазы, катионного белка, липидов и нарастанием активности кислой фосфатазы, спонтанного НСТ-теста, а также уровня гликогена. Стойкие изменения показателей функциональной и метаболической активности лейкоцитов свидетельствуют о снижении резервных возможностей организма и указывают на неблагоприятный прогноз заболевания.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Определение уровней цитохимических показателей нейтрофильных гранулоцитов у больных диффузными болезнями соединительной ткани может быть использовано для оценки глубины , патологического процесса.
Установлено, что степень выраженности цитохимических показателей нейтрофильных гранулоцитов зависит от клинической формы и стадии диффузных болезней соединительной ткани, наличия сопутствующих заболеваний. Показано, что длительные и стойкие нарушения показателей основных компонентов микробицидной системы и метаболической активности лейкоцитов могут свидетельствовать о развитии затяжных форм заболевания и возникновении ранних рецидивов.
Выявленные закономерности показателей микробицидной системы организма могут быть использованы в качестве дополнительных критериев для диагностики тяжести процесса, эффективности лечения и полноты наступившей ремиссии, а также для прогнозирования развития затяжных форм заболевания и возникновения ранних рецидивов.
ЛИЧНОЕ УЧАСТИЕ АВТОРА В ПОЛУЧЕНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ. Автор осуществил планирование исследования, выполнял весь объем цитохимических
исследований на различных стадиях заболевания. Автором лично сформирована база данных, проведены статистическая обработка и обобщение полученных данных.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЬШОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
Изменения функциональной активности лейкоцитов у больных диффузными болезнями соединительной ткани проявляются угнетением активности мие-лопероксидазы, катионного белка, липидов на фоне повышения активности кислой фосфатазы и уровня гликогена.
У больных диффузными болезнями соединительной ткани происходят изменения метаболической активности нейтрофильных гранулоцитов, что проявляется усилением тетразолиевой активности.
Комплексное определение уровней показателей функциональной и метаболической активности лейкоцитов у больных диффузными болезнями соедини-тельной ткани является эффективным и доступным способом оценки глубины патологического процесса, что позволяет использовать полученные в ходе исследований закономерности в качестве дополнительных критериев для оценки распространенности, формы течения и степени тяжести патологического процесса, эффективности проведенного лечения и полноты наступившей ремиссии, а также для прогнозирования развития затяжных форм заболевания и возникновения ранних рецидивов.
РЕАЛИЗАЦИЯ И ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ. Работа выполнена в соответствии с комплексным планом НИР ГОУ ВПО «Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х.М. Бербекова» Федерального агентства по образованию по программе «Фундаментальные исследования. Университеты России», раздел II «Медицина» по проблеме «Состояние функционально-метаболической активности лейкоцитов и среднемолекулярных пептидов сыворотки крови в норме и при инфекционных заболеваниях различной этиологии» (зарегистрирована в ВНТИ-центре, государственная регистрация за № 01.990.004250). Результаты диссертационной работы доложены на многих научно-практических конференциях и опубликованы в печати. Мате-
10 риалы диссертационной работы, внедрены в практику работы ГУЗ Кожно-
венерологический диспансер МЗ КБР и используются в учебном процессе на кафедрах и курсах дерматовенерологии, ревматологии, инфекционных болезней, микробиологии и иммунологии Кабардино-Балкарского госуниверситета при изучении тем «Красная волчанка», «Склеродермия», «Инфекция, инфекционный процесс», «Неспецифическая реактивность и иммунитет».
АПРОБАЦИЯ И ПУБЛИКАЦИЯ^ МАТЕРИАЛОВ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основные положения диссертационной работы обсуждены на ежегодных итоговых конференциях сотрудников медицинского факультета Кабардино-Балкарского госуниверситета (г. Нальчик, 2003-2007), на научно-практических конференциях Республиканского филиала Всероссийского научно-медицинского общества дерматовенерологов (г. Нальчик, 2003-2007), на IX Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, 2005), на научной конференции «Достижения медицинской науки - практическому здравоохранению» (г. Нальчик, 2005), на IX Всероссийской конференции дерматовенерологов (г. Екатеринбург, 2006), на Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Перспектива-2006», «Перспектива-2007» (г. Нальчик, 2006, 2007).
По материалам диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, в том числе 1 работа в реферируемом ВАК журнале «Клиническая лабораторная диагностика».
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационный материал изложен на 172 страницах текста компьютерного набора, содержит введение, 5 глав, заключение, выводы, практические рекомендации и указатель литературы, включающий 247 отечественных и 89 зарубежных авторов. Диссертационная работа иллюстрирована 47 таблицами, 32 рисунками и 9 клиническими наблюдениями.
Цитохимическая характеристика основных микробицидных компонентов нейтрофилов
Лейкоциты - первые клеточные элементы внутренней среды, мобилизуемые организмом в защитных целях в их борьбе с чужеродными антигенами. Нейтрофильные лейкоциты наиболее реактивны и способны быстро-перестраи-вать метаболизм клетки в ответ на широкий спектр стимулирующих воздействий [22, 171, 235, 294]. Основной функцией нейтрофильных лейкоцитов является фагоцитоз, в первую очередь возбудителей инфекционных заболеваний, во вторую - разрушенных и видоизмененных клеток и других компонентов тканей.
Нейтрофильные лейкоциты являются важными участниками иммунологических реакций как клеточного, так и гуморального типа [23, 66]. Нейтрофилы участвуют в регуляции функций других клеток. Эти клетки первыми вступают в контакт с бактериальными агентами, являясь авангардом в борьбе макроорганизма с микроорганизмом [112, 113, 133, 168, 173, 256, 257, 295, 296, 297, 324].
Нейтрофильные лейкоциты составляют большую часть (43-60%) всех яд-росодержащих клеток периферической крови [193]. Зрелый нейтрофил характеризуется умеренно компактным ядром палочковидной или полисегментиро-ванной формы. При последней форме ядра обычно имеется 2-4 сегмента, соединенных перемычками ядерного вещества. Цитоплазма, окрашиваемая в розовый цвет, наполнена пылевидной зернистостью, слабо воспринимающей азур и эозин [8, 193].
Функциональное значение нейтрофильных лейкоцитов определяется несколькими аспектами. Во-первых, это клетки с выраженной способностью к фагоцитозу. При этом «предпочтение» отдается микроорганизмам, хотя и другие субстраты, такие, как продукты распада тканей, могут являться объектом фагоцитоза. Однако фагоцитоз является далеко не единственной формой реализации нейтрофилом своих защитных свойств. Кроме того, он есть завершающий этап деятельности нейтрофила по поддержанию антигенного гомеостаза.
Фагоцитоз является фундаментальным механизмом противоинфекционной защиты организма. В 1892-1908 гг.. И.И. Мечников описал этот процесс и выделил основные его этапы. В дальнейшем В.Е. Пигаревским [168], В.А. Алма-зовым и соавт. [8], М.В. Войно-Ясенецким [38], А.Д. Адо, А.Н. Маянским [6] и А.Н. Маянским, Д.Н. Маянским [112], В.И. Покровским и Б.С. Нагоевым [173], Б.С. Нагоевым [133], М. Baggiolini [256, 257], S.S. Douglas, P.G. Quie [274], R. Robertes, J.I. Jallin [313], B.M. Babior [252], J.E. Smolen, G. Weissman [321], R.A. Thompson et ai. [330], S J. Klebanoff [295, 296], V.F. Breedveld et al. [266] изучены детали фагоцитоза.
Процесс фагоцитоза делится на четыре стадии: приближение лейкоцитов к фагоцитируемому объекту, контакт и прилипание частиц к поверхности лейкоцитов, поглощение частиц и их переваривание.
Фагоцитоз - активный биологический процесс, протекающий с повышенным потреблением кислорода и глюкозы (за счет мобилизации внутриклеточного гликогена) и сопровождающийся усиленным синтезом фосфолипидов. Система кислородозависимой бактерицидности резко активизируется при стимуляции клеток. Для стимулированного нейтрофила характерно увеличение дыхания и активности гексозомонофосфатного шунта. При активации мембранных оксидаз объектом фагоцитоза катализируется перенос электронов с NADF Нг на молекулярный кислород и запускается гексозомонофосфатный шунт. Образующийся при этом супероксидный анион-радикал 02 ведет к образованию перекисей. Одновременно выделяется синглетный кислород О, и гид-роксильный радикал - ОН. Образование всех этих биооксидантов происходит стремительно, поэтому получило название «респираторный взрыв» [168, 170, 260,331]. Поглощение частиц и их переваривание нейтрофилы осуществляют при помощи физиологически активных компонентов лейкоцитов, которые имеются в гранулах этих клеток. Впервые клеточные органеллы, содержащие гидролитические ферменты, открыл De Duve [272] и назвал их лизосомами. Выделяют 2 основных вида гранул: первичные - азурофильные и вторичные - специфические. Азурофильные гранулы появляются раньше специфических и содержат гидролитические ферменты, нейтрофильные протеины, миелопероксидазу, лизоцим, неферментный катионный белок и т. д. Специфические гранулы содержат коллагеназу, лизоцим, белок, лактоферин и т. д. Кроме того, существуют данные еще об одном виде гранул - С-гранулах, которые представляют собой малые везикулоподобные секреторные органеллы, продуцирующие желатино-зу, катепсины и кислые гидролазы [112, 133, 235, 272, 315]. В зрелом нейтро-филе первичные азурофильные грануляции, специфические вторичные гранулы - составляют около 67%. Нарушения в формировании первичных и вторичных гранул подтверждаются количественными изменениями их цитохимических маркеров. В сопоставлении с клиническими проявлениями болезни эти изменения имеют определенное прогностическое значение для суждения о полноценности выздоровления при различных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы.
Кислая фосфатаза
Изучение активности МП нейтрофильных лейкоцитов проведено у 118 больных с различными клиническими формами ДБСТ. Из них 32 больных с БС, 36 больных с ДКВ, 50 больных с СКВ.
Изучение активности МП нейтрофилов выявило достоверное снижение активности фермента у больных ДБСТ (табл. 10, рис. 3). Как видно из представленных данных, максимальное угнетение активности МП отмечено у больных ДБСТ в целом по группе в стадии разгара заболевания (см. рис. 3), когда патологические изменения со стороны кожи и внутренних органов носят островоспалительный характер. На фоне начатого лечения наблюдается незначительное нарастание активности МП (см. рис. 3). Дальнейшие изучения в динамике показали повышение активности МП в конце стационарного лечения, однако, количественное содержание данного фермента в этом периоде исследования значительно ниже уровня физиологических показателей, что предполагает напряженность регуляторных механизмов в системе эффекторного звена иммунитета у больных ДБСТ в целом по группе. И, как видно из данных, в стадии клинико-лабораторной ремиссии, через 1-1,5 месяца после выписки из стационара уровень миелопероксидазной активности повышается, но не достигает физиологической нормы (см. табл. 10). Примечание: Здесь и в табл. 11, 14, 18, 19-24, 26-46: п - количество больных; Р - достоверность различия к показателям здоровых лиц; Pi - достоверность различия к предыдущему периоду болезни. Здесь и в остальных табл.: I - стадия разгара заболевания, II - стадия стихания островоспалительных явлений, III - стадия регресса клинических проявлений, IV -стадия клинико-лабораторной ремиссии. Уровень активности миелопероксидазы нейтрофилов у больных диффузными болезнями соединительной ткани в целом по группе в зависимости от стадии заболевания Учитывая выявленные изменения содержания МП в нейтрофилах, весьма интересным и важным представлялось определение содержания данного фермента в динамике у больных ДБСТ с различными клиническими формами. Результаты проведенных исследований приведены в табл. 11 и на рис. 4.
Примечание: Здесь и в табл. 22, 28, 33, 38, 43: Рг - достоверность различия по отношению к группе больных с системной красной волчанкой.
Изучение активности МП у больных ДБСТ в зависимости от распространенности и тяжести патологического процесса выявило более значительное снижение активности МП при СКВ, чем у больных с ограниченными формами коллагенозов. При этом, у больных СКВ во II периоде исследования показатели активности МП оказались еще ниже, чем в I периоде с тенденцией к повышению в последующих периодах исследования, но даже в стадии клинико-лабораторной ремиссии уровень изучаемого показателя оставался значительно ниже нормы.
В то же время, у больных с ограниченными формами ДБСТ наблюдается постепенное повышение активности фермента. Однако, в конце стационарного лечения нормализация показателей МП не происходит. Хотя, у 11 больных на данном этапе исследования уровень фермента находился в пределах физиологической нормы. У данных больных отмечена быстрая положительная динамика патологического процесса, что предполагает высокую активность защитно-приспособительных механизмов, организма и позволяет судить о продолжительности периода ремиссии. Достоверное восстановление показателей МП у больных БС и ДКВ происходит в стадии клинико-лабораторной ремиссии. Это иллюстрируют клинические наблюдения №1 и №2 .
Кислая фосфатаза
Цитохимическое изучение активности КФ в нейтрофильных лейкоцитах проведено у 118 больных ДБСТ.
При этом в целом по группе отмечено достоверное, значительное повышение активности КФ, особенно выраженное в стадии активных клинических проявлений. На фоне начатого лечения, показатель фосфатазной активности достоверно снижается, но остается достаточно высоким в сравнении с показателями здоровых лиц. В конце стационарного лечения наблюдается тенденция к снижению уровня КФ с достоверной нормализацией изучаемого фермента в стадии клинико-лабораторной ремиссии (табл. 32, рис. 18).
Учитывая выявленные изменения содержания КФ в нейтрофилах, весьма интересным и важным представлялось определение содержания данного фермента в динамике у больных ДБСТ с различными клиническими формами (табл. 33, рис. 19).
В группах больных с ограниченными формами ДБСТ уровень КФ максимально повышен в стадии разгара заболевания. В ходе лечения, когда происходит стабилизация кожного процесса в группах больных с БС и ДКВ наблюдается постепенное снижение активности данного фермента. В стадии регресса клинических проявлений показатели КФ в данных группах значительно снижаются, но не достигают уровня физиологической нормы. Однако, в этих группах имелись больные, у которых значения активности КФ в данной стадии находились в пределах нормальных физиологических показателей. У данных больных отмечена быстрая положительная динамика патологического процесса, что предполагает высокую активность защитно-приспособительных механизмов организма. В дальнейшем, в стадии ремиссии, через 1-1,5 месяца после выписки из стационара, у больных БС и ДКВ происходит достоверное восстановление уровня КФ до физиологических показателей. Это иллюстрируют клинические наблюдения №1 и №2 (результаты исследований указаны в таблицах 12 и 13).
Клинические наблюдения у больных Г. и Ш. показали, что максимальное повышение уровня КФ отмечено в стадии разгара заболевания. Дальнейшие исследования показали быстрое разрешение патологического процесса, и, вместе с наступлением ремиссии, снижение содержания КФ до нормальных величин.
![Функционально-метаболическая активность лейкоцитов у больных пиодермиями [Электронный ресурс]](/i/i/4240/211147.png "Функционально-метаболическая активность лейкоцитов у больных пиодермиями [Электронный ресурс] Тхазаплижева Марьяна Мухамедовна")
![Маркеры воспаления и оксидантная активность лейкоцитов у больных с различными формами ишемической болезни сердца [Электронный ресурс]](/i/i/4393/188471.png "Маркеры воспаления и оксидантная активность лейкоцитов у больных с различными формами ишемической болезни сердца [Электронный ресурс] Алексеева Галина Васильевна")
