Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1 Общая характеристика митохондриального генома высших растений. 10
1.1.1 Особенности структурной организации генома растительных митохондрий 10
1.1.2 Кодирующие последовательности мт-генома высших растений 15
1.1.3 Перенос нуклеотидных последовательностей между органеллами19
1.2 Плазмидоподобные митохондриальные днк высших растений 25
1.2.1 Исследования репликации ппДНК 27
1.2.2 Функциональная роль ппДНК в растительных митохондриях 30
1.2.3 Происхождение ппДНК 34
1.3 Исследования импорта нуклеиновых кислот в митохондрии 37
1.3.1 Роль импорта нуклеиновых кислот в реализации генетических процессов в митохондриях на примере импорта РНК. 41
1.3.2. Исследование механизмов импорта тРНКу различных организмов 47
1.3.2.1 Участие митохондриального белкового аппарата импорта в транслокации РНК у Saccaromyces cerevisae и млекопитающих. 47
1.3.2.2 Прямой импорт тРНК у трипаносоматид 51
1.3.2.3 Исследования механизма импорта РНК у растений 54
2. Материалы и методы 59
2.1 Выделение растительных митохондрий 59
2.2 Функциональное тестирование изолированных растительных митохондрий 59
2.3 Молекулярно-биологические методы, использованные при анализе днк и клонировании генетических конструкций для импорта 60
2.3.1 Амплификация ДНК в полимеразной цепной реакции (ПНР) 60
2.3.2 Трансформация бактерий методом электропорации 61
2.3.3 Выделение плазмидной ДНК и ее ферментативная обработка 62
2.3.4 Электрофоретический анализ ДНК и элюцияДНК из агарозного геля 62
2.4 Радиоактивно меченые субстраты днк, использованные для импорта в митохондрии 63
2.5 Создание генетических конструкций для импорта днк в митохондрии и транскрипции 64
2.6 Эксперименты по импорту днк в митохондрии 67
2.6.1 Импорт ДНК в изолированные митохондрии в стандартных условиях 67
2.6.2 Получение митопластов 68
2.6.3 Обработка митохондрий окислительными агентами 68
2.6.4 Обработка митохондрий трипсином 68
2.6.5 Обработка митохондрий антителами 69
2.7 Анализ транскрипции импортированных в митохондрии последовательностей діж методом обратной транскрипции/пцр 69
2.8 Анализ транскрипции и репликации импортированных в митохондрии последовательностей днк методом синтеза рнк и днк inorganello 70
2.9 Получение субмитохондриальных фракций 71
2.10 Электрофорез митохондриальных белков в полиакриламидном геле (пааг) и радиоавтография геля 72
2.11 Southern-western и northern-western блоттинг 73
2.12 Транскрипция in vitro 74
3. Результаты и их обсуждение 75
3.1 Транслокация днк в растительные митохондрии. 75
3.1.1 Определение условий импорта ДНК в растительные митохондрии 75
3.1.2 Импорт ДНК происходит через интактные внешнюю и внутреннюю митохондриальные мембраны 79
3.2 Определение специфичности импортируемой в растительные митохондрии днк 82
3.3 Транскрипция и репликация импортируемой в митохондрии днк 84
3.3.1 Клонирование векторов для анализа экспрессии импортированной в растительные митохондрии экзогенной ДНК 86
3.3.2 Анализ транскрипции импортированной в митохондрии экзогенной ДНК методами ОТ-ПЦР и Southern-блот гибридизации 88
3.3.3 Анализ репликации импортированной в растительные митохондрии экзогенной ДНК методом Southern-блот гибридизации 93
3.4 Исследование механизма импорта днк в растительные митохондрии 94
ЗАЛ Активность процесса транслокации ДНК 94
3.4.2 Исследование участия в процессе импорта ДНК митохондриальных белков методами Southern-Western-блот гибридизации и «ковалентных сшивок» 97
3.4.3 Импорт ДНК в митохондрии и явление митохондриальной мегапроницаемости 102
3.4.4 Исследование участия в процессе транслокации ДНК митохондриалъного порина. 107
Заключение 115
Выводы 119
- Плазмидоподобные митохондриальные днк высших растений
- Исследования импорта нуклеиновых кислот в митохондрии
- Функциональное тестирование изолированных растительных митохондрий
- Определение специфичности импортируемой в растительные митохондрии днк
Введение к работе
Систематические исследования митохондриальных нуклеотидных последовательностей дают основания предполагать, что предки зеленых растений обладали компактным митохондриальным геномом (Turmel et al., 2002). Несмотря на это, для высших растений, в особенности покрытосеменных, по сравнению с геномами органелл животных и грибов (имеющих размер, в среднем, 16-100 тпн) характерен митохондриальный геном поразительно больших размеров (в среднем 300-800 тпн). Исходя из данных о нуклеотидных последовательностях митохондриального генома, лишь 11 - 18% мтДНК представляют собой гены, кодирующие белки или структурные РІЖ, более 5% последовательностей имеют хлоропластное, ядерное или вирусное происхождение. При этом наиболее интригующим является то, что для более половины всех митохондриальных последовательностей до сих пор не определены ни их функции, ни их происхождение (Kubo et al., 2000; Marienfeld et al., 1999; Unseld et al., 1997). Хотя все эти процессы имеют эволюционные масштабы, представляется весьма вероятным, что растительные митохондрии обладают выраженной способностью к захвату и интегрированию в геном чужеродных последовательностей. Помимо этого, митохондрии многочисленных растительных видов характеризуются еще одним, отличающим их от митохондрий млекопитающих и многих других эукариотических организмов, свойством. В дополнение к основной высокомолекулярной мтДНК они содержат один или несколько типов экстрахромосомных плазмид, или репликонов, которыми могут быть молекулы ДНК или же РНК, размером от 0,7 и до более чем 20 тпн (Brennicke и Blanz, 1982; Brown и Zhang, 1995; Fukuhara et al., 1995; Kanazawa et al., 1998; Leaver и Gray, 1982; Lonsdale и Grienenberger, 1992, и содержащиеся в них ссылки). В исследованных к настоящему времени растительных видах митохондриальные плазмидоподобные ДНК представлены как видоспецифичный набор
7 кольцевых и линейных молекул ДНК с неопределенными функциями, реплицирующимися независимо от основной геномной мтДНК (Brown и Zhang, 1995; Kanazawa et al., 1998; Leon et al., 1992). Большинство из митохондриальных плазмид не имеют гомологии с основным митохондриальным геномом и, по-видимому, не являются необходимыми для его функционирования. Однако, в зависимости от стадии развития, в митохондриях они могут находиться в высокой стехиометрической степени копийности относительно основного генома: например, для линейных плазмид S1 и S2 из кукурузных митохондрий было показано соответствующее отношение - 5:1. Эти данные, в какой-то степени, совпадают с тем, как соотносятся друг с другом хромосомная ДНК и плазмидные ДНК у бактерий. Линейные митохондриальные ДНК-плазмиды могут нести экспрессирующиеся последовательности, кодирующие белки или тРНК (Leon et al., 1992; Leon et al., 1989). Происхождение мт-плазмид неизвестно. Предполагают, что двухцепочечные плазмиды могли быть внесены в клетки высших растений симбиотическим или патогенным путем. В поддержку этой гипотезы выдвигается аргумент о том, что двухцепочечные линейные плазмиды своим 5'-концом ассоциированы с белком, что напоминает собой структуру некоторых вирусных молекул (Douce и Neuburger, 1989).
Присутствие в растительных митохондриях интегрированных ретротранспозонов, имеющих ядерное происхождение, последовательностей, происходящих от РНК вирусов и РНК плазмид, свидетельствует о том, что, возможно, межорганелльный перенос осуществлялся посредством интермедиатов РНК (Marienfeld et al., 1999; Marienfeld et al., 1997). Такого рода предположения согласуются с данными о существовании в растительных митохондриях специфичного импорта тРНК (Delage et al., 1998; Dietrich et al., 1996; Glover et al., 2001; Marechal-Drouard et al., 1993; Schneider и Marechal-Drouard, 2000), однако, до сих пор не было установлено существования импорта более крупных молекул РІЖ, и, в любом случае,
8 этим механизмом нельзя объяснить все случаи захвата митохондриями генетической информации, а также возникновение в них ДНК-плазмид.
Принимая во внимание появление в ходе эволюции растений специфичных, и, более того, видоспецифичных, наборов митохондриальных ДНК-плазмид, а также возможную их роль в обмене генетической информацией между органеллами, логично предположить существование in vivo контролируемого механизма транспорта ДНК через митохондриальную мембрану. Целью данной работы было исследование возможного механизма импорта ДНК в системе изолированных митохондрий in organelle*.
Для этого необходимо было решить следующие задачи:
1. Исследовать возможность транслокации митохондриальной линейной плазмиды размером 2,3 тпн кукурузы в изолированные митохондрии S. tuberosum. Определить метаболические условия, оптимальные для импорта ДНК, и уровень специфичности импорта различных ДНК-субстратов в митохондрии.
Изучить возможность экспрессии и репликации импортируемого генетического материала в системе in organello с использованием разработанных для этого генетических конструкций с геном GFP.
Исследовать возможные молекулярные механизмы импорта ДІЖ в растительные митохондрии.
В ходе выполнения работы получены следующие основные результаты. Показано, что изолированные растительные митохондрии способны импортировать двухцепочечную линейную ДНК небольшого размера (<10 тпн) посредством активного, не зависящего от последовательности ДНК процесса. Установлено, что импортированная в митохондрии ДНК может транскрибироваться и реплицироваться. Ингибиторный анализ показал, что в процессе импорта ДНК участвуют, по всей видимости, белок внешней мембраны - митохондриальный порин (англ. VD АС - voltage-dependent anion channel), а также белок-переносчик внутренней мембраны адениннуклеотидтранслоказа (англ. ANT - adenine nucleotide translocator), о
9 которых известно, что они являются компонентами митохондриального комплекса, опосредующего мегапроницаемость митохондриальных мембран животного происхождения (Zamzami and Kroemer, 2001). При этом точно установлено, что импорт ДІЖ не связан с самим явлением митохондриальной мегапроницаемости, а происходит, очевидно, через специфический канал, формируемый с участием порина и АНТ.
Установленная система импорта ДНК в изолированные растительные митохондрии может быть использована, в дальнейшем, для изучения фундаментальных генетических процессов в этих органеллах. Полученные данные свидетельствуют также о том, что наблюдаемый у различных организмов перенос генетического материала между органеллами и, возможно, не только в рамках одного вида, может иметь вполне определенный контролируемый механизм. Дальнейшее исследование данного феномена может способствовать углублению знаний об эволюции растений и об участии в этом процессе плазмидоподобных ДНК.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, главы с результатами и их обсуждением, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, включая 3 таблицы и 31 рисунок. Список литературы состоит из 252 ссылок.
Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям: руководителю группы в лаборатории митохондриального биогенеза Института молекулярной биологии растений (ІВМР) Г.Страсбург (Франция), сотруднику CNRS А. Дитришу и зав. лабораторией генетической инженерии растений, СИФИБР СО РАН, д.б.н., ст. научн. сотруднику Ю.М. Константинову за помощь и постоянное внимание к работе, проф. Вайлю Ж-А., за внимание к работе, а также сотрудникам французской лаборатории Косеет А. и Валентайн К. и сотруднику российской лаборатории, к.б.н. Тарасенко В.И. за помощь и участие в проведении экспериментов. Работа была поддержана стипендией, выделенной французским правительством.
Плазмидоподобные митохондриальные днк высших растений
Помимо «основной хромосомы», субгеномных и линейных молекул ДНК в митохондриях многих видов растений также были обнаружены кольцевые или линейные, автономные самореплицирующиеся плазмидоподобные молекулы ДНК или РНК. Эти молекулы имеют небольшие размеры, от 1000 до 11000 пн. В препаратах мтДНК могут присутствовать мультимерные формы этих молекул, возникающие, скорее всего, в результате гомологичной рекомбинации (Hallden et al., 1989). Спектр плазмидоподобных молекул видоспецифичен и может отличаться даже у растений одного вида (Pring и Lonsdale, 1985; Hanson и Conde, 1985). Такие плазмидоподобные ДНК обнаружены в митохондриях кукурузы, риса, сорго, хлопчатника и других растений, причем присутствие их или отсутствие не коррелирует с какими-либо цитоплазматическими особенностями растения. Автономно реплицирующиеся миникольцевые ДНК описаны также и для митохондрий грибов. В отношении миникольцевых ДНК грибов, известно, что, исходя из наличия или отсутствия гомологии с основным мт-геномом, их можно подразделить на две группы. Полагают, что кольцевые молекулы, имеющие гомологию с мтДНК, возникли благодаря вырезанию определенных последовательностей из мт-генома и их последующей амплификации (Smith et al., 1987). Амплификация этой ДНК приводит к подавлению и потере не амплифицированной ДНК и:к митохондриальной дисфункции. Соответствующие фенотипы, известные как petite, ragged, senescent и stopper, идентифицированы в Saccharomyces, Aspergillus, Podospora и Neurospora. Другую группу митохондриальной ппДНК грибов, например, три плазмиды дикого штамма Neurospora, составляют плазмиды, которые не имеют гомологии с мтДНК и не являются супрессивными для мт-генома (Tuzynski, 1982). Большинство плазмидоподобных ДНК растений подобны таковым N. crassa и N. intermedia в том, что практически не имеют гомологии с «основной хромосомой» и не рассматриваются как субгеномные кольца (Brown и Zhang, 1995). К настоящему времени определены нуклеотидные последовательности около 20 мт-плазмид высших растений. 1.2.1 Исследования репликации ппДНК Как уже было отмечено выше, плазмидоподобные ДНК обладают свойствами автономного репликона. В пользу такого предположения свидетельствуют экспериментальные данные о молярных соотношениях хромосомной и плазмидоподобной ДНК. Например, миниколыдевая ДНК размером 1,2 тпн (К1), найденная в митохондриях фертильных растений люпина (Goraczniak и Augustyniak, 1989) превышает в копийности в два и пять раз соответственно другую ппДНК размером 1,4 тпн (К2) и основную мтДНК.
В митохондриях кукурузы из N-типа цитоплазмы S1 и S2 ДНК содержатся в эквимолярном соотношении и в пятикратном избытке к высокомолярной мтДНК. В других линиях кукурузы такое соотношение нарушается как в одну, так и в другую сторону (Levings С. и Sederoff R:, 1985). Зарегистрированы также существенные изменения в относительном содержании митохондриальных плазмид в культуре клеток кукурузы линии Black Mexican Sweet как по стадиям роста культуры, так и по сравнению с зелеными растениями (Smith et al., 1987). Помимо содержащихся в различных цитоплазмах кормовых бобов трех видов мт-плазмид, mtp 1, 2 и 3 (1704, 1695 и 1478 тпн), в некоторых из них встречаются дополнительные плазмиды, различающиеся своей копийностью и идентичностью набора в зависимости от типа ядра. Замещение ядра перекрестным скрещиванием приводит как к появлению, так и к исчезновению этих дополнительных плазмид, что указывает на участие ядерного генома в контроле возникновения или уровня копийности мт-плазмид (Flamand et al., 1993). Репликацию ппДНК в митохондриях некоторых растительных видов анализировали с использованием электронной микроскопии. Репликация mtp 1 и 2 у кормовых бобов (Flamand et al., 1993) начинается со специфического сайта, имеющего шпилькообразную структуру, и происходит в одном направлении, вокруг молекулы. Митохондриальная плазмида mpl (1,3 тпн) из двудольного растения Chenopodium album (L.) (Backert, 2000) имеет сигма-подобную форму: кольцо с двухцепочечным или двухцепочечным с одноцепочечными участками «хвостом» длиной, превышающей в несколько раз длину кольца. Такая структура предполагает образование конкатомеров, подобно тому, как это происходит при репликации бактериофага X. Наличие одноцепочечных участков в месте соединения кольца с «хвостом», а также на конце «хвоста», указывает на способ репликации плазмиды по типу катящегося кольца. При этом нуклеотидные цепи «хвоста» ковалентно связаны с цепями кольца, что является необычным для структуры репликационной вилки и называется «переключением цепи». Предполагается, что подобное переключение происходит при ассоциации коротких гомологичных последовательностей в бактериальных плазмидах и в хромосоме E.coli. Возможно, ппДНК являются менее стабильными по сравнению с высокомолекулярной мтДНК. Об этом свидетельствуют результаты проведенного анализа количества мтДНК в культивируемых при различных температурах каллусах (Kanazawa et al., 1998). При всех исследованных температурах культивирования проводившийся in organello синтез основной мтДНК происходил примерно на одном уровне, в то время как синтез ппДНК - в ограниченных температурных пределах: наиболее интенсивным он был при 35 - 42С, при более низких температурах он постепенно снижался, при более высоких - резко обрывался. Одним из подходов для поиска областей начала репликации ппДНК может служить компьютерный анализ их нуклеотидных последовательностей. Таким путем были обнаружены две области, богатые А+Т основаниями, в нуклеотидных последовательностях кольцевых плазмид кукурузы размером 1,913 (1,9) и 1,445 (1,4) тпн, выделенных из митохондриального генома Black Mexican Sweet линии кукурузы с N цитоплазмой (Ludwig et al., 1985; Smith et al., 1987). Суперспирализованная плазмида 1,9 тпн обнаруживается как в нормальном типе цитоплазмы, так и во всех типах с цмс. Интересно отметить, что плазмида 1,4 тпн присутствует только в цитоплазмах, содержащих плазмиду 1,9 тпн. Между плазмидами 1,9 и 1,4 тпн гомологии не обнаружено, за исключением небольшого участка размером 61 пн, характеризующегося одинаковым количеством А+Т пар, свидетельствующим, возможно, об общем происхождении этих молекул.
В свою очередь повышенное содержание А+Т нуклеотидов характерно для установленных областей начала репликации про- и эукариот (Кузьмин и Зайцева, 1987). Одна из упомянутых А+Т богатых областей кольцевых ппДНК содержит в тройном, у плазмиды 1,9 тпн, или двойном, у плазмиды 1,4 тпн, тандеме нуклеотидную последовательность, которая в дрожжах функционирует как ori репликации, ARS (англ. ARS - autonomously replicating sequence) (Ludwig et al., 1985). В митохондриях кукурузы, сорго, капусты и теосинте обнаружены линейные ДНК. Концевые последовательности этих плазмид также обладают повышенным содержанием А+Т нуклеотидов. Наличие белков, ковалентно связанных с этими нуклеотидными последовательностями, обуславливает их сходство с аденовирусами и некоторыми бактериофагами, например, фагом Bacillus ф29. На этом основании можно предполагать сходство механизмов репликации линейных митохондриальных плазмид высших растений упомянутых эукариот (Tamanoi и Stillman, 1982). Помимо ппДНК в митохондриях кукурузы с S-типом цитоплазмы присутствуют также автономно реплицирующиеся, одно- и двухцепочечные, молекулы РНК, а и Ъ (Zhang и Brown, 1993; Formanova и Brown, 1997). Репликация РНК-плазмид происходит по типу репликации РНК-вирусов. В последовательности РНК b имеются 11 нуклеотидов, гомологичных центральной консервативной области вироидных РНК. Кроме того, РНК b имеет определенное структурное подобие с фагом Q бета и с «варьирующей» РНК, служащей матрицей для репликазы этого фага. 1.2.2 Функциональная роль ппДНК в растительных митохондриях В настоящее время немного определенного можно сказать о функциональной роли ппДНК митохондрий высших растений. Присутствие плазмидоподобных ДНК часто коррелирует с признаком ЦМС у кукурузы и сахарной свеклы (Kemble et.al., 1980; Tomas, 1986). Установлено, что линейные S-плазмиды кукурузы, характерные для мт-генома с S-типом цмс, участвуют в перестройках митохондриального генома при цитоплазматической реверсии к фертильности у кукурузы (Escote et.al., 1985). SI и S2 плазмиды (6397 тпн и 5453 тпн, соответственно), имеют на своих концах инвертированные повторы в 208 пн и терминально расположенную область гомологии размером 1,3 тпн. S плазмиды имеют гомологию с высокомолекулярной мтДНК N-типа, но не гибридизуются с ДНК мт-геномов Т- и С-типов, поскольку мтДНК этих типов характеризуется делециями и перестройками участков генома, содержащих в том числе и последовательности, гомологичные S1 и S2 плазмидам. В мтДНК N-типа эти плазмиды представлены одной копией, каждая из которых фланкирована повтором размером 5,3 тпн
Исследования импорта нуклеиновых кислот в митохондрии
Проблема транспорта нуклеиновых кислот в клеточные органеллы была и остается интересной исследователям с двух точек зрения. Во-первых, поскольку в природе существуют разнообразные процессы, связанные с переносом генетической информации, например, трансформация и трансфекция у бактерий, передвижение вирусов и транспозирующихся элементов, межорганелльный обмен нуклеотидными последовательностями у многих организмов, очевидна необходимость изучения механизмов, по которым происходит транспорт нуклеиновых кислот в этих процессах. С другой стороны, весьма привлекательна идея о создании трансгенных видов путем трансформации клеточных органелл, материнское наследование которых позволило бы контролировать распространение вводимых чужеродных генов. У растений подобная система уже разработана в отношении хлоропластов, при этом для ввода генетических конструкций используется метод баллистической трансформации, а отбор реципиентов проводят по устойчивости трансформированных растений к антибиотикам спектиномицину или стрептомицину, селективное действие которых ограничено биогенезом хлоропластов (Bateman и Purton, 2000). В данном случае, проникновение нуклеиновых кислот в хлоропласты обусловлено либо механическим нарушением интактности мембраны с последующим восстановлением ее структуры, либо импортом их в органеллу с вовлечением каких-то неизвестных транспортных механизмов. Для митохондрий, однако, до сих пор однозначной системы трансформации нет, ввиду их значительно меньших размеров и отсутствия данных, которые можно было бы использовать для создания генетической конструкции, позволяющей проводить отбор митохондриальных трансформантов. Тем не менее, ряд исследований посвящен поиску решений данной проблемы. Введение плазмидной ДНК в митохондрии эукариот in vivo было достигнуто с использованием сферопластов дрожжей (Atchison et al., 1980). Авторы использовали рекомбинантную плазмиду, полученную при слиянии дрожжевого гена устойчивости к олигомицину из petite мутанта и 2 цМ плазмиды этого организма. Гибридной конструкцией трансформировали олигомицин-чувствительный штамм Saccharomyces cerevisiae. Появление устойчивости клеток к антибиотику было в 50 раз выше, чем частота спонтанной мутации.
При изучении структуры митохондриальной ДНК показано, что введенная ДНК не интегрируется в митохондриальный геном реципиентных клеток, а находится в автономном состоянии. Использование 2 цМ кольцевой плазмиды, по сравнению с фрагментами яДНК дрожжей, позволило резко увеличить эффективность трансформации этих клеток. Изменение мтДНК путем трансформации было достигнуто также для фитопатогенного гриба Ustilago violacea (базидиомицет). При инкубации клеток этого гриба с рекомбинантной плазмидой, полученной на основе бактериального вектора pUC18 с дополнительным геном устойчивости к гигромицину (hygB) происходило многократное интегрирование плазмидной последовательности в яДНК. Одновременно, векторные последовательности были обнаружены в свободном и интегрированном виде в митохондриальной фракции U. violacea. Интересно, что плазмида обнаруживалась в органеллах даже после 30 генераций на селективных средах с гигромицином. Авторы считают, что интеграция в миохондриальный геном происходила благодаря наличию в составе рекомбинантной плазмиды фрагмента мтДНК U. violacea, обеспечивающего гомологичную рекомбинацию с геномом органелл (Bej и Perlin, 1991). При получении методом слияния протопластов цибридных растений Brassica napus с новыми комбинациями клеточных органелл, было обнаружено, что содержащаяся в одной из исходных митохондриальных популяций плазмида 11,3 тпн может переноситься в другую популяцию с эффективностью 6,1 % (Kemble et al., 1988). Популяция митохондрий, содержащих новоприобретенную ДІЖ, становились доминирующей в регенерирующих растениях и успешно наследовалась по материнской линии в ряду поколений. При этом не было отмечено каких-либо изменений в организации митохондриальной основной ДНК, указывая на то, что перенос ДНК между митохондриями не связан с рекомбинационными процессами, часто встречающимися у регенерантов растений, полученных слиянием протопластов. Каким образом сильно заряженная молекула ДНК может проходить через двойную митохондриальную мембрану? Перенос чужеродных последовательностей в органеллы клетки может осуществляться, в принципе, как при непосредственном контакте и последующем объединении с внутриорганелльным содержимым, так и с использованием системы специфических переносчиков. Физическое объединение может происходить через частично разрушенные мембраны, которые затем восстанавливаются, после того как часть субклеточного объема, содержащего ДНК, обменивается с внутриорганелльным содержимым. ДНК далее может встраиваться в геном органелл посредством рекомбинационных процессов. Временные связи между различными внутриклеточными компартментами также могут устанавливаться при контакте и последующем локальном плавлении и растворении мембран органелл. Такие объединенные структуры иногда обнаруживаются in vivo. Методом электронной микроскопии было выявлено слияние, по крайней мере, внешних мембран хлоропластов и митохондрий в клетках кукурузы (Zea mays L.) и тропического растения хиптиса душистого {Hyptis suavolens Z,.), что, в принципе, допускает возможность обмена содержимым этих органелл (Montes и Bradleer, 1976). Установлены также случаи поглощения митохондрий хлоропластами, что может приводить к контакту между их геномами и последующей рекомбинации (Brown et al., 1983). Перенос нуклеотидных последовательностей через мембранные системы бактерий часто опосредуется плазмидами и сходными структурами (Гринюс, 1986; Брода, 1982). Если у эукариот существуют подобные механизмы, то они должны быть связаны с экстрахромосомными элементами, которые часто наблюдаются в митохондриях растений в виде кольцевых или линейных плазмид (Schardi et al., 1984). Однако привлечение этого механизма пока является чисто спекулятивным. Единственным примером, вероятно, может служить перенос фактора старения у гриба Neurospora intermedia из ядра в митохондрии, где этот транспозоноподобный элемент размером 9,0 тпн нарушает синтез 25S рРНК, что приводит к старению организма (Bertrand et al., 1985). 1.3.1 Роль импорта нуклеиновых кислот в реализации генетических процессов в митохондриях на примере импорта РНК Известно, что митохондрии состоят из нескольких сотен макромолекул, но только небольшая их часть синтезируется в органелле.
Большинство митохондриальных белков кодируется ядерным геномом, синтезируется в цитоплазме и импортируется затем в митохондрии. Многочисленные исследования показали, что наряду с транспортом белков в митохондрии существует и импорт РНК, причем это явление присуще для митохондрий многих организмов, дрожжей, простейших, растений. Большая часть импорта РНК практически у всех исследованных организмов связана с транспортом тРНК. Митохондриальный геном простейших и растений кодирует неполный набор необходимых для протекающего в органелле белкового синтеза тРНК. Остальные тРНК кодируются в ядерной ДНК, причем существуют тРНК, кодируемые ядерным геномом, которые функционируют как в митохондриях, так и в цитоплазме. Другой класс подобных тРНК (у трипаносоматид) функционируют исключительно в митохондриях (Казакова, 1996). Первые данные о том, что митохондриальные тРНК могут кодироваться ядром были получены для простейшего Tetrahymena pyriformis (Suyama, 1986). С помощью метода двумерного электрофореза в ПААГ было показано, что из 36 митохондриальных тРНК только 10 гибридизовались с мтДНК, остальные, по-видимому, проникали из цитоплазмы, в том числе такие как тРНК 6, TPHKLys, тРНК11е и TPHKVal. Импортируемые тРНК участвовали в трансляции митохондриальных белков. Дальнейшим шагом в понимании закономерностей импорта РНК послужили исследования другого вида Tetrahymena, Т. thermophila. Основываясь на известном факте различия цитоплазматических и митохондриальных кодонов, предположили, что лишь одна из трех тРНК , тРНКС1п (UUG), импортируется в митохондрии, две же другие изоакцепторные тРНКС1п, (CUA) и (UUA), импортироваться не должны, поскольку соответствуют митохондриальным стоп-кодонам (Ziaie и Suyama, 1987).
Функциональное тестирование изолированных растительных митохондрий
Интактность внешней мембраны оценивали, определяя способность изолированных митохондрий восстанавливать добавленный экзогенно ЦИТОХрОМ С, ЧТО СПеКТрофоТОМетрИЧеСКИ фиксируется увеличением As50 (Douce et al., 1972). Тестирование проводилось в электродном буфере [10 мМ фосфата калия, 0.3 М сахарозы, 10 мМ КС1, 5 мМ MgCl2, 0.1 % (в/о) бычьего сывороточного альбумина, рН 7.2], содержащем 80 иМ цитохрома с, 1 мМ KCN, 1 мМ АТР, 10 мМ сукцината и количество очищенных митохондрий, соответствующее 30-50 мкг белка/мл. Для получения контрольной пробы суспензию митохондрий инкубировали в течение 30 с в 5 мМ фосфате калия (рН 7.5): осмотический шок вызывал полное разрушение внешней мембраны. Дыхательный контроль митохондрий (КС - respiratory control) оценивали, измеряя уровень потребления кислорода по отношению его потребления в «активном состоянии» (метаболическое состояние дыхания митохондрий), в присутствии избытка АДФ (200 иМ), и в «пассивном состоянии» (отрегулированное состояние дыхания митохондрий), без АДФ, используя в качестве субстрата дыхания сукцинат (10 мМ), в электродном буфере (Douce, 1985). Митохондрии (30 мкг белка/мл) инкубировали в кислородном электродном устройстве (Hansatech). Набухание органелл анализировали по абсорбции митохондриальной суспензии (30 мкг белка/мл) при 546 нм в течение 30 мин. Контролем служила кинетика абсорбции раствора, содержащего 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5,100 мМ NH4NO3 (Panov et al., 1980). 2.3 Молекулярно-биологические методы, использованные при анализе ДНК и клонировании генетических конструкций для импорта 2.3.1 Амплификация ДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР) Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в соответствии с рекомендациями, указанными в аналитическом паспорте фирмы изготовителя фермента. Реакцию проводили с использованием полимеразы и соответствующего буфера Expand High Fidelity PCR System (Roche), в объеме 25-50 мкл с 200 нМ каждого дНТФ и 1 рМ/мкл праймеров, прямого и обратного. Программа реакции включала в себя 1 цикл с 2 мин денатурацией при 94С, 1 мин отжигом праймеров при 55С, 1 мин полимеризацией при 72С; 30 циклов с 45 сек денатурацией при 93С, 45 сек отжигом при 55С, 1 мин полимеризацией при 72С; и заключительную 10 мин полимеризацию при 72С. 2.3.2 Трансформация бактерий методом электропорации Получение компетентных клеток: В 500 мл среды LB [10 г/л бакто-пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCI] вносили 5 мл ночной культуры E.coli, шт. TG2, и инкубировали бактериальную суспензию при 37С, до достижения ОП6оо 0,5-0,8. Затем культуру охлаждали 30 мин и проводили последовательные центрифугирование, в течение 5 мин, при 4000 об/мин, ресуспендирование в стерильной охлажденной Н20, вначале в том же объеме, 500 мл, затем в 250 мл.
После этого осадок ресуспендировали в 40 мл 10 % глицерола, центрифугировали в течение 15 мин, 4000 об/мин, и снова ресуспендировали в 4 мл 10 % глицерола с последующим разделением суспензии на аликвоты по 40 мкл. Аликвоты замораживали и хранили при -80С. Трансформация . К 40 мкл суспензии компетентных клеток Е.coli, шт. TG2 добавляли 1 мкл (10-20 нг) плазмидной ДНК, после чего суспензию подвергали электропорации, используя напряжение 2,5 В, в приборе Gene Pulser (Bio Rad). После электрошока в бактериальную суспензию добавляли 1 мл среды LB и инкубировали в течение 30 мин, при 37 С. Затем 50-300 мкл суспензии наносили на чашку с селективной средой и инкубировали при 37С до появления колоний. Рекомбинантные колонии отбирали на селективных средах (LBA, содержащая среду LB и 15 г/л агара) по устойчивости к антибиотикам (50 мкг/мл ампициллина, 12 мкг/мл тетрациклина) или по способности разлагать хромогенный субстрат Y-gal (10 мкг/мл) в присутствии индуктора IPTG (0,08 мМ). 2.3.3 Выделение плазмидной ДНК и ее ферментативная обработка Плазмидную ДНК получали из бактериальных клеток Е.соН, используя набор QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN Genomic), согласно прилагаемому протоколу. Рестрикцию ДНК проводили в соответствии с рекомендациями, приводимыми в аналитических паспортах фирм изготовителей рестриктаз. Реакционная смесь содержала 0,2-2 мкг ДНК в объеме 10-20 мкл в соответствующем буфере. В смесь добавляли требуемое количество эндонуклеазы рестрикции (10-20 е.а.) и инкубировали в течение 1-1,5 ч, при 37 С. Дефосфорилирование плазмидной ДНК проводили в объеме 20 мкл с 2 е.а. щелочной фосфатазы в соответствующем буфере, в течение 30 мин при 37С, с последующей двухкратной экстракцией фенолом и очисткой на колонке с Sepharose G-50. Лигирование ДНК проводили в объеме 20 мкл с 4 е.а. лигазы фага Т4, в соответствующем буфере, в течение 16-18 ч при 12-15С. 2.3.4 Электрофоретический анализ ДНК и элюцияДНК из агарозного геля Электрофорез нуклеиновых кислот проводили в горизонтальной камере в 1% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия, с использованием трис-боратного электродного буфера [0,089 М трис, 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА-№2, рН 8,0], либо трис-ацетатного буфера [0,07 М трис-НС1, 0,005 М ацетат натрия, 0,01 М ЭДТА, рН 8,0]. Напряженность электрического поля варьировала от 5 до 15 В/см, продолжительность электрофоретического разделения - от 1 до 3 ч. По окончании электрофореза гель промывали в воде и нуклеиновые кислоты визуализировали в ультрафиолетовом свете, помещая гель в сканирующее устройство «Baby Imager» (Appligene). Элюцию ДНК из агарозного геля проводили либо с использованием набора Nucleospin Extract (QIAGEN Genomic), либо методом фильтрации центрифугированием (10000 х g, 10 мин) через колонку со стекловатой вырезанных фрагментов геля, содержащих ДНК нужного размера, с последующей фенольной экстракцией и осаждением ДНК этанолом. 2.4 Радиоактивно меченые субстраты ДНК, использованные для импорта в митохондрии Основным субстратом ДІЖ, использовавшимся в экспериментах по импорту в митохондрии, была кукурузная (Zea mays) линейная плазмида 2,3 тпн (Leon et al., 1989, GeneBank accession number X13704). Для получения плазмиды, с использованием той же процедуры выделения, что и для картофельных клубней (см. выше) из 10ти-дневных этиолированных проростков кукурузы были изолированы митохондрии и выделена мтДНК.
Экстрагированная из кукурузных митохондрий ДНК служила матрицей в полимеразной цепной реакции (ПЦР), проводившейся с целью амплификации линейной плазмиды 2,3 тпн с использованием праймера MLP5/3BAM, соответствующего 5 части инвертированного повтора, фланкирующего оба конца плазмиды, (Leon et al., 1989), (GZ4C4GGAICCAAAAGTATAGCAACACACAATTAC, где 5 экстрануклеотиды выделены курсивом, сайт для клонирования, ВатШ, подчеркнут). Для того, чтобы получить полноразмерную радиоактивно меченую копию линейной плазмиды, проводили один цикл ПЦР, состоящий из 10 мин элонгации, в реакционной смеси без «холодного» дЦТФ и содержащей, в 50 мкл, 100 uCi [а-32Р]дДТФ (3000 Сі/ммоль), с использованием, в качестве матрицы, 50 нг немеченого продукта ПЦР плазмиды и праймера MLP5/3BAM, с последующим добавлением 0.2 мМ «холодного» дЦТФ и дополнительной элонгации в течение 5 мин. По окончании реакции не включившиеся в синтез [а- Р]УТФ удаляли посредством гель-фильтрации через колонку с Sepharose G-50 (посредством двухкратного центрифугирования в течение 2 мин при 1500 об/мин). Включение радиоактивности оценивали с помощью метода Черенкова. Подобную же процедуру ПЦР проводили для радиоактивного мечения линеаризованной эндонуклеазой рестрикции Apal плазмиды pBluescript KS(+) (Stratagene), с использованием праймера KS (CGAGGTCGACGGTATCG), а также для радиоактивного мечения фрагмента размером 2,1 тпн, соответствующего кодирующей области гена треонил-тРНК-синтетазы из Arabidopsis thaliana (Souciet et al., 1999, GeneBank accession number Y143 29), лишенной последовательностей, служащих сигналами инициации и терминации транскрипции и трансляции. Для предварительной амплификации в качестве матрицы использовали клонированную кДНК гена треонил-тРНК-синтетазы и праймеры: прямой, 5 (THR5NI, GCTCCTTCGTCTTACGGCTC), и обратный, 3 (THR3NT, CAAATTCGGCAGTCTTGGCC).
Определение специфичности импортируемой в растительные митохондрии днк
При замене кукурузной митохондриальной линейной плазмиды 2,3 тпн линеаризованным бактериальным вектором pBluescript (3.0 тпн) или же линейным фрагментом ДНК размером 2,1 тпн, соответствующим кодирующей последовательности кДНК гена треонил-тРНК-синтетазы из мт-генома Arabidopsis thaliana (Souciet et al., 1999), лишенным каких-либо значимых для протекания генетических процессов участков, было показано, что митохондриальный импорт не является специфичным, ни в отношении растительной плазмидной последовательности, ни в отношении какой-либо другой используемой для импорта нуклеотидной последовательности (Рис. 9). Наблюдаемый на радиоавтографе миграционный сдвиг импортированной ДНК по сравнению с контрольной пробой связан с присутствием мтДНК, вызывающим электростатическое воздействие на ДНК плазмиды, что было показано при смешивании меченой пробы ДНК с пробой нуклеиновых 84 кислот, выделенных из препарата митохондрий, инкубировавшихся в эксперименте по импорту без плазмиды. Исследования, проводившиеся с линеаризованной плазмидой pBluescript, содержащей в качестве вставки кукурузную плазмиду 2,3 тпн (размер всей молекулы 5,3 тпн), показали, что эффективность включения ДНК в митохондрии, по всей видимости, снижается с увеличением размера молекулы импортируемого субстрата (Рис. 9). Наконец, когда для импорта использовали радиоактивно меченую кольцевую плазмиду pBluescript, либо кольцевую конструкцию, содержащую в pBluescript кукурузную плазмиду 2,3 тпн, мы наблюдали, что включение радиоактивности в митохондриальную фракцию было очень незначительным (Рис 9). В целом, исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что » транслокация растительными митохондриями ДНК не зависит от нуклеотидной последовательности импортируемой молекулы, но может происходить лишь в отношении двухцепочечных молекул, и более эффективна в отношении линейных фрагментов, ограниченных в размерах несколькими тпн. 3.3 Транскрипция и репликация импортируемой в митохондрии ДНК » » Импорт ДНК в растительные митохондрии был продемонстрирован также при анализе митохондриальной ДНК методом ПЦР с использованием специфичного к последовательности плазмиды 2,3 тпн праймера (MLP5/3BAM) (см. раздел «Материалы и методы»).
Как показано на Рис 10, в результате ПЦР продукт, соответствующий размеру плазмиды 2,3 тпн, образуется лишь в случае использования в качестве матрицы для реакции мтДНК, выделенной из митохондрий, инкубированных с плазмидой, и отсутствует в контрольном варианте, без инкубации. Длительная инкубация митохондрий, при комнатной температуре в среде промывания митохондрий (см. раздел «Материалы и методы»), после импорта в них ДНК, не приводила к деградации генетического материала, ни плазмиды 2,3 тпн, ни фрагмента гена ThrRS (Рис 11). Отсюда следует, что 86 импортируемая ДНК в митохондриях стабильна, и эта стабильность не связана с каким-либо механизмом, специфичным к нуклеотидной последовательности экзогенной молекулы. 3.3.1 Клонирование векторов для анализа экспрессии импортированной в растительные митохондрии экзогенной ДНК Отсутствие существенной специфичности митохондриального импорта ДНК, выявленная стабильность импортированного генетического материала при инкубации позволили нам провести исследования, направленные на ». тестирование возможности экспрессии импортируемого в митохондрии генетического материала, с целью получения данных, связанных с функционированием митохондриальных генетических процессов. Получение такого рода результатов могло бы послужить дополнительным подтверждением существования процесса импорта ДНК в митохондрии, а также имело своей целью выяснение возможности использования данной t экспериментальной системы для молекулярного анализа митохондриальных генетических систем in vitro. Для этой цели были подготовлены две генетические конструкции (подробнее об этом см. в разделе «Материалы и методы»), которые позволяли, амплификацией методом ПЦР, получать кукурузную митохондриальную плазмиду 2,3 тпн, содержащую в своем составе, в качестве не имеющего отношения к растительным митохондриям гена-репортера, ген GFP (GFP - green fluorescent protein) из медузы Aequoria victoria. Ген GFP был встроен в последовательность конструкции вместо гена тРНКРго, присутствующего в диком типе кукурузной плазмиды 2,3 тпн, который, как было показано (Leon et al., 1989), экспрессируется в митохондриях кукурузы с образованием не активного, в результате неполного процессинга, транскрипта тРНК. При определении схемы конструкции мы решили не основываться для экспрессии гена GFP на использовании пока еще не охарактеризованной промоторной области гена тРНКРго, поскольку выбранная нами плазмида, 2,3 тпн, выделена из митохондрий кукурузы, растения, относящегося к классу v однодольных, а в установленной нами системе импорта мы использовали митохондрии двудольного растения картофеля. К тому же, как было подчеркнуто в исследовании, посвященном сравнительной характеристике митохондриальных промоторных областей однодольных и двудольных растений (Fey и Marechal-Drouard, 1999), между ними существуют определенные структурные различия. В результате, была подготовлена конструкция pCK/GFP/PRmt (Рис 12 (2,3PrGFP)), в которой гену GFP предшествует хорошо охарактеризованная промоторная последовательность Рис 12. Схематическая организация кукурузной митохондриальной плазмиды 2,3 тпн и конструкций с GFP, используемых в качестве субстратов для импорта.
Дикий тип плазмиды (2,3 тпн) содержит две копии инвертированного повтора в 170 пн (IR), открытую рамку считывания в 885 пн (ог/1), два гена хлоропластного происхождения тРНКРго (Р) и тРНКТгр (7); в конструкции 2,3PrGFP ген тРНКРг0 замещен геном GFP (gfp) под контролем промотора картофельного митохондриального гена 18S рибосомальной РНК и короткого 5 -фрагмента гена atpl из табака (Рг); в конструкции 2,3AtGFP ген GFP (gfp) находится под контролем участка последовательности, прилегающего 5 к кодону инициации транскрипции митохондриального гена atpl A. thaliana. картофельного митохондриального гена 18S рибосомальной РНК (Giese et al., 1996), а также короткий участок, находящийся непосредственно 5 от начала кодирующей последовательности гена atpl из митохондриального генома другого двудольного растения, табака (Nicotiana tabacum), (Bergman et al., 2000). Эти последовательности были выбраны исходя из того факта, что, как известно, оба гена, 18S рРНК и субъединица АТР1, активно экспрессируются в растительных митохондриях. Другая конструкция, pCK/GFP/Atmt (Рис 12 (2,3AtGFP)) имела те же особенности, с тем исключением, что содержалавместо химерного картофельного митохондриального промотора 18S рРНК соответствующий участок последовательности, прилегающий непосредственно 5 к кодону инициации транскрипции гена atpl из митохондриального генома Arabidopsis thaliana. Вторая конструкция была создана с целью сравнения эффективности двух промоторных участков различных генов из разных видов в процессе генетического анализа импортируемой в растительные митохондрии ДНК. -. Таким образом, амплификацией методом ПЦР, с использованием в качестве матрицы для реакции конструкции pCK/GFP/PRmt или pCK/GFP/Atmt, была получена немеченая плазмида 2,3 тпн, содержащая ген GFP под контролем растительной митохондриальной промоторной последовательности (Рис 12 (2,3PrGFP), (2,3AtGFP)) и использована, далее, в экспериментах по импорту ДНК в изолированные митохондрии картофеля, в / стандартных условиях.
