Введение к работе
Актуальность проблеиы. Оценки превращения энергии в фотосинтезирую-щих клетках обычно основываются на данных по газообмену, т.е. по скорости видимого поглощения углекислого газа или выделения кислорода. Согласно классическому уравнении фотосинтеза:
С02 + HgO —> '/g (С6НІ206) + 02; t Go=*fI4 ккал
на каздый моль поглощенного СО, или выделенного кислорода свободная энергия фотосинтезирующей системы увеличивается на 114 ккал. В этом случае связь между скоростями энерго №э)-и газообменом (Rp) выражается с помощью формулы:
нэ= кг- V
где Кг= 114 ккал/моль, если Ер измеряется в молях газа в единицу времени.
Однако прямые' фотокалориметрические измерения скорости запасания энергии при фотосинтезе у клеток зеленой водоросли хлореллы в сочетании с измерениями скорости выделения кислорода показали, что при низких интенсивностях синего света количество запасаемой энергии почти в два раза больше того количества, которое следовало бы ожидать на основании газометрических измерений (Белл и др., І9Є8; Белл, Шувалова, 1970). Превышение фактически запасенной клеткой энергии над величиной, рассчитанной по результирующему 02-газоооме-ну, было обнаружено затем при насыщающих интенсивностях красного и белого света (Шувалова и др., 1973; Петров, 1975). Эти данные указывают, во-первых, на возможность запасания энергии света в фото-синтезирующей клетке в результате какого-то процесса, не сопро-воздающетося эквивалентным выделением кислорода, и, во-вторых, на зависимость этого процесса от длины волны света. Существование такого расхождения между энерго-и газообменом имеет большое значение для всей фотоэнергетики растений, так как оно означает, что энергетические расчеты, основанные на газометрических данных занижены.
Теоретической основой для постановки подобных исследования, а также правомочности энергетических расчетов, проводимых на основании балансового уравнения (фотосинтеза, послужили экспериментальные данные, показавшие, что углевода не являются единственными продуктами фотосинтеза (Ничипорович, 1955). Гипотеза о разнокачественности
продуктов фотосинтеза получила широкое экспериментальное обоснование (Воскресенская, 1965; 'Тарчввский, 1964; Андреева, 1968; Bassha-n et.al.1981) и пользуется всеобщим признанием.
Несоответствие между энэрго-н газообменом показывает, что на баланс энергии фогосинтезирующей клетки, кроме фотосинтеза влияет еще какой-то или какие-то энергетические процессы, стимулируемые светом. Установление природы этих процессов имеет значение для выяснения факторов, влияющих на эффективность запасания энергии света в растениях.
Было предложено три объяснения наблюдаемому превышению энергообмена над газообменом при фотосинтезе: свет, и, в частности, качество света влияет: I )на первичные энергозапасающие процессы фотосинтеза; 2)на вторичные энергетические процессы, протекающие одновременно с фотосинтезом (например, фотоокислительные реакции) или 3)на фотобиосинтезы и на фотоэндоэргонические реакции, не связанные с ассимиляцией С02, такие как фоторедукция нитрата или нитрита, активный транспорт ионов и в том числе углекислоты (Demi-
dov, Bell, 1978).
Под первичными энергозапасащими процессами фотосинтеза мы будем понимать все те процессы, которые связаны с образованием первых химически устойчивых (или "термически релаксированных"), по выражению Кальвина (Calvin, JUndress, 1963), соединений фотосинтеза, т.е. процессы, связанные с образованием АТФ и восстановителя. Основное внимание в настоящей работе будет уделено первичным эндоэргоническим реакциям фотосинтеза, приводящим к синтезу АТФ. Такой выбор связан с тем, что в результате функционирования циклического (или псевдоциклического) фотофосфорнлирования можно ожидать расхождения между знерго-и газообменом при фотосинтезе. Известно, например, что при циклическом транспорте электронов энергия света может запасаться без выделения 02 и поглощения С02 (Tagawa et.ai., 1963). Имеется достаточно много данных об использовании энергии АТФ циклического фотофосфорилированил на некоторые метабодатические процессы, связанные с запасанием энергии и отличные от ассимиляции углекислоты. Так в интактных клетках за счет цшиического фотофосфорилирования осуществляются реакции биосинтеза крахмала и полисахаридов (Заленский и др., 1966), анаэробная фотоассимиляция глюкозы (Tanner et.al., 1965) или включение Р^во внутриклеточные соединения (Urbach.Giircnler, 1970). Были получены доказательства участия циклического фотофосфорилиро-
вания в синтезе Оелка (Ramirez et.al., 1968) и в поглощении ионов (Jeschke, 1967).
Монет быть и другое объяснение: под действием света усиливается поглощение кислорода ("фотоокислительный процесс"), и часть энергии окисления не деградирует в тепло, а сохраняется в клетке, подобно тому, как при обычной дыхании до 60 энергии окисления может не деградировать в тепло (Белл, 1980). В самом деле, хорошо известно, что у фотосинтезирувдих организмов, в том числе и у хлореллы свет активирует поглощение кислорода, т.е. активирует окислительные процессы (Hied, 1969). Имеется немало данных, где было показано также, что синий свет вызывает более активное поглощение кислорода, чем красный (Воскресенская, Гришина, 1966; Kowailik, Gafrron, 1966). При этом не исключено,что эти светоактпвнрозензав окислительные процессы могут быть сопряжены с запасанием части энергии окисления. На возможность сопряжения фосфорилирования с активированным светом поглощением кислорода указывали ряд исследователей (Агпоп, 1967; Jackson, Voik, 1969). Имеющиеся экспериментальные данные позволяют представить конкретный механизм сохранения энергии окисления, например, при фотодыхании по гликолатному пути. Было показано, что при превращении глищша в серии в клетках наблюдается образование АТФ (Bird et.al. ,1972). Также было показано, что эта АТФ может образовываться в изолированных митохондриях за счет окисления НАДН, образукщегося в реакции глицин-серин в гликолатном пути (TJaidyantha et.al.,1975).
Наблюдаемое превышение энергообшна над газообменом в принципе мокет объясняться и имеющимися в литературе оценкачи энергетических затрат на фотобиосинтезы, не связанные с ассимиляцией углекислоты. Расчеты показывают, что для синтеза клеточного материала необходимо тратить больше энергии, чем на синтез углеводов из С02 и HgO по схеме Кальвина. Так, на включение одного атома углерода в клеточный материал сверх затрат АТФ и НАДФН , используемых на включение атома углерода в углеводы в цикле Кальвина (3 и 2 молекулы соответственно) требуется дополнительно от 0.4 до 2 молекул АТФ (Белл, 1980; Кок, 1972; Raven 1976). Даже если не увеличивается количество органического вещества клетки, дополнительная энергия необходима для поддержания жизнедеятельности клетки. Эта энергия поддержания используется на восполнение потерь клеточных соединений, непрерывно распадающихся в результате гидролиза, денатурации и т.д. Кроме того, значительная часть энергии может использоваться клеткой на процессы
активного транспорта ионов против концентрационных градиентов, на восстановление минеральных источников азота и в других реакциях.
Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы явилось исследование роли различных фотоэндоэргонических процессов, происходящих в фотосинтезирующей клетке, в эффекте расхождения между энерго-и газообменом; выявление вклада АТФ, образуемого при фосфо-рилировании в эндоэргонические процессы, отличные от фотоассимиляции С02- Достижение цели исследования потребовало решения следующих основных задач:
-
Изучить действие качества света (длины волна) на относительный квантовый выход и максимальную скорость фотофосфорилирования на изолированных хлоропластах и целых клетках водорослей.
-
Исследовать возможную роль гликолатного пути превращения углерода в энергетике фотосинтезирующих клеток хлореллы.
-
Выявить участие реакций фотофосфорилирования в механизме концентрирования углекислоты в клетках микроводорослей.
-
Количественно оценить возможность использования восстановителя, образующегося в фотосинтетической электрон-транспортной цени на поддержание процесса нитратредукции в клетке.
Научная новизна. Проведено комплексное изучение действия качества света на первичные энергозапасащие реакции в целых фотосинтезирующих организмах и на изолированных хлоропластах. На линейных участках световых кривых как синего, так и красного света наблюдалось совпадение относительных квантовых выходов всех типов фотофосфорилирования, а при насыщающих интенсивностях света совпадение абсолютных скоростей нециклического и псевдоциклического, фотофосфорилирования. Не было обнаружено влияния качества света на максимальную скорость циклического фотофосфорилирования и циклического переноса электронов в целых фотосинтезирующих клетках хлореллы.
Впервые достаточно полно изучено влияние интенсивности и качества света на выделение гликолата клетками хлореллы при различных концентрациях 02. Показано, что существует связь между выделением в среду гликолевой кислоты, вызываемым светом, и аффектом расхождения между энерго- и газообменом. Установлено, что факторы, благоприятствующие эффекту расхождения, т.е. видимому избыточному запасанию энергии света, являются одновременно и факторами пониженного или полностью подавленного выделения гликолата в среду. С позиции энер-
гетики впервые исследован метаболизм екзогенно добавленных субстратов гликолатного метаболизма. Сделано заключение, что вклад этого пути в энергетический баланс освеженной зеленой клетки может быть значителен. Выявлено, что одним из основных факторов, заметно меняющих интенсивность гликолатного пути в клетках хлореллы, является концентрация СС>2, при которой выращиваются клетки. Был сделан вывод, что фотодыхание по гликолатному пути играет энергетически полезную роль и не является полностью бесполезным, как считалось раньше.
Впервые показано, что процесс адаптации микроводорослей к низкой концентрации С02 не ограничивается только биосинтезом карбоан-гидразы, но и сопровождается адаптивными изменениями в фотосинтетической цепи переноса электронов и фэтофосфэрилирования, что выражается, в частности, в обратимой инактивации ФСІІ и увеличении активности циклического фотофосфррилирования.
На примере клеток хлореллы было показано, что до 20 энергии генерируемой при фотосинтезе в виде восстановительной силы, расходуется на поддержание процесса ниграгредукиии. Получены новые факты, доказывающие, что восстановление нитрата до аммония в клетках может осуществляться без участия цепи реакций, связанных с ассимиляцией С02 в цикле Кальвина, и что этот процесс в энергетическом отношении является вторым по важности фотоэндоэргоническим процессом после ассимиляции COg, осуществляемым клеткой. Сопряжение нециклического переноса электронов с синтезом АТФ, когда конечным акцептором электронов является шГ, может существенно сказываться на потребности энергии при синтезе клеточного материала и таким образом влиять на общий энергетический баланс клетки.
В результате проведенного исследования экспериментально доказано, что энергетические возможности фотосинтеза не ограничиваются совокупностью лишь тех процессов, внешним выражением которых служит фогосинтетический газообмен.
Научная и практическая значимость работы. Проделанная работа дает сведения, представляющие основу для понимания энергетических аспектов, определяющих баланс энергии освещаемой растительной клетки. Полученные экспериментальные результаты и обобщения, касающиеся действия света разного спектрального. состава, дефицита COg, минерального азота на фотосинтез, являются важной составной частью физико--химических механизмов, обеспечивающих устойчивость и надежность функционирования фотосинтетического аппарата клетки. Сформулирован-
ная в работе концепция участия АТФ в реакциях, отличных от ассимиляции С02, расширяет наши представления об участии циклического фото-фосфорилирования и окислительного фосфорилирования в энергетическом балансе фогосинтезирувдих клеток. Выявленные в работе закономерности могут быть использованы для разработки представлений о регуляции эффективности поставки энергии не только на реакции, связанные с ассимиляцией СО,, но и на другие биосинтетические процессы в клетке. Они вносят существенный вклад в выяснение механизмов регуляции первичных процессов фотосинтеза при изменении физиологического состояния клеток и их адаптации к условиям среда.
В работе содержатся оригинальные методические разработки, которые создают основу для дальнейшего прогресса в области изучения участия первичных процессов фотосинтеза в метаболизме углерода, азота, транспорте углекислоты и т.д.
Полученные результаты могут быть использованы для развития исследований в области изучения механизмов эндогенной регуляции фотосинтеза; внутриклеточных механизмов адаптации фотосинтезирующих клеток к условиям углекислотного и азотного обеспечения; при разработке новых регламентов для массового культивирования микроводорослей как продуцентов ценных метаболитов.
Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на Всес. симпозиуме "Фоторегуляция метаболизма и морфогенеза растений" (Москва, 1974); 3-м Всес. биохимическом съезде (Рига, 1974); Расширенном семинаре ИФР АН СССР (1978, 1980); XI Всес. рабочем совещании по вопросам круговорота веществ в замкнутых системах на основе жизнедеятельности низших организмов (Канев, 1981); Всес. совещании "Энергетика, метаболитические пути и их регуляция" (Пущино, 1981); Международной конференции "Кинетика фотосинтетического метаболизма углерода в С3 растениях (Таллин, 1983); 13-х Пущинских чтениях по фотосинтезу-лекция (Пущино, 1986); Всес. конференции "Преобразование световой энергии в фотосинтезирущих системах и их моделях" (Пущино, 1989); Расширенном семинаре КФ АН СССР (Казань, 1989); заседании ВОФР (Пущино, 1989); Всес. конференции "Экологические проблемы накопления нитратов в окружающей среде" (Пущино,1989); 2-м съезде ВОФР (Минск, 1990); "Круглом столе", посвященном исследованию механизмов концентрирования С02 в раститель-хых клетках (Минск, 1990); Международном симпозиуме по фотосистемам (Зап.Берлин, 1990); Международном совещании "Метаболизм углерода и
азота при фотосинтезе" (Пущино, 1991); Международном симпозиуме "Фотосинтез и стресс" (Чешские Будеевицы, 1991); Шведском симпозиуме "дыхание растений" (Умеа, 1992); Российско-Американском рабочем совещании по фотосинтезу (Пущино, 1992); Совещание по продуктивности растений (Екатеринбург, 1992); Научной конференции по проблемам теоретической и прикладной альгологии (Москва, 1992).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано в отечественных и зарубежных научных изданиях 50 работ..
