Введение к работе
Актуальность темн. В проблеме управления продукцконшм процессом растений генетнко-селекционное совершенствование фотосинтетического аппарата занимает в настоящее время ведущее место.
РБФ-карбоксилаза (КФ 4.1 1.39) является ключевым ферментом фотосинтетической фиксации COg. К настоящему времеші большим экспериментальным материалом додшзана роль РЕФ-кар-боксилазы в регуляции интенсивности фотосинтеза и ого адаптационных изменений при постоянно меняющихся условиях внешней среды (smiilie, 1962; Bjorkmann, 1966; Андреева, Авдеева, 1970; Андреева и др., 1982; авторы сборника "Физиология растений", 1982; Мокроносов, 1981, 1983; Еабадаанова и др., 1971,.1978,.1984, 1985; Руке, 1985; Leach, 1985; Jrannir, Larry, 1985; Beelord et al., 1985; Здеардс,Уо-кер, 1986; Говиндаи, 1987). Поскольку ведущая роль фотосинтеза в продукционном процессе не вызывает сомнений, то очевидно, что продуктивность растения в значительной степени может зависеть от реального каталктическог состояния РБФ-карбоксилазы. Комплексное же изучение структурной организации и молекулярно-кинстических свойств РБФ-карбоксилазы у различающихся по интенсивности фотосинтеза и продуктивности исходных и мутантних форм растений не проводилось.
В связи с этим исследование структурных и функциональных особенностей РБФ-карбоксилазы у различающихся по интенсивности фотосинтеза и продуктивности форм растений представляет особую актуальность.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование структурних и функциональных особенностей РБФ-карбоксилазн у различающихся по интенсивности фотосинтеза и продуктивности исходной и мутантной форм хлопчатника.
Дяя доесниения поставленной цели необходимо было решить еледушке задачи:
усовершенствовать в соответствии с особенностями объекта методику получения электрофретически гомогенных препаратов фермента с высокой активностью;
подобрать оптимальные условия гдя проявления аг.тлэ-
ности РБФ-карбоксилазы из листьев хлопчатника;
- изучить молекулярно-кпнеткческке свойства фермента
из листьег хлопчатника сорта І08-Ф и его продуктивного Актанта Луплекс;
исследовать влияние различных условий наделения РБФ-карбоксилазы на проявление множественных молекулярных форм;
изучать зависимость проявления различных молекулярных форм фермента от возраста и условий вырашвания растений;
на основании полученных данных выявить структурные и функциональные особенности РЕФ-карбоксилазы, характерные для продуктивных форм хлопчатника.
Научная новизна и практическая значимость "Работы. Впервые проведены сравнительные исследования молекулярно-кинети- свойств РБФ-карбоксилазы исходного сорта хлопчатника 108-46 и его мутанта Дуплекс, различающихся по интенсивности фотосинтеза и продуктивности. Установлено, что исходная и мутантная формы хлопчатника не различаются по величине молекулярной массы РБФ-карбоксилазы и полипептидному составу больших и малых субъединиц фермента. Различие в структурной организации фер..:анта из обеих форм хлопчатника обнаружены лишь на уровне взаимодействия субъедшшц.РБФ-карбоксилаза исходной и мутантной форм хлопчатника различаются по степени и характеру взаимодействия субъединиц фермента между собой в процессе реакции. Более эффективное взаимодействие субъединиц фермента между собой у продуктивного мутанта приводит к возрастанию сродства РБФ-карбоксилазы к субстратам., максимальной скорости числа оборотов и снижению энергии активации. Такім образом, выявлены структурные и функциональные особенности РБФ-карбоксилазы, характерные для продуктивной формы хлопчатника.
Впервые обнаружены три молекулярные формы РБФ-карбокси-лазы из листьев хлопчатника.' По удельной активности и количественному содержанию множественных форм мутант Дуплекс превосходит исходный сорт. Установлена"зависимость проявления различных молекулярных форм фермента от возраста и условий выращивания растений. Эти данные дают основание полагать, что изменение олигомерного состояния РБФ-карбоксилазы является одним из механизмов регуляции его активности в хлоропластах.
Обнаружено, что мутант Дуплекс отличается о"1 исходного сорта хлопчатника І08-Ф повышенным содержанием водорастворимых белков, большим количеством РБФ-карбоксилазы и увеличе -ниєм ее удельной активности. Полученные данные дают основание предложить в качестве физиологического теста при отборе растений для генетико-селекционкых работ содержание водорастворимых белков в экстрактах из листьев и активность РБФ-карбоксилазы на.единицу листовой поверхности или сырой массы.
Апробация результатов исследований. Основные положения диссертации доложены на Международной конференции "Итоги и перспективы энзимологических исследований метаболизма углерода при фотосинтезе " (16-20 сентября, 199I г., Душанбе); традиционных апрельских конференциях профессорско-преподавательского состава Таджикского госуниверситета (Душанбе,1987, 1989,1990,1991); конференции молодых ученых (Душанбе, 1986, 1991), совместном семинаре лабораторий молекулярной биологии и генной инженерии и молекулярной энзимолопш Института физиологии и биофизики растений АН Республики Таджикистан, лаборатории эизимологии и кафедры физиологии растений Тадаикского госуниверситета.
Публикации. По материалам.диссертации-опубликовано 4 работы. -
Структура, и объем лиосерташщ. Диссертационная работа
изложена на страницах машинописного текста и состоит из
введения, 4 глав, заключения, выводов и списка цитированной
литературы, включающего работ, в то;/! числе иностран-
ных авторов, диссертация содержит рисунков, таблиц и
фотографий.
В качестве объекта наших исследований был выбрал хлопчатник ( Gossypivun hirsutum L., семейство Kalvaceae ) сорта І08-Ф и его мутант Дуплекс.
Цутанг Дуплекс подучен Г.Р.Бикасияном и Л.Д.Усшяовки (IS73) посредством гаї.г.'я-облучения дозой 15 кіілорад сухих семян хпопчатг-.'пка сор-га І03-Ф. Мутант Душі-экс превосходит исходна:: сорт тго интенсивности фотосинтеза на 20* в тасчэте
как на сухой вес, так и на единицу площади листа во все фазы развития растений (Якубова, 1980; Кононенко, 1982). Урожайность у Э"ч>го мутанта на 4,5-10 ц/га выше по сравнению с исходным сортом І08-Ф (Насыров, 1975; Пинхасов и др., 1981;Яку-бова, 1984).
Хлопчатник выращивался с выполнением всех агротехнических мероприятий в полевых'условиях на Гиссарской опытной станции Отдела общей генетики хлопчатника и на экспериментальном участке Института физиолог;.;* и биофизики растений АН Республики Таджикистан.
Содержание беякд в очищенных ферментных препаратах определяли ПО ЫЭТОДу Лоури И Др. ( Lov/гу et ai., 1951) без предварительного осаждения ТХУ (Кочетов, 1981).
Активность ЕБФ-каобоксклазн определяли радиометрическим методом по включению HI4C0g в кислотоустойчивый продукт реакции в присутствии субстрата - рибулозо-1,5-бисфосфата. Активность фермента выражали в мкмоль фиксированной СО2 б минуту в расчете на І мг белка.
Для получения высокоочищенных препаратов ЕБФ-карбокси-лазы брались лизтья 15-25-дневного возраста 3-4-ый сверху, так как ранее было установлено, что они наиболее активно фиксируют углекислоту (Пикхасов, 1981) и обладают наибольшей активностью рибулозобисфосфаткарбоксилазы-оксигеназы (Бабадаа-нова и др., 1984). В связи с большим содержанием в листьях хлопчатника фенольних соединений нам пришлось модифицировать'' методы получения экстракта из листьев и некоторые стадии очистки фермента (Алиев и др., 1981).
Гомогенность Фетаентных препаратов ЕБФ-катэбоксилазн определяли по методу Дэшса ( Eevis, 1964) аналитически!/, диск-электрофорезом'в градиенте концентраций ЇЇААГ от 5 до 15$,используя трисглициновый буфер рН 8,4 и силу тока 4 мА на одну трубочку при продолжительности электрофореза 2,5 часа. Гель окрашивали раствором амидо черный 10 Б в течение 10 мин к отмывали 7%-шал раствором.уксусной'кислоты'до обесцвечивания фона.
Для определения молекулярной массы ЕБФ-карбоксилазы использовали электрофоретически гомогенные ферментные препараты. В качестве метчиков использовали белки, имеющие, различные величины молекулярной"массы..
Полипептидннй состав субъедикиц йетаента оппеделяли по методу Кунга и др. ( Kuns et al., 1974).
Полученные результаты обработаны статистически (Урбах, 1964; Метода биохимического анализа растений, 1978; Лакин, 1980). Представленные данные достоверны при доверительной вероятности 95-98$. .
