Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Морфогенез в культуре клеток in vitro 9
1.1.1. Типы морфогенеза 10
1.1.2. Основные пути регенерации растений in vitro 11
1.1.2.1. Гемморизогенез 12
1.1.2.2. Соматический эмбриогенез 15
1.1.2.3. Особенности регенерации растений из протопластов 31
1.2. Сомаклональная вариабельность 35
1.2.1. Уровни изменчивости генетического аппарата, наблюдаемые в культуре in vitro 36
1.2.2. Факторы, обусловливающие сомаклональную изменчивость 36
1.2.3. Предполагаемые механизмы сомаклональной изменчивости 44
1.2.4. Подходы и методы выявления сомаклональной изменчивости 47
1.3. Гречиха как объект для биотехнологических исследований 50
2. Материалы и методы исследований 53
2.1. Объект исследования 53
2.2. Методы исследования 53
2.2.1. Получение стерильных проростков 53
2.2.2. Выделение и культивирование протопластов и регенерация из них растений 53
2.2.3. Регенерация растений из тканей гипокотилей гречихи 56
2.2.4. Цитогенетический анализ 57
2.2.5. Гистологический анализ 58
2.2.6. Биохимический анализ растений-регенерантов 59
2.2.6.1. Выделение фракции растворимых белков 59
2.2.6.2. Электрофорез белков 60
2.2.7. Статистическая обработка результатов наблюдений 61
2.2.7.1. Подсчет протопластов 61
2.2.7.2. Анализ распределения хромосомных чисел у регенерантов 61
2.2.7.3. Анализ аберраций у растений-регенерантов 64
2.2.7.4. Анализ электрофореграмм белков 64
3. Результаты и обсуждение 65
3.1. Регенерация в культуре гипокотилей проростков гречихи 65
3.1.1. Выбор экспланта 65
3.1.2. Регенерация растений через протопласты 67
3.1.2.1. Эффективность выделения протопластов при использовании различных ферментных композиций 67
3.1.2.2. Культивирование протопластов и регенерация растений культурной гречихи 71
3.1.3. Регенерация через соматический эмбриогенез и геммогенез 77
3.1.3.1. Образование проэмбриогенных клеточных комплексов. Факторы, влияющие на их образование 77
3.1.3.2. Гистологическое исследование процесса формирования ПЭКК 93
3.1.3.3. Регенерация растений из проэмбриогенных клеточных комплексов 98
3.2. Анализ растений-регенерантов на сомаклональную вариабельность ... 103
3.2.1. Фенотипическая изменчивость 103
3.2.2. Генетическая изменчивость 105
3.2.2.1. Анализ хромосомных чисел 105
3.2.2.2. Анализ хромосомных аберраций ПО
3.2.3. Биохимическая изменчивость 114
Заключение 119
Выводы 121
Список литературы 123
- Сомаклональная вариабельность
- Биохимический анализ растений-регенерантов
- Регенерация через соматический эмбриогенез и геммогенез
- Анализ растений-регенерантов на сомаклональную вариабельность
Введение к работе
Методы культуры клеток и тканей широко используются как для проведения фундаментальных исследований, так и для решения практических задач. Успехи применения большинства методов in vitro связаны, главным образом, с возможностью регенерации растений. Существуют три основных пути регенерации растений in vitro - эмбриокультура, соматический эмбриогенез и органогенез. Однако, способов регенерации растений гораздо больше - в зависимости от выбора экспланта, условий культивирования и подхода к поставленной задаче. Можно проводить регенерацию растений, индуцируя к развитию апикальные, пазушные или адвентивные почки, микроклубнями, используя каллусные и суспензионные культуры, культивируя пыльники и семяпочки, применяя методы выделения и культивирования протопластов.
Культивируемые клетки и ткани растений являются пластичной системой, обладающей способностью изменять скорость пролиферации, интенсивность метаболизма, процессы дифференцировки в результате определенных химических и физических воздействий. Это свойство дает возможность подбора условий для максимальной реализации морфогенного потенциала культивируемого объекта.
Известные для гречихи культурной Fagopyrum esculentum способы регенерации осуществляются в основном через стадию каллусообразования и зачастую многократного пассирования каллусной культуры (Lachmann, 1991; Нао et al., 1998; Woo et al., 2000). Такой способ регенерации растений занимает много времени, и не всегда имеет высокую эффективность как в отношении количественного выхода регенерантов, так и их генетической однородности. Использование же в качестве эксплантов незрелых тканей или частей взрослых растений ставит опыты в зависимость от сезона. Поэтому разработка быстрых и эффективных способов регенерации растений из обладающих высоким
морфогенным потенциалом, легкодоступных, асептически выращиваемых тканей является необходимым этапом для развития биотехнологии гречихи.
Цель настоящей работы заключалась в изучении морфогенетической способности тканей гипокотилей проростков гречихи культурной при различных способах регенерации растений. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Разработать способ регенерации растений из протопластов, выделенных из гипокотилей проростков гречихи культурной.
Провести сравнительную оценку эффективности (выход, жизнеспособность и регенерационная активность протопластов) отечественных ферментных препаратов, разработанных в Институте биохимии им. А. Н. Баха, и коммерческих препаратов импортного производства при выделении протопластов из тканей гипокотилей гречихи культурной.
Разработать способ регенерации растений гречихи культурной из тканей гипокотилей 4-5-дневных проростков.
Изучить действие различных факторов на образование проэмбриогенных клеточных комплексов в тканях гипокотилей гречихи и их регенерационный потенциал.
Провести гистологическое исследование процесса образования проэмбриогенных клеточных комплексов.
Провести цитогенетический анализ растений-регенерантов, полученных путем соматического эмбриогенеза и геммогенеза.
Провести сравнительный анализ спектров растворимых белков у линий растений-регенерантов.
Научная новизна работы. Установлена высокая эффективность отечественных ферментных препаратов, предоставленных Институтом биохимии им. А. Н. Баха, по сравнению с коммерческими ферментными препаратами импортного производства при выделении и культивировании
протопластов из разных тканей гречихи. Впервые получены фенотипически нормальные растения при регенерации растений из протопластов гречихи; время, необходимое для их получения, было сокращено в 2 раза по сравнению с результатом Адачи с сотр. (Adachi et al., 1989). Впервые разработан способ регенерации растений гречихи культурной через соматический эмбриогенез из гипокотилеи 4-5-дневных проростков, который позволяет в сжатые сроки (в течение 2 мес.) получить высокий выход генетически однородных растений. Впервые показана возможность регенерации растений у гречихи через стадию формирования ПЭКК (проэмбриогенных клеточных комплексов) из прокамбиальных клеток обкладки сосудистых пучков.
Научно-практическая значимость работы. Полученные данные представляют интерес для специалистов, изучающих процессы дедифференциации, дифференциации и морфогенеза в растительных клетках и тканях. Разработанные нами методы регенерации могут найти применение в области биотехнологии и генетики для интенсификации процесса селекции гречихи. Экспериментальный материал может быть использован для чтения лекций по курсу "Биотехнология растений".
Апробация работы. Материалы диссертационной работы
докладывались и обсуждались на Международном симпозиуме "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988), IV Международном симпозиуме по гречихе (Орел, 1989), III Всесоюзной конференции "Биосинтез целлюлозы и других компонентов клеточной стенки" (Казань, 1990), II съезде ВОФР (Минск, 1990), VII Международном симпозиуме по протопластам "Progress in Plant Protoplast Research" (Швеция, 1991), итоговой научной конференции Казанского научного центра РАН (1990), II Республиканской научной конференции молодых ученых и специалистов (Казань, 1996), X конгрессе FESSP "From molecular mechanisms to the plant: an integrated approach" (Италия, 1996), VIII Международной конференции эмбриологов растений (Польша, 1997), II (X) съезде Русского
ботанического общества "Проблемы ботаники на рубеже XX-XXI веков" (Санкт-Петербург, 1998), VII Международном симпозиуме по гречихе "Advances in Buckwheat Research" (Канада, 1998), II Международном симпозиуме по биотехнологии (Украина, 1998), III Международном симпозиуме "Recent Advances in Plant Biotechnology" (Словакия, 1999), IV съезде Общества физиологов растений России (Москва, 1999), VIII Международном симпозиуме по гречихе "Advances in Buckwheat Research" (Корея, 2001), 17 Международной конференции по регуляторам роста растений (Чехия, 2001), IV научно-практической конференции молодых ученых и специалистов республики Татарстан (Казань, 2001), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), Международной научной конференции «Новая геометрия природы» (Казань, 2003), VIII Международной конференции «Биология растительной клетки in vitro и биотехнология» (Саратов, 2003), V Международном симпозиуме "Recent advances in Plant Biotechnology" (Словакия, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, изложения результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 156 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц, 32 рисунка. Список использованной литературы включает 359 источников, в том числе 295 -иностранных.
Сомаклональная вариабельность
Сомаклональной изменчивостью называются вариации, возникающие на уровне культивируемых in vitro клеток и проявляющиеся у растений регенерантов. Такие измененные растения получили название сомаклональных вариантов (Бутенко, 1999). Спектр регистрируемых изменений в культуре in vitro очень широк. Впервые сомаклональные варианты табака были получены в нашей стране в 1971 году Загорска с сотрудниками (Загорска, Бутенко, Шамина, 1971). Однако общий интерес к возможности получения сомаклональных вариантов возник гораздо позже после опубликования австралийскими исследователями П. Ларкином и У. Скоукрофтом (Larkin, Scowcroft, 1981) статьи о сомаклональной изменчивости как источнике генетического разнообразия в создании новых форм растений. Все изменения, возникающие при культивировании, можно разделить на три основные группы - генные, хромосомные и геномные (Шамина, 1978; Кунах, 1999). Генные, или точковые, мутации связаны с изменением последовательностей нуклеотидов в молекуле ДНК. Хромосомные мутации (аберрации) бывают внутрихромосомными (делеции, дупликации, инверсии) и межхромосомными (транслокации). Геномные мутации возникают в результате изменения числа геномов (гаплоидных наборов). Мутационные изменения происходят как в ядерной, так и в хлоропластной и митохондриальной ДНК. Особенно распространены у растений-регенерантов хромосомные аномалии: полиплоидия, анеуплоидия, хромосомные аберрации. Доля измененных растений может исчисляться десятками процентов. В тех случаях, когда у растений-регенерантов обнаруживаются мутации отдельных генов, их частота на порядок ниже (Karp, Bright, 1985; Brettell et al., 1986). Можно выделить несколько факторов, влияющих на стабилизацию или дестабилизацию культуры тканей и клеток растений: 1) гетерогенность исходного материала; 2) нарушение коррелятивных связей при выделении первичного эксплантата из растения; 3) влияние процессов дедифференцировки и редифференцировки; 4) воздействие условий культивирования; 5) селекция клеток определенного типа.
При культивировании растительных клеток in vitro перечисленные факторы присутствуют всегда вместе. Поэтому довольно трудно, а иногда и невозможно подобрать к ним контрольный вариант в эксперименте. Результаты разных работ трудно сравнить, так как чаще всего используются разные объекты на разных средах. Выбор гормонов, их концентрации и соотношения друг с другом тоже отличаются. Картина осложняется еще и тем, что гормональный состав среды не всегда влияет на культивируемые клетки. Это говорит о том, что определяющим моментом цитогенетического поведения клеточных ядер in vitro является генетическая конституция вида (Фролова, 1981). Гетерогенность исходного материала. В настоящее время общепризнанно, что соматическая полиплоидия - одно из самых распространенных изменений ядра при тканевой дифференцировке растительных и животных тканей.
Отличия возникают в онтогенезе как в результате запрограммированных изменений в процессе дифференциации клеток, так и в результате накопления мутаций. Число и спектр этих геномных изменений зависит от многих факторов - от вида растения, особенностей его генотипа, возраста и условий произрастания, от типа ткани и уровня специализации клеток и т. п. (Долгих, Шамина, 1991; Кунах, 1999). Несмотря на широкое распространение полиплоидии в соматических клетках растений, связанной с дифференцировкой, интактные растения обладают генетической стабильностью. Она обеспечивается сохранением диплоидных клеток в эмбриональных, меристематических тканях, а также зародышевой линии, что требуется для генетического продолжения вида (Фролова, 1981). Клетки дифференцированных тканей обычно делятся редко, и нарушение генотипа в них не влияет на последующие поколения. При введении же в культуру их ядра стимулируются к делению, в результате чего можно получить высоко полиплоидные ткани (Шамина, 1970). В тех случаях, когда сравнительное изучение штаммов проводилось в строго стандартных условиях, авторы приходят к выводу, что основной причиной цитогенетических изменений являются генетические различия исходного материала (Шамина, 1978). Неоднородный эксплант при культивировании in vitro сформирует гетерогенную популяцию, из которой, в свою очередь, будут получены растения, отличающиеся от исходных. Нарушение коррелятивных связей при вычленении экспланта. На сегодня установлено, что механические повреждения, без которых лишь в редких случаях получают культуру клеток in vitro, могут вызывать генетические изменения (Кунах, 1999). Установлено, что поранения индуцируют селективную экспрессию генов, и уже на первых этапах изоляции клеток происходит радикальная перестройка ферментных систем, синтез новых белков, в том числе стрессовых и каллусоспецифичных. Эти процессы сопровождаются дополнительным синтезом ДНК. По некоторым данным сначала происходит преимущественная репликация митохондриальной ДНК.
При этом в ней возникают существенные перестройки, уровень которых находится под ядерным контролем, зависит от продолжительности культивирования, и они могут передаваться растениям-регенерантам. Наблюдается дифференцированная репликация последовательностей как в ядерной, так и в пластидной и митохондриальной ДНК. В результате число копий разных генов в одной клетке изменяется по-разному, а одни и те же гены в клетках разных, даже родственных видов, представлены разным конечным числом копий. Амплификация высокоповторяющихся последовательностей ДНК может приводить и к появлению внехромосомных молекул, размножаемых в дальнейшем автономно (Кунах, 1999). Клетка, а вернее группа клеток, введенная в культуру in vitro, лишается регулирующих сигналов со стороны целого организма и подвергается действию компонентов искусственной питательной среды. Изолирование клеток из интактных растений, нарушая гормональную регуляцию, индуцирует аномалии в функционировании митотического аппарата. Это регистрируется экспериментально по уменьшению активности вторичного метаболизма, амплификации и деамплификации части ДНК, изменению характера метилирования (Долгих, Шамина, 1991). Эти аномалии реализуются в клетках различной плоидности, присутствующих в исходных эксплантах. В зависимости от состава и соотношения экзогенных фитогормонов происходит реализация компетентности к делению разных типов клеток (Шамина, 1988; цит. по Кунах, 1999).
Биохимический анализ растений-регенерантов
Удаление пигментов. Навеску тканей зеленой части растений регенерантов и контрольных растений тщательно растирали сначала в жидком азоте, затем в 3-х кратном объеме ацетона. Полученный гомогенат центрифугировали 15 мин при 8000 об/мин. Супернатант сливали, а осадок ресуспендировали в новой порции ацетона. Эту процедуру повторяли 3 раза. Затем осадок промывали и центрифугировали при тех же условиях: 1 раз - в этиловом спирте, 1 раз - в смеси этанол/диэтиловый эфир (3:1), 1 раз - в диэтиловом эфире. Полученный осадок высушивали в течение 30 мин в вытяжном шкафу, после чего определяли сухой вес. Экстракция белков. Навеску растительного материала (100 мг), методика получения которого описана выше, заливали 600-700 мкл 0,025 мМ трисглицинового (Tricin) буфера и 2 часа инкубировали на качалке (150 об/мин). Затем влажную массу отжимали через капроновую ткань, а фильтрат центрифугировали 15 мин при 8000 об/мин. Полученный супернатант использовали как фракцию растворимых белков зеленых тканей опытных растений. Состав трисглицинового буфера: 0,025 мМ Nris(hydroxymethyl)methyl glycin, 1 мМ ДТТ (дитиотриэтол), 10 мМ PMSF (фенилметансульфонилфторид), рН 8,3. В качестве контроля использовали зеленую часть растений, выращенных в условиях in vitro из семян на агаризованной безгормональной среде В5. Все процедуры проводили в холодильной камере и с холодными растворами. Определение общего количества белка. Содержание белка определяли по степени его связывания с красителем
Кумасси голубым (СВВ G-250, "Sigma") по методу Брэдфорда (Bradford, 1976), т.е. оптическую плотность раствора при длине волны 595 нм. Калибровочную кривую строили по альбумину из сыворотки крови человека (ЧСА). Реактив Брэдфорда. 100 мг СВВ G-250, 50 мл 95% этанола, 100 мл 85% фосфорной кислоты довести бидистиллированой водой до 1 л. Осаждение белков ТХУ. Полученные белки подвергали осаждению трихлоруксусной кислотой. Для этого к определенному объему раствора белков добавляли ТХУ до конечной концентрации 10% и оставляли на 40 мин в морозильной камере. Затем смесь центрифугировали 40 мин при 8000 об/мин. Далее осадок 2 раза отмывали сначала 80% ацетоном, а затем 100% ацетоном, центрифугируя при тех же условиях и выдерживая в морозильной камере в течение 10 мин. Полученный осадок высушивали при комнатной температуре.
В данной работе применялся одномерный электрофорез белков с ДДС-Na по методу Лэммли (Laemmli, 1970) в градиентном (6-16%) полиакриламидном геле (ПААГ). Перед разделением белковые препараты растворяли в специальном буфере (инкубационной смеси), прогревали их в течение 2-х мин на водяной бане и вносили в карманы по 20-30 мкг (20 мкл). В качестве маркеров использовали следующие белки ("Serva", Германия): бычий сывороточный альбумин с молекулярной массой 66 кДа, яичный альбумин - 45 кДа, трипсиноген - 24 кДа, р-лактоглобулин - 18,4 кДа, лизоцим - 14,3 кДа. Разделение белков проводили в течение 2,5-3 часов при напряжении 120 В и силе тока 50-60 мА. Фиксацию и окраску гелей проводили одновременно в одном растворе. После этого полученные гели отмывали и высушивали в натянутом состоянии между листами целлофана. Состав инкубационной смеси: 0,625 М TrisHCl, 2,0% ДДС-Na, 5% (3-меркаптоэтанол, 10% глицерин, 0,001%» бромфеноловый синий. Раствор для фиксации и окрашивания гелей: 96% этанол/ледяная уксусная кислота/вода - в пропорции 40:7:53 с добавлением 0,1% кумасси ярко-голубого. Отмывочный раствор: 96% этанол/уксусная кислота/вода - в соотношении 25:10:65. опыта использовали не менее 120 эксплантов. Все опыты проводились не менее чем в трех биологических повторностях. В некоторых таблицах приводятся данные наиболее характерного опыта. Результаты подсчета хромосом оформляли в виде гистограммы распределения частот. Основной модальный класс определяли по наиболее встречаемой частоте. Частоты встречаемости хромосом у каждой линии группировали по классам плоидности следующим образом:
Оценка разности между долями. Проверку равенства долей клеток с 16 хромосомами у опытных и контрольных линий осуществляли способом, основанным на использовании угловой трансформации (ф-преобразования Фишера) (Лакин, 1990, стр. 120). При этом методе сравниваемые доли выражают в процентах с введением поправки Йейтса на непрерывность, которую вычитают из большей и прибавляют к меньшей доле: Исправленная доля\=р\+100/(2п\), Исправленная доля2= р2+\00/(2п2), где р\ ир2 - контрольная и опытная доли, щ и п2 - контрольная и опытная выборки. Затем по таблице значений cp=2arcsin /p (Лакин, 1990) находят величины для исправленных долей, берут их разность и относят ее к ошибке, т. е. условием для непринятия нулевой гипотезы служит следующее выражение: для числа степеней свободы k = пх + пг - 2 и принятого нами 5%-ного уровня значимости. Для всех рассматриваемых случаев критическая точка = 1,96. Нулевая гипотеза заключается в том, что разница между сравниваемыми долями считается достоверной, если ґф 4і- Обработку результатов опытов проводили с помощью электронных таблиц Excel. Результаты статистической обработки измерений приведены в таблице 1. Из этих данных и из данных, представленных на рисунке 23, следует, что существует два класса растений-регенерантов, имеющих достоверную разницу между долями. К одному относятся растения с распределением хромосомных чисел, отличающимся от контрольного в сторону преобладания диплоидного набора (Э.1, Э.24, Э.25 и т.п.), к другому - одно растение с меньшей, по сравнению с контролем, долей диплоидных клеток (Э.23). Для каждой линии растения-регенеранта подсчет аберраций проводился не менее чем в 100 клетках. Частоту аберрантных клеток определяли по формуле (Стрельчук, 1984): где п - количество аберрантных клеток; N— количество всех учтенных клеток. Ошибку выборочной доли рассчитывали по формуле (Лакин, 1990): где р - выборочная доля, п - объем выборки. Оценку разности выборочных долей аберраций контрольной и опытных линий проводили аналогично расчетам с хромосомными числами. Результаты статистической обработки измерений приведены в таблице 1. Полученные электрофореграммы белков сканировали и обрабатывали с помощью статистических программ "Scion Image" и "Mathcad 2000 Professional" (www.scioncorp.com).
Регенерация через соматический эмбриогенез и геммогенез
При индукции соматического эмбриогенеза в тканях экспланта завершается экспрессия текущей программы развития и происходит ее замещение на эмбриогенную программу экспрессии генов (Mordhorst et al., 1997). Считается, что стресс и регуляторы роста растений играют центральную роль в каскадном механизме передачи сигналов, приводящем к перепрограммированию. Одним из возможных механизмов подавления текущей экспрессии генов является метилирование ДНК, на которое могут влиять ауксины (Lo Schiavo et al., 1989; Lambe et al., 1997). Результатом этого процесса становится серия клеточных делений, которые являются инициаторами либо неорганизованного каллусного роста, либо полярного роста, ведущего к соматическому эмбриогенезу (Dudits et al., 1995). Есть свидетельства того, что стадия развития ткани экспланта определяет необходимость и тип регулятора роста при индукции соматического эмбриогенеза. Например, зиготические зародыши Daucus carota при поранении могут инициировать эмбриогенные культуры на безгормональной среде (Smith, Krikorian, 1990). Проросткам же моркови для образования соматических зародышей в качестве единственного гормонального фактора требуется АБК (Nishiwaki et al., 2000). При этом исследователи обращают внимание на степень развития проростков - чувствительными к обработке абсцизовой кислотой являлись только проростки с гипокотилем короче 30 мм. Литературные данные по индукции соматического эмбриогенеза и органогенеза у гречихи, говорят в пользу применения ауксина 2,4-Д (Neskovic et al., 1987; Румянцева и др., 1989; Woo et al., 2000; Jin et al., 2002). Для индукции соматического эмбриогенеза в тканях гипокотилей проростков гречихи нами также использовался 2,4-Д. Синтетические ауксины, к которым относится 2,4-Д, обычно метаболизируются клеткой в меньшей степени, чем другие ауксины (von Arnold et al., 2002).
Поэтому, чтобы стимулировать образование и дальнейшее развитие соматических зародышей необходимо или удалить гормон из среды, или снизить уровень концентрации гормона. Считается, что при истощении запаса ауксина в среде снимается блок с экспрессии генов, отвечающих за переход зародыша к стадии сердечка (Zimmerman, 1993). В экспериментах мы опробовали различные схемы культивирования эксплантов на жидких средах с варьированием концентрации 2,4-Д: 1) длительное культивирование эксплантов на среде с 2,4-Д - 4,0-6,0 мг/л; 2) прекультивирование эксплантов в течение 4-х или 8 дней на среде I с высокой концентрацией 2,4-Д от 6,0 мг/л до 15,0 мг/л с последующим культивированием их на среде II с концентрацией 2,4-Д от 0,0 до 2,0 мг/л. В процессе культивирования на эксплантах развивались шарообразные структуры, состоящие из мелких, плотно прилегающих друг к другу клеток -проэмбриогенные клеточные комплексы (ПЭКК) (рис. 6,7,8). При этом верхний эпидермальный слой клеток эксплантов постепенно отмирал и слущивался (рис. 6). ПЭКК отделялись от экспланта и выпадали в питательную среду, в которой их можно было в дальнейшем культивировать. Они образовывали суспензию, состоящую из крупных вакуолизированных удлиненных клеток и проэмбриогенных клеточных комплексов, развивающихся, по-видимому, de novo из поверхностных клеток старых ПЭКК. Наши исследования показали, что различные схемы культивирования эксплантов на средах с 2,4-Д заметно влияли на скорость образования ПЭКК на эксплантах и на количество эксплантов, образующих ПЭКК. В первом случае ПЭКК на эксплантах появлялись через шесть недель культивирования. Во втором случае для образования ПЭКК требовалось времени тем меньше, чем дольше экспланты выдерживали на среде I, и чем выше была концентрация Таблица 5. Время появления ПЭКК в среде II в зависимости от длительности культивирования эксплантов из гипокотилей гречихи в среде I и концентрации 2,4-Д в среде II. гормона в среде II (табл. 5). Процесс образования ПЭКК сопровождался развитием на некоторых эксплантах рыхлой каллуснои ткани, которая чаще наблюдалась в случаях более длительного (8 дней) прекультивирования эксплантов на среде I с содержанием 2,4-Д 6,0-8,0 мг/л и практически не встречалась при концентрациях 2,4-Д 10,0-15,0 мг/л. Следует отметить, что при индукции соматического эмбриогенеза у гречихи другими исследователями, никто не отмечал появления подобных глобулярных структур непосредственно в тканях эксплантов. Во всех описанных опытах на эксплантах развивался только каллус, даже в единственном примере прекультивирования эксплантов на среде с содержанием 2,4-Д - 5,0 мг/л (этот результат мог быть следствием добавления в среду 0,1 мг/л кинетина или иного гормонального статуса эксплантов -незрелых зародышей (Neskovic et al., 1987). В остальных случаях это можно объяснить использованием низких (до 2,0 мг/л) концентраций 2,4-Д в сочетании с цитокининами. Кроме того, во всех этих экспериментах экспланты культивирован л и на агаризованных, а не жидких средах (Takahata, Jumonji, 1985; Lachmann,1991; Woo et ai., 2000).
Литературные данные, касающиеся других видов растений, свидетельствуют о возможной стимуляции процессов соматического эмбриогенеза и органогенеза с помощью предобработки эксплантов высокими концентрациями 2,4-Д. Кратковременная (6-24 часа) предобработка эксплантов высокими концентрациями 2,4-Д (до 100,0 мг/л) значительно (на 143% и 130%) повышала эффективность эмбриоидогенеза у тыквы и дыни (Kintzios et al., 2002). Предобработка зрелых зародышей сосны 10,0 мг/л 2,4-Д вместе с 4,0 мг/л БАП и 4,0 мг/л Кин в течение 5, 10, 15, 20, 25 дней вызывала образование глобулярных структур, а затем многочисленных адвентивных побегов (Tang, Guo, 2001). При культивировании зрелых зародышей тритикале на среде с низкой концентрацией 2,4-Д (1,0 мг/л) вызывало обильную пролиферацию рыхлого каллуса, при повышении концентрации 2,4-Д до 4,0 мг/л наблюдалось формирование плотных каллусов с нодулярными структурами, из которых в дальнейшем развивались соматические зародыши (Vikrant, Rashid, 2001). У арахиса предобработка 20,0 мг/л 2,4-Д приводила к образованию глобулярных структур в области средней жилки семядолей зрелых зародышей, т. е. в месте расположения сосудов (Chengalrayan et al., 2001). Следовательно, основным условием образования ПЭКК непосредственно в тканях экспланта можно считать прекультивирование эксплантов на среде с повышенным содержанием одного ауксина - 2,4-Д, а фактором, ускоряющим их появление, - снижение концентрации этого гормона при дальнейшем культивировании. Минеральная основа среды культивирования эксплантов Исследования показывают, что наличие и концентрация определенных макроэлементов в питательной среде могут влиять на эмбриогенную активность и морфологический отклик культивируемых эксплантов и каллусов (Не et al., 1989; Ozias-Akins, Vasil, 1985).
Для индукции соматического эмбриогенеза с успехом используют различные питательные среды. Однако наиболее часто применяют среды на основе минеральных солей MS и В5. Среда Гамборга В5 по сравнению со средой Мурасиге и Скуга MS имеет меньшую совокупную концентрацию неорганических солей. Особенно это касается азота, причем азота в аммонийной форме, которая, как считается, играет важную роль в процессах морфогенеза (Chu et al., 1975; Ammirato, 1983). Нами установлено, что замена в среде культивирования минеральных солей по В5 на MS оказывает влияние на процесс образования ПЭКК в культуре гипокотилей гречихи. При этом происходило изменение картины морфогенетического отклика у эксплантов (табл. 6). На среде II с солями по Bs в отсутствие 2,4-Д на эксплантах развивались корни нормальной морфологии, а на той же среде с концентрацией 2,4-Д от 0,1 до 2,0 мг/л - ПЭКК. На среде II с минеральными солями MS в зависимости от содержания 2,4-Д наблюдали: без 2,4-Д - корни нормальной морфологии; при концентрации 0,1 мг/л - короткие утолщенные корни; при 0,5 мг/л - структуры, имеющие промежуточную морфологию между корнями и ПЭКК; при 1,0 мг/л - обычные ПЭКК; при 2,0 мг/л - каллусирующие, разросшиеся ПЭКК. По всей видимости, такое различие в проявлении морфогенетического отклика связано с разным содержанием компонентов в этих средах, общим содержанием азота, соотношением в среде ионов NO3/NH4 (Gamborg, 1984), элементов азот/фосфор или соотношением азот/ауксин (Sharp et al., 1980). Каждому виду растений соответствует свое оптимальное для эмбриоидогенеза NO3 /NH4 отношение. Для авокадо - это среднее (2:1) (Pliego-Alfaro, Murashige, 1988) и, особенно, высокое (1:0, 3:1) (Witjaksono, Litz, 1999) NO3 /NH4 отношение, для шпината - среднее NO3 /NH4 отношение (Komai et
Анализ растений-регенерантов на сомаклональную вариабельность
Известно, что растения, полученные в культуре, подвергаясь воздействию различных факторов (главным образом гормональной природы), могут отличаться от исходных форм (Кунах, 1999). В культуре клеток растений фенотипическая изменчивость обычно наблюдается в виде широкого разнообразия морфологических признаков, особенностей роста (Сидоров и др., 1985). В целом, практически все растения, полученные нами в процессе регенерации, имели нормальный морфотип. Однако среди них было отмечено несколько отличающихся растений. Отклонения выражались в меньших размерах листовых пластинок, увеличении количества междоузлий, их утолщении и уменьшении длины междоузлий (Э.1, Э. 34, Э. 35) (рис.22). Однако постепенно, в процессе микроклонального размножения, с помощью которого регенеранты поддерживались в культуре, растения этих линий приблизились к фенотипу, сходному с фенотипом регенерантов других линий. Видимо, это явление не связано с устойчивыми изменениями генома, а скорее объясняется эпигенетической изменчивостью и размахом варьирования признаков в пределах исходного вида. Фенотипическая вариабельность у растений-регенерантов гречихи культурной отмечалась также Адачи с соавт. (Adachi et al., 1989), Румянцевой (1990), Нешкович с соавт. (Neskovic et al., 1995) и Уоо с соавт. (Woo et al., 2000). Наблюдаемые изменения касались таких признаков, как окраска и морфология листа (альбиносы, химеры), нерегулярность междоузлий, высота растений, недоразвитие и размер цветов, морфология, размер и количество плодов с одного растения. Другие исследователи, наоборот, отмечали однородность и нормальную морфологию регенерированных растений (Park, Park, 2001; Jin et al., 2002). Фенотипическая вариабельность растений (генетическая основа изменений не была установлена), возникших из протоклонов, была показана у картофеля в работах Дж. Шепарда с сотр. (Shepard et al., 1980). Исследователями были детально проанализированы 35 различных признаков (морфология, окраска листьев, цветков, клубней и др.) у 65 линий растений.
Сообщая о получении нескольких вариантов с более высокой урожайностью по сравнению с контролем, эти авторы указывали на нормальный кариотип (Secor, Shepard, 1981, цит. по Сидоров и др., 1985). При отсутствии каких-либо отклонений в процессе митоза, Дейнеко и др. (1997) наблюдали изменение у регенерантов люцерны такого консервативного признака, как число листовых пластинок. Авторами отмечалась также широкая изменчивость по многим другим морфологическим признакам. Эти факты позволяют рассматривать выявленную вариабельность морфологических признаков у растений-регенерантов и как результат культивирования in vitro, и как природную пластичность признаков. Проведенный нами цитогенетический анализ 30 линий растений-регенерантов, выращенных из соматических зародышей и почек, показал, что подавляющее большинство из них имеют основной модальный класс хромосом 2п=16 (рис. 23,24). Все полученные линии регенерантов по набору хромосомных чисел можно условно разделить на три группы (рис. 23): 1) растения с распределением хромосомных чисел, близким к нормальному. К этой группе можно отнести линии Э.5, Э.6, Э.12, Э.16, Э.22, Э.25, Э.30, Э.36, Э.(2-1), 1X7(8), 1X7(2-1), П.18(2-1). 2) растения с распределением хромосомных чисел, отличающимся от контрольного в сторону преобладания диплоидного набора. При этом можно говорить о генетической стабильности и однородности этих растений. В эту группу можно поместить растения линий Э.1, Э.24, Э.31, Э.ЗЗ, Э.34, Э.35, Э.1(6), 1X11(8), П. 1(2-1), П. 10(2-1), П.13(2-1), П.15(2-1), П. 17(2-1). 3) Растения, у которых уровень диплоидных клеток ниже, чем в контроле, а число анеуплоидных (рис. 25) и полиплоидных (рис. 26) клеток значительно выше - Э.21, Э.23, Э.39. Возможно, эти растения представляют собой химеры, образовавшиеся в результате развития зародышей из нескольких клеток. Согласно статистической обработке (табл. 1) только одна из всех изучаемых линий - Э.23 - имела долю диплоидных клеток ниже, чем в контроле (рис. 23). Нужно также отметить, что у растений семи линий разброс хромосомных чисел был меньше, чем в контроле - Э.24, Э.43, П. 1(6), П. 11 (8), П.1(2-1), П.15(2-1), П.17(2-1) (рис.23). Хаким образом, однородность среди полученных регенерантов составила 96,6%. По мнению Васил (Vasil, Vasil, 1981), растения, регенерированные из эмбриоидов, поскольку, как правило, они формируются из одной инициальной клетки, являются более удачными для целей мутационной селекции и генетического анализа по сравнению с растениями, образованными через органогенез.
При геммогенезе образование почки идет из нескольких клеток, в связи с чем частота миксоплоидных клеток в растении, полученном таким путем, значительно выше, чем в растении, полученном путем соматического эмбриогенеза. Однако из наших исследований видно (рис. 23), что процент диплоидных клеток у растений, полученных через геммогенез, очень высок (до 94%) и только у одной линии снижается до 61,17%. Стабильность хромосомных чисел была показана при регенерации растений из протопластов культурной гречихи (Adachi et al., 1989) и при регенерации вегетативных почек из каллуса, индуцированного на гипокотилях проростков (Jin et al., 2002). Причем, как отмечалось выше, растения из протопластов имели многочисленные морфологические нарушения, а растения из почек демонстрировали морфологическую однородность. Начальный уровень плоидности экспланта может существенно влиять не только на темпы полиплоидизации, но и на процессы редукции числа хромосом. Это является еще одной причиной, по которой при регенерации растений стараются использовать незрелые и ювенильные экспланты. При этом у разных видов эта зависимость имеет разную степень выраженности (Кунах, 1999). Об изменении хромосомных чисел в процессе регенерации растений гречихи сообщали Такахата и Джумонжи (Takahata, Jumonji, 1985). Из 26 регенерантов пять растений имели тетраплоидный набор хромосом, а два растения были миксоплоидами. При регенерации из пыльников (Berbec А., Doroszewska, 1988b) у тетраплоидного сорта гречихи из 16 растений большинство (12) сохранило исходное число хромосом, но были выявлены три октоплоида и один анеуплоид с 36 хромосомами. У диплоидных сортов в работе тех же авторов среди 24 регенерантов не оказалось ни одного гаплоида, преобладающим было число хромосом 32, видимо, вследствие удвоения первоначального числа хромосом; были обнаружены также три диплоида, один октоплоид и два миксоплоида.
По мнению словенских исследователей (Bohanec et al., 1993) у регенерантов, полученных из пыльников, существует сильная тенденция к эндодупликации. Вариабельность, проявляемую тканями гречихи в экспериментах по регенерации, Уоо с соавт. (Woo et al., 2000) объясняет тем, что эксплантами служат растения и проростки, получаемые из разных семян смешанной популяции. Гречиха является перекрестноопыляемым растением, вследствие чего все растения даже одного сорта можно рассматривать как гибридные, не совсем однородные по морфологическим и биологическим признакам (Кротов, 1975). Такие растения демонстрируют повышенную вариабельность и в культуре in vitro. Следует учитывать также как методическую тонкость при цитогенетических исследованиях то, что для диплоидных и тетраплоидных растений гречихи культурной в норме характерна эндополиплоидизация ядер в клетках периблемы кончика корня (Захарьева, 1962, цит. по Кротову, 1975). Это свойство гречихи проявилось в контрольных растениях, используемых в нашей работе (рис. 23). Как показывают литературные данные, полной однородности по плоидности клеток в популяции обычно добиться не удается. Миксоплоидия клеток проявляется при их переносе на искусственную питательную среду, которая лишь в начале пассажа имеет более или менее константный состав. По мере перехода клеток к активной репродукции происходит, естественно, потребление необходимых питательных веществ и одновременное пополнение среды токсичными продуктами жизнедеятельности клеток. Клетки с разным набором хромосом характеризуются различными трофическими потребностями, то есть скорость накопления в популяции клеток с определенным набором хромосом лимитируется определенными компонентами. Повышение уровня плоидности культивируемой клетки делает ее менее чувствительной к изменению состава среды. Таким образом, миксоплоидия и полиплоидия культивируемых клеток - это два цитогенетических механизма адаптации их к условиям существования (Бондаренко, 1996).
Похожие диссертации на Реализация морфогенного потенциала гипокотилей гречихи культурной Fagopyrum Esculentum Moench. в зависимости от способа регенерации растений IN VITRO
