Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Биологическая характеристика и особенности гречихи посевной 10
1.2. Основные направления селекционной работы с гречихой 22
1.3. Полиморфизм растений по фенольным соединениям 28
1.4. Физиологическая роль флавоноидов и факторы, влияющие на накопление рутина в растениях 36
1.5. Антиоксидантная система растений 47
Глава 2. Объекты и методы исследования 50
2.1. Рельеф местности, метеорологические условия, тип почвы 50
2.2. Объект исследования 51
2.3. Лабораторные опыты 53
2.4. Биохимические методы исследование 56
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждения 59
3.1. Сравнительное исследование флавоноидов гречихи посевной 59
3.1.1. Сравнительное исследование флавоноидов в разных частях растения гречихи посевной 61
3.2. Накопление полифенольных соединений в растениях гречихи посевной 67
3.2.1. Изучение динамики накопления флавоноидов гречихи посевной 67
3.2.2. Изучение динамики полифенольных соединений в проростках гречихи посевной 73
3.3. Варьирование биохимических показателей сортов гречихи посевной и взаимосвязь физиологического состояния 77
3.3.1. Сравнительный анализ содержания МДА, СОД и ПФС в органах гречихи посевной в онтогенезе 78
3.3.2. Активность супероксиддисмутазы в онтогенезе растений гречихи 81
3.3.3. Уровень малонового диальдегида в онтогенезе растений гречихи 84
3.3.4. Зависимость активности полифенолоксидазы в растениях гречихи посевной от содержания антоцианов 86
3.3.5. Зависимость активности полифенолоксидазы в растениях гречихи посевной от содержания полифенольных соединений 87
3.4. Накопление полифенольных соединений в зависимости от активности фенилалаиинаммиаклиазы 91
3.4.1. Содержание комплекса полифенольных соединений гречихи посевной 91
3.4.2. Изучение накопления полифенольных соединений в зависимости от активности фенилалаиинаммиаклиазы 93
3.5. Оценка флавоноидов и антоцианов гречихи посевной 99
3.5.1. Токсикологическая оценка флавоноидов и антоцианов гречихи посевной 99
3.5.2. Флавоноиды гречихи - биостимуляторы роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae 102
Заключение 105
Выводы 107
Список литературы 108
Приложения 127
- Полиморфизм растений по фенольным соединениям
- Сравнительное исследование флавоноидов в разных частях растения гречихи посевной
- Зависимость активности полифенолоксидазы в растениях гречихи посевной от содержания полифенольных соединений
- Изучение накопления полифенольных соединений в зависимости от активности фенилалаиинаммиаклиазы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Состояние пониженной функциональной активности живых организмов, обусловленное факторами среды (низкая или высокая температура, отсутствие влаги и другие стрессоры), при сохранении их высокой жизнеспособности после восстановления нормальных условий жизнедеятельности и возобновления активной деятельности всех его функциональных систем определяется их адаптационными механизмами, заложенными в физиологических, молекулярно-генетических и биохимических особенностях растительного организма.
Действие приспособительного потенциала на биохимическом уровне проявляется с участием белков и функционально активных молекул в регуляции метаболических процессов.
Полифенольные соединения являются одними из наиболее распространенных представителей вторичного метаболизма в тканях высших растений. Они участвуют в основных процессах жизнедеятельности растительных клеток: дыхании, фотосинтезе, формировании клеточных стенок, защищают растение от действия стресс-факторов абиотического и биотического происхождения [Запрометов, 1993, 1996].
Растительные полифенолы находят широкое практическое применение. Они используются в пищевой промышленности, а благодаря высокой биологической активности, как лекарственные средства с нейрорегуляторными, капилляроукрепляющими, иммуномодулирующими и противоопухолевыми свойствами в медицине [Куркин и др., 2003, 2004, Барабой, 1984, Weinreb et al., 2008; Antonio, Druse, 2008].
В последние десятилетия внимание исследователей обращено на растения, характеризующиеся высокой способностью к образованию вторичных веществ, относящихся к полифенольным соединениям рода Fagopyrum Mill., вид Гречиха обыкновенная - Fagopyrum esculentiim Moench. [Комисаренко, 1973]. Наряду с их типичным представителем вторичного метаболизма рутином в растениях гречихи были обнаружены такие продукты, как хлорогеновая кислота, изокверцетрин, никотифлорин, кверцетин [Анисимова, 2010].
Известно, что накопление рутина является одним из определяющих факторов продуктивности и устойчивости растений гречихи посевной [Клыков, 2000], но остается открытым вопрос по изучению механизмов регуляции накопления не только рутина, но и всего комплекса полифенольных соединений, называемых в дальнейшем флавоноидами. Кроме того, наблюдается взаимосвязь накопления флавоноидов и антоцианов в различных органах гречихи посевной с работой окислительно-восстановительных ферментов растения гречихи посевной в процессе онтогенеза районированных сортов Орловской области. Однако недостаточно изученными являются биохимические механизмы регуляции и метаболические пути роста и развития растений гречихи посевной, обеспечивающие высокую жизнеспособность растений и причины, вызывающие процесс накопления флавоноидов в процессе онтогенеза. Исследование биосинтеза флавоноидов и антоцианов в растительных тканях позволяет определить пути адаптации растений к неблагоприятным условиям среды и понять физиолого-биохимические механизмы их устойчивости. Поэтому исследование накопления флавоноидов и антоцианов в комплексе имеет большое теоретическое и практическое значение. Познание механизмов регуляции биосинтеза физиологически активных соединений является актуальным в связи с перспективой практического использования растительных объектов с целью получения важных для народного хозяйства метаболитов, получения высоковитаминных растительных продуктов, кормовых добавок для интенсивного животноводства, обладающих высоким фармакологическим и медицинским эффектом. В перспективе растения, обладающие высоким уровнем пигментов, могут быть использованы для генноинженерного конструирования растений с высокой адаптивной и иммунной способностью.
Эндогенный уровень антоциановых пигментов может являться эффективным показателем физиологического состояния клеток растительных организмов, тканей и растительных экосистем в целом. Содержание антоцианов может служить тестом, характеризующим степень стресс-устойчивости растения, что важно для выведения новых сортов.
Изучение механизмов накопления флавоноидов в ходе роста и развития растения с учетом сортового разнообразия, с их локализацией, качественным составом и с потенциалом флавоноидов в защите растений от вредителей и болезней других сельскохозяйственных культур, является актуальным.
Цель и задачи. Целью работы являлось исследование накопления флавоноидов в разных сортах гречихи посевной в процессе онтогенеза и исследование антиоксидантного действия комплекса полифенольных соединений.
Задачи:
-
Выявить качественный состав, содержание и локализацию флавоноидов комплекса полифенольных соединений гречихи посевной Fagopyrum esculentum М
-
Установить динамику накопления флавоноидов по фазам развития растения гречихи посевной (всходы, ветвление, бутонизация, цветение, плодоношение)
-
Определить динамику накопления флавоноидов по органам гречихи посевной
-
Провести характеристику физиолого-биохимических показателей сортов гречихи посевной по фазам онтогенеза с учетом накопления полифенольных соединений
-
Обосновать практическую значимость флавоноидов и антоцианов
Научная новизна. Впервые проведена оценка качественного и количественного состава флавоноидов и антоцианов районированных сортов гречихи посевной Орловской области в зависимости от физиолого-биохимического состояния растения и активности супероксиддисмутазной ферментной системы. Проведена оценка содержания полифенольных соединений, флавонолов и антоцианидинов в различных органах и периодах онтогенеза. Установлена динамика накопления флавоноидов гречихи посевной в зависимости от физиолого-биохимических особенностей сортов исследуемых растений.
Практическая значимость. Выявлено селекционно-хозяйственное значение динамики накопления флавоноидов и антоцианов для выведения более адаптированных сотов гречихи посевной Орловской области. Проведена токсикологическая оценка флавоноидов и антоцианов гречихи посевной, как природных антиоксидантов, с возможностью их применения в промышленном животноводстве в качестве биологически активного вещества. Разработан стимулятор роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Отдельные положения работы могут быть использованы в преподавании курсов органической химии и химии биологически активных веществ, при проведении занятий по биохимии и основам биохимии и молекулярной биологии.
Положения, выносимые на защиту.
-
Флавоноиды гречихи посевной представлены О-гликозидами и агликонами кверцетина, цианидином и его гликозидами, хлорогеновой кислотой с локализацией гликозидов в листе и цветке растения, агликонов – в стебле и корне.
-
Динамика накопления флавоноидов гречихи посевной (Fagopyrum esculentum) находится в зависимости от активности антиоксидантной системы растения на начальных этапах онтогенеза и мощности пула системы первичного метаболизма.
-
Флавоноиды и антоцианы, выделенные из гречихи посевной, обладают гепатопротекторными и ростостимулирующими свойствами.
Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на заседании ученого совета ФГБОУ ВПО «ОрелГАУ»; на конференциях: Материалы второго съезда общества биотехнологов России (2004 г.); Материалы научно-методической конференции «Физиологические аспекты продуктивности растений» (2004 г.); Proceeding of the 9th International Symposium on Buckwheat / Congress Centre, University of Agriculture, Prague (2004 г.); Материалы региональной научно-практической конференции молодых ученых 19-22 апреля 2011 «АПК в современном мире: взгляд научной молодежи» (2011 г.); III Международной интернет-конференции 5 апреля 2010 к 35-летию ОГАУ: «Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химии сельскохозяйственному производству» (2010 г.); Международной научно-практической конференции /Новосибирский государственный аграрный университет.- Новосибирске (2011 г); IV Международной заочной научно-практической конференции 30 мая 2011 г. «Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химии сельскохозяйственному производству» (2011 г.); V заочной научно-практической Интернет-конференции 2 апреля 2012 « Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химии сельскохозяйственному производству» (2012 г.); региональной научно-практическая конференции молодых ученых 17-18 апреля 2012 «Современный агропромышленный комплекс глазами молодых исследователей» (2012 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в т.ч. 3 в журналах рецензируемых ВАК РФ, Патент РФ №2483105.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 136 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов, заключения, приложения, списка литературы, включающего 181 источник. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 52 рисунками.
Полиморфизм растений по фенольным соединениям
Фенольные соединения выполняют важную роль в фотосинтезе и дыхании. Например, изопреноидные производные гидрохинона (п- бензохинона) -пластохиноны и убихиноны - являются обязательными компонентами электронтранспортных цепей хлоропластов и митохондрий (Запрометов, 1996). Некоторые флавонолы, флавоны, халконы, дигидрохалконы и другие представители фенольных соединений выступают в качестве разобщителей окислительного фосфорилирования в митохондриях. Другие фенольные соединения (некоторые флавоноиды, накапливающиеся в хлоропластах) поддерживают функциональную активность пластид, защищая их от фотоокисления и участвуя в удалении активных форм кислорода и свободных радикалов, неизбежно образующихся в процессе их работы (Zhao, Zou, 2002).
Помимо фотосинтеза и дыхания фенольные соединения участвуют в процессах роста и развития растений. Показана сигнальная роль флавоноидов при опылении растений (Pollak et al., 1993). На примерах растений табака было продемонстрировано, что в пыльниках цветков образуются флавонолы кемпферол и кверцетин, а также их гликозиды, которые стимулируют прорастание пыльцы и рост пыльцевой трубки (Минаева, Горбалева, 1967; Ylstra et al., 1992). Мутанты кукурузы и петунии, у которых блокировано образование флавоноидов, являлись самостерильными, так как не могли формировать функционально активную пыльцевую трубку (Mo et al., 1992, Pollak et al., 1993).
В процессе онтогенеза растительных клеток (их дифференциации) происходит формирование вторичных клеточных стенок, в которых наряду с целлюлозными и гемицеллюлозными фибриллами присутствует полимер фенольной природы лигнин, выполняющий важную структурную роль (Higuhi, 1980; Boudet, 2000; Boerjan et al., 2003). Образование лигнипов свойственно всем сосудистым растениям. В эволюционном аспекте благодаря этому стало возможным существование наземной растительности, в частности, древесных растений, у которых содержание лигнина достигает 20-35 % от сухой массы (Запрометов, 1996). При его участии образуются элементы ксилемы и обеспечивается прочность древесины. В лекарственных растениях содержание флавоноидов при умеренной влажности и температуре, высоте над уровнем моря и почве богатой азотом, калием, фосфором, специфично. На накопление флавоноидов оказывают влияние возраст и фаза развития растения. Отмечается, что в молодых растениях их больше, чем в старых. Максимальное содержание флавоноидов наблюдается в цветках, листьях и травах в период бутонизации и цветения, а к фазе плодоношения содержание снижается; в плодах и семенах - в период молочной зрелости - полного созревания; в подземных органах максимальное накопление в период плодоношения; в корнях - в период увядания надземной массы осенью.
На накопление флавоноидов влияет освещенность. Содержание флавоноидов в растениях увеличивается с ростом освещенности и степени их гидроксилирования (число - ОН групп). В южных и высокогорных районах, под влиянием света и на почвах, богатых микроэлементами, увеличивается содержание флавоноидов. Содержание антоцианов увеличивается при понижении температуры (покраснение листьев у щавеля), у других групп флавоноидов, наоборот, содержание увеличивается при повышении температуры (Запрометов, 2002).
Флавоноиды образуются в растениях. Они обнаружены почти во всех высших растениях (цветковых и споровых), а также в зеленых водорослях (ряски), споровых (мхи, папоротники), хвощах (хвощ полевой), и даже у некоторых насекомых. Преимущество по содержанию флавоноидов имеют высшие растения, относящиеся к семействам: цитрусовых, розоцветных, бобовых (софора японская), гречишных (различные виды горцев - перечный, почечуйный, птичий, гречиха), астровых, яснотковых, а так же в тропических и альпийских растениях. Значительно реже встречаются в микроорганизмах и насекомых (мраморно-белая бабочка). Около 40% флавоноидов приходится на группу производных флавонола, несколько меньше группа производных флавона, значительно реже встречаются флаваноны, халконы, ауроны.
В растениях флавоноиды содержатся чаще всего в виде гликозидов, которые растворены в клеточном соке, сосредоточены в вакуолях и фторо- и хлоропластах. Количество флавоноидов в течение вегетационного периода колеблется. Известно, что флавоноиды принимают участие: в окислительно-восстановительных процессах и в процессе фотосинтеза. Совместно с аскорбиновой кислотой участвуют в энзиматических (ферментативных) процессах окисления и восстановления. Флавоноиды могут быть ингибиторами прорастания семян. Биологическая роль флавоноидов в жизни растений, как растительных пигментов - придать яркую окраску цветкам, чем привлечь насекомых и усилить опыление и размножение растений, т.е. они участвуют в процессе оплодотворения высших растений. Флавоноиды способствуют выработке иммунитета и в защите растений от неблагоприятных воздействий ультрафиолетовых лучей и низких температур. Предполагается, что благодаря способности поглощать ультрафиолетовое излучение (330-350 нм) и части видимых лучей (520-560 нм) флавоноиды препятствуют избытку радиации. Это подтверждается локализацией флавоноидов в эпидермальных клетках растений. А способность некоторых флавоноидов защищать аскорбиновую кислоту от окисления, проявляют себя антиоксидантами. Входя в состав экстрактивных веществ древесины, флавоноиды способны придавать ей особую прочность и устойчивость к поражениям патогенными грибами (Барабой, 1976).
Растения в естественных условиях постоянно сталкиваются с многочисленными вредителями и паразитами. На ранних этапах своего развития они сразу же подвергаются атаке со стороны вирусов, бактерий и паразитических грибов. В связи с этим важной ролью полифепольных соединений является защита растений от действия патогенов. При этом она реализуется несколькими путями. Во-первых, как правило, многие конститутивные фенольные соединения (постоянно присутствующие в тканях и органах растений) сами по себе обладают широким спектром антимикробной, фунгицидной или инсектицидной активности (Nicholson, Hammerschmidt, 1992; Запрометов, 1993; Yao et al., 1995; Punyasiri et al., 2005). Во-вторых, при поражении патогенами активируется биосинтез полифенольных соединний, характерных для данного вида растений, который сопровождается повышением активности соответствующих ферментов, таких, например, как L- фенилаланин-аммиак-лиаза, 4-гидроксилаза транс-коричной кислоты и халконсинтаза (Запрометов, 1996; Beckman, 2000; Amthor, 2003). При этом в покровных тканях резко возрастает концентрация фенольных соединений, оказываясь токсичной для патогенных микроорганизмов, что препятствует их размножению и проникновению внутрь растения. В-третьих, индуцируется синтез мощных защитных веществ - фитоалексинов, которые образуются в результате ответной реакции на контакт растения с патогеном и являются токсичными для него. В здоровых тканях они, как правило, либо отсутствуют, либо содержатся в ничтожно малых количествах. Среди всех известных на сегодняшний день фитоалексинов подавляющее большинство (свыше 80%) приходится именно на соединения фенолыюй природы (Запрометов, 1996). Наиболее детально они изучены у бобовых растений, где представлены разнообразными изофлавоноидами (Friend, 1985; Lozovaya et al., 2004). У других растений в ответ на действие патогена образуются фитоалексины класса стильбенов, флаванов, кумаринов, ауронов и др. (Brinker, Seigier, 1991; Harbome, 1994; Дмитриев, 1999).
Содержание флавоноидов в растениях различно: в среднем 0,5-5%, иногда достигает 20% (в цветках софоры японской). В лепестках цветков обычно находятся антоцианы (гликозиды антоцианидинов), обусловливая окраску большинства алых, красных, розово-лиловых и синих цветков. В окраске желтых цветков принимают участие флавоноловые гликозиды, ауроны и халконы, хотя наиболее важным источником желтой окраски в природе являются каротипоиды. Гликозилирование флавоноидных пигментов цветков имеет существенное значение: обеспечивает их устойчивость к свету и действию ферментов и в форме гликозидов улучшается растворимость пигментов в клеточном соке. Плодам окраску придают антоцианы. В листьях из флавоноидов преобладают флавоноловые гликозиды. В семенах флавоноиды могут находиться в свободном и связанном состояниях. Под влиянием ферментов они расщепляются на сахара и агликоны. Интенсивность образования углеводов в растении напрямую влияет на накопление флавоноидов. В качестве Сахаров встречаются D-глюкоза, D-галактоза, D-ксилоза, L-рамноза и L-арабиноза, может присоединяться также одна D-глюкуровая кислота. Кетогексозы обычно не принимают участия в образовании флавоноидных гликозидов. Все перечисленные сахара встречаются в пиранозной форме, а арабиноза - в фуранозной форме. Сахара, как правило, соединены с фенольными гидроксилами. Из дисахаридов во флавоноидных гликозидах наиболее распространены рутиноза (рамноза 4-глюкоза); софороза (глюкоза + глюкоза); самбубиоза (ксилоза + глюкоза). О трисахаридах известно меньше, чем о дисахаридах, описано всего 6 трисахаридов. Не найдены флавоноидные гликозиды, содержащие более трех остатков Сахаров. Все флавоноидные гликозиды делятся на три группы: О-гликозиды, С-гликозиды и комплексные соединения.
Сравнительное исследование флавоноидов в разных частях растения гречихи посевной
Для выявления локализации флавоноидов и антоцианов в растении гречихи посевной проводились сравнительные исследования органов растения гречихи посевной сорта Дикуль.
Оценка качественного состава флавоноидов гречихи посевной проводилась методом бумажной хроматографии по методике Джеффри Б. Харборна. Исследовались водно-спиртовые извлечения вегетативной массы гречихи посевной. При этом в качестве экстрагента нами выбран 70 % спирт этиловый (Анисимова, 2010).
Оценка качественного состава флавоноидов гречихи посевной проводилась методом тонкослойной хроматографии по оригинальной методике (Анисимова,2010).
На хроматограмме обнаруживается доминирующее пятно с величиной около 0,4 (рутин), а также проявляются другие пятна, в частности, пятно фиолетового цвета с величиной Rf - 0,2 (хлорогеновая кислота), с - 0,45 (никотифлорин), - 0,8 (кверцетин) и с Rf - 0,6 (изокверцитрин), красное пятно антоциана и ряд пятен не идентифицированных.
На основе результатов хроматографического исследования вегетативной массы растения выявлено присутствие рутина, как целевого компонента, во всех сравниваемых сортах гречихи посевной. Флавоиоидный состав, обнаруженный в листьях, является наиболее разнообразным. Наибольшая разнообразность флавоноидов выявлена в листьях и цветках сорта Дизайн.
Спиртовые экстракты из разных органов гречихи подвергали обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе «Милихром-4-УФ», колонка 2x80 мм, сорбент Сепарон С-18 с использованием элюента ацетонитрил:трифторуксусная кислота. Расход элюента - 80 мкл/мин. При анализе использовались стандарты: кверцетин, цианидин хлорид и хлорогеновая кислота. Пик 1 соответствовал цианидину, пик 2- хлорогеновои кислоте, пик 5- кверцетину (рис. 1, рис. 2).
В ходе исследования было выявлено, что локализация в растении гречихи посевной зависит от типа флавоноида. Гликозиды содержатся в вакуолях, а агликоны и метоксилированные соединения в периплазматическом пространстве [Алехина, Балнокин, Гавриленко, 2005].
Анализ экстрактов из стебля и корня гречихи посевной показал содержание в них цианидина, кверцетина, относящихся по своему молекулярному строению к агликонам. Тогда как экстракты листьев и цветков содержали их гликозидные формы - антоцианы и 3-рутинозид кверцетина (рутин). В отношении локализации рутина в растении гречихи отмечено, что в листьях его содержание больше, чем других частях растения. Листья и цветки вместе содержат в среднем от 63,2 до 76,5% всего рутина растения, а стебли - от 7 до 15,7%, корни - от 1,7 до 5%, в зависимости от сорта гречихи, что согласуется с предыдущими исследованиями [Клыков, 2000, Горькова, 2002, Анисимова, 2012,].
Таким образом, гликозиды флавоноидов располагаются в цветках и листьях растения гречихи посевной, агликоны флавоноидов локализованы в стебле и корне, как и более простые соединения полифенольной природы.
Для всех растений характерно распределение пигментов цианидинового ряда следующим образом: глюкозиды - в цветках и листьях; пигменты, лишенные углеводистых остатков — в стебле и незначительное количество содержи і ся в корне растения. Это связано с ферментативными изменениями в растении на стадиях преобразования дигидрофлавонолов: для большинства характерен переход дигидрокемпферол— дигидромирицитин, но у гречихи преобразование идет в направлении дигидрокверцетина и в дальнейшем - цианидина (рис. 3).
При дальнейшем исследовании антоцианов гречихи посевной при сравнительном анализе перспективного сорта Дружина (Уша) Орловской области и высокорутинового сорта Башкирская красиостебельная Башкирского НИИСХ было выявлено, что основным антоцианом сортов является цианидин.
На хроматограмме (рис. 4 А) сорта Башкирская красиостебельная путем детектирования при длине волны 220 нм обнаружены 2 пика. Пики 1 и 2 - с площадью под пиками 191,3 мм2 и 11,5 мм2 соответственно. Время удерживания на колонке составляет 3,8 мин и 19,4 мин. Пики веществ идентифицировались по сравнению со стандартами и были определены как цианидин и кверцетин соответственно. На хроматограмме (рис.4 Б) обнаружен один преобладающий пик с площадью 8,6 мм2 и временем удерживания на колонке 2,6 мин. После гидролиза водно-спиртового экстракта антоцианов, на хроматограмме обнаружены при длине волны 220 нм 2 пика. Пики 1 и 2 - с площадью под пиками 3,97 мм2 и 0,97 мм2 соответственно и временем удерживания 3,37 мин и 6,67 мин, что соответствует стандартам цианидину и хлорогеновой кислоте.
На хроматограмме (рис.5 А) сорта Дружина путем детектирования при длине волны 220 нм обнаружены 2 пика. Пики 1 и 2 - с площадью под пиками 100,9 мм2 и 14,3 мм2 соответственно. Время удерживания на колонке составляет 3,8 мин и 16,6 мин. Пики веществ идентифицировались по сравнению со стандартами и были определены как цианидин и кверцетин соответственно. На хроматограмме (рис.5 Б) обнаружен один преобладающий пик с площадью 11,7 мм и временем удерживания на колонке 2,6 мин. После гидролиза водпо-спиртового экстракта антоцианов, на хроматограмме обнаружены при длине волны 220 нм 2 пика. Пики 1 и 2 - с площадью под пиками 2,94 мм2 и 0,43 мм соответственно и временем удерживания 3,4 мин и 6,7 мин, что соответствует стандартам цианидину и хлорогеновой кислоте.
Таким образом, на основании данных хроматографического анализа можно предполагать, что изучение динамики накопления флавоноидов требует анализа содержание всего комплекса веществ имеющих полифенольное строение.
Зависимость активности полифенолоксидазы в растениях гречихи посевной от содержания полифенольных соединений
По литературным данным известно, что активность растворимой пероксидазы в тканях озимой пшеницы находится в обратной корреляции с накоплением в них полифенолов. Высказывается мнение о том, что оксидазы могут регулировать процессы ПОЛ в растениях (Олениченко, 2006).
Соотношение активности полифенолоксидазы и содержание флавоноидов по фазам онтогенеза в индетерминантном сорте гречихи посевной Баллада, Молва и Башкирская красностебельная характеризуется следующим образом: в фазу всходы в корнях растения гречихи сорта Баллада активность фермента выше, чем в стеблях и листьях в 3,3 раза (рис. 20). Тогда как у сорта гречихи Молва наблюдается соотношение активности ПФО в органах растения с небольшим перевесом в листьях растения гречихи сорта Молва (рис. 21). При этом отмечено, что содержание флавоноидов увеличивается при снижении активности фермента.
Анализ соотношения содержания флавоноидов и активности ПФО у растений гречихи сорта Башкирская красностебельная селекции Башкирского ВНИИ показал схожий характер физиолого-биохимической активности систем растения с сортом Баллада. Однако растения Башкирской красностебельнои выделялись более высоким накоплением флавоноидов при снижении активности полифенолоксидазы в корне ПФО - 3,5 Е/г: флавоноиды - 17,4 мг/г., сорт Баллада в листе ПФО - 5,3 Е/г : флавоноиды - 3 мг/г (рис. 22).
В детерминантных сортах гречихи посевной в фазу всходы распределение активности полифенолоксидазы прослеживается в следующем порядке: корень стебель лист (по убыванию) (рис. 24-29). Исключением является сорт гречихи посевной Дизайн. В позднеспелом сорте самая низкая активность фермента в стеблях растения и составляет 0,8 Е/г (рис. 23).
Таким образом, с увеличением активности полифснолоксидазы, катализирующего образование и окисление хлорогеповой кислоты, которая используется в биосинтезе флавоноидов (Грипевич и др., 1973; Саблипа, 1983) происходит уменьшение образования антоцианов, но, как сказано ранее, увеличение содержания общего количества флавоноидов.
Изучение накопления полифенольных соединений в зависимости от активности фенилалаиинаммиаклиазы
Из литературных источников известно, что любые изменения жизнедеятельности растения зависят от условий углеводного, липидного и белкового метаболизма (Туманов, 1979; Трунова Т. И., 1984; Новицкая и др., 1990; Климов, 2001; Колесниченко, Войников, 2003). Сейчас проводятся исследования взаимовлияния первичных и вторичных метаболитов. Особый интерес представляет фенольный метаболизм растений (Christie et al., 1994; Janas et al., 2000, 2002; Rivero et al., 2001), требующий расширения работы в этом направлении.
В биосинтезе флавоноидов фундаментальное значение имеет реакция катализируемая ферментом фенилаланинаммиаклиазой (ФАЛ), в ходе которой фенилаланин дезаминируется с образованием транс-коричной кислоты. Но работа этого фермента так же связана и с процессом биосинтеза белка, что соответственно ставит вопросы о перераспределении фенилаланина между этими параллельными процессами (Лаанест, Маргна, 1972). Рост и развитие растения имеет свои признаки и характеристики.
Одним из положительных признаков развития растений гречихи является устойчивость к полеганию. Клыковым (2000) была установлена положительная зависимость высоты растения гречихи на устойчивость к полеганию с повышенным содержанием рутина в плодах гречихи посевной. Анализ роста растений гречихи в процессе онтогенеза позволил выявить разную интенсивность ростовых процессов Fagopyrum esculentum Moench. по сортам.
В фазу всходы интенсивным ростом выделялись сорта Башкирская красностебельная, Баллада (индетерминантные) а так же Дружина и Деметра (детерминантные), (рис.31).
В фазу бутонизации интенсивность нарастания вегетативной массы растения выделялся скороспелый сорт Темп, отличающийся максимальным накоплением флавоноидов именно в фазу бутонизации, (рис.32). (приложение 1).
В фазу цветение растения гречихи посевной при общем значительном увеличении вегетативной массы, что характерно для этой культуры, имеют различия, как в высоте растения, так и в массе (рис.). Высота растения гречихи сорта Деметра составила 89 см, сорта Дождик - 82 см. Но эти сорта при приблизительно равной высоте отличаются вегетативной массой растения 20,1/42,8 г соответственно. Позднеспелый сорт гречихи посевной Дизайн выделился максимальной вегетативной массой растения (51,3 г) при среднем уровне высоты растений. Аналогичными параметрами обладали сорта гречихи среднеспелый детерминаитный сорт Диалог и скороспелый сорт Темп.
Растения гречихи посевной в фазу максимального накопления флавоноидов -массовое цветение и начало плодоношения, индетерминантных сортов Молва, Баллада и Башкирская красностебелышя не снижают темп прироста вегетативной массы растения, так же как и позднеспелый сорт Дизайн. В детерминаитных сортах гречихи посевной отмечено снижение роста вегетативной массы (рис.33, 34), но повышение уровня флавоноидов.
Следовательно, периоды онтогенеза определяют количественный сдвиг в росте вегетативной массы растения, накоплении флавоноидов и такое изменение физиолого-биохимических процессов имеет ориентированность на конкретный сорт гречихи посевной.
Рядом авторов установлена прямая корреляционная связь между активностью ФАЛ и интенсивностью накопления флавоноидов (Адамовская, 2007). При изменении условий среды наблюдаются значительные сдвиги в активности ФАЛ, что указывает на то, что ФАЛ может являться основным компонентом контрольного механизма определяющего размеры количественного сдвига в накоплении флавоноидов при перестройках физиолого-биохимических процессов организма при внешних воздействиях на растение (Костина, 2009).
Высокой активностью ФАЛ в вегетативный период онтогенеза отмечен сорт Диалог - 0,56 Е/мг и сорт Дизайн - 0,39 Е/мг. Скороспелый сорт Темп отличается среднем уровнем активности фермента - 0,15 Е/мг, что характерно и для индетерминантного сорта Баллада -0,13 Е/мг.
В генеративный период, при максимальном накоплении флавоноидов активностью ФАЛ отличаются сорта: Дружина - 0,58 Е/мг, Дождик - 0,48 Е/мг, Деметра - 0,57 Е/мг и Дизайн - 0,45 Е/мг.
Позднеспелые сорта гречихи имеют повышенный уровень накопления рутина в фазу массового цветения, тогда как у растений скороспелых сортов процесс накопления рутина наблюдается в период роста вегетативной массы. Следовательно, окислительно-восстановительные процессы в растениях скороспелых и среднеспелых сортов более интенсивно протекают при формировании вегетативных органов в период роста и развития гречихи посевной, а позднеспелые сорта предрасположены к более медленному развитию окислительно-восстановительных реакций, но длительно поддерживающиеся па высоком уровне.
Анализ по органам позволяет выделить сорта с наибольшей активностью фермента (рис. 36 - 39). Определение активности ФАЛ в растениях гречихи посевной показало, что в стеблях растений гречихи посевной её уровень был ниже, чем в других частях растения. Так в стеблях растений гречихи отмечена высокая вариабельность активности фермента, высокая активность установлена в стеблях растений гречихи сорта Дизайн и Баллада (0,03-0,025 Е/мг белка), средняя - Темп, Диалог, Дождик и Молва, низкая активность ФАЛ определена в стеблях растений сортов Уша, Башкирская красиостебельиая и Дикуль (0,001-0,007 Е/мг белка).
Определение активности фенилаланинаммиаклиазы в корнях растений гречихи посевной лежит в пределах от 0,1 до 0,2 Е/мг белка, что указывает на одинаковый уровень интенсивности синтетических процессов, (рис. 37). Однако, активность ФАЛ в корнях растений сорта Темп ниже, что возможно говорит о старении корневой системы растения.
Высокую активность фермента ФАЛ в листьях растений гречихи посевной, как и в корнях, имеет сорт Деметра - 0,2 Е/мг/г белка. В растениях гречихи посевной сорта Дизайн активность фермента равна 0,02 Е/мг белка - это нижний уровень показателя активности фермента ФАЛ.
Таким образом, накопление флавоноидов зависит от перераспределения вторичных метаболитов в онтогенезе с определенным действием на метаболизм растений. И если функция первичных метаболитов в устойчивости растений на сегодняшний день исследована достаточно хорошо, то в отношении фенольных соединений наши данные представляют несомненный интерес для исследователей.
