Содержание к диссертации
Введение
Литературный обзор 8
I. Цитокинины 8
1.1. Распространение и содержание цитокининов в растениях 9
1.2. Биологическая активность 10
1.3. Основы метаболизма 13
1.4. Методы идентификации цитокининов 15
1.5. Амарантовый биотест 18
1.6. Рецепция цитокининов 20
1.7. Гены первичного ответа 24
II. Механизмы внутриклеточной трансдукции сигналов 25
II. 1. Протеинкиназы и протеинфосфотазы 26
II.2. Кальциевая сигнальная система 28
Н.З. G-белки 29
П.4.Фосфолипазы 31
П.5. Комплексный характер сигнальной трансдукции 34
Материалы и методы исследований
1. Реактивы 36
2. Выращивание растений амаранта и получения семян 36
3. Стандартный тест для определения
цитокининовой активности 36
4. Модифицированный экспресс микротест 37
5. Проведение ингибиторного анализа 37
6. Постановка ингибиторно-кинетических опытов 38
7. Сравнения действия цитокинина и света 38
8. Оценка жизнеспособности проростков 39
9. Цитологический анализ с помощью
световой микроскопии 39
10. Ультраструктурный анализ с
помощью электронной микроскопии 40
11. Экстракция и анализ эндогенных цитокининов 41
12. Изучение активности фосфолипазы Д in vivo 42
13. Статистическая обработка данных 43
Результаты и обсуждение
I. Особенности экспериментальной модели 44
1.1. Дозовая зависимость 45
1.2. Кинетика действия 47
1.3. Специфичность 50
1.4. Объем тестируемого образца 51
1.5. Тканевая и клеточная специфичность ответа на цитокинин 53
1.6. Модифицированный биотест и его преимущества 55
II. Модифицированный амарантовый биотест как экспериментальная модель исследования ранних эффектов цитокининов
II. 1. Действие ингибиторов транскрипции и трансляции з
11.2. Определение жизнеспособности клеток после воздействия антибиотиков 60
11.3. Кинетический анализ действия ингибиторов транскрипции и трансляции 61
11.4. Проверка адекватности кинетического анализа 67
11.5. Ультраструктурные исследования 69
III. Влияние различных ингибиторов на эффект цитокининов 75
IIIЛ. Ингибиторы синтеза фосфатидных кислот фосфолипазой Д 77
III .2. Ингибиторы протеинкиназ и (протеин)фосфатаз 84
Ш.З. Антагонисты/ингибиторы кальциевого обмена 89
III.4. Влияние некоторых других соединений! 93
Ш.5. Основные итоги кинетико- ингибиторного анализа 97
IV. Анализ действия мастопарана 98
V. Сопоставление действия цитокинина и света , 100
V.I. Анализ действия 1Д0-фенантролина 102
V.2, Анализ действия 1-бутанола 104
V.3. Анализ действия 3,3\4 -5-тетрахлоросалициланилида (SACU) 104
VI. Выявление активности фосфолипазы и реакции трансфатидилирования in vivo 106
Заключение 110
Выводы 117
Список цитируемой литературы
Введение к работе
Фитогормоны, органические вещества небольшого молекулярного веса, образуются в малых количествах в одних частях растений и действуют на другие части как координаторы и регуляторы роста и развития. Эволюционно гормоны появляются у сложных многоклеточных организмов, в том числе у растений, в качестве специализированных регуляторных молекул для осуществления важнейших физиологических программ. С помощью гормонов происходит координация метаболизма и развития различных клеток, тканей и органов, нередко значительно удаленных друг от друга. У многоклеточных растений, при отсутствии нервной системы, особенно важна биохимическая система регуляции, в которой основная функция принадлежит фитогормонам. Известно 5 основных классов фитогормонов, имеющих сходные функции и широко распространенных не только среди высших, но и низших многоклеточных растений. Это ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизины и этилен. По сравнению с гормонами животных специфичность фитогормонов выражена слабее, а действуют они, как правило, в гораздо более высоких концентрациях. У растений нет специализированных органов (желез), вырабатывающих гормоны. В растительных организмах для включения и выключения морфогенетических и физиологических программ нередко используются одни и те же фитогормоны, но в разных соотношениях.
Деление и растяжение клеток, лежащее в основе всех процессов роста и морфогенеза, находится у растений под контролем ауксинов и цитокининов. Эти же гормоны участвуют в регуляции роста боковых побегов: ауксины из верхушки побега подавляют рост пазушных почек (апикальное доминирование), тогда как цитокинины это доминирование снимают. У черенков и в культуре клеток ауксины вызывают образование корней, в то время как цитокинины способствуют формированию побегов. Ауксины определяют адаптивные изгибы растения в соответствии с направлением света или вектора силы тяжести (фото- и геотропизм).
Цитокинины и гиббереллины способствуют прорастанию семян многих растений и повышают их всхожесть. Цитокинины во многих случаях задерживают старение отдельных органов и растений в целом. Гиббереллины способствуют нормальному росту растения, активируя апикальные и интеркалярные меристемы. Для многих растений гиббереллины являются индукторами или стимуляторами цветения.
Абсцизовая кислота и цитокинины регулируют формирование хлоропластов и транспирацию растений: цитокинины вызывают дифференцировку хлоропластов и открывание устьиц, тогда как абсцизовая кислота подавляет оба процесса. Абсцизовая кислота тормозит рост растений и прорастание семян. Этилен ускоряет созревание плодов, усиливает процессы старения и опадения листьев и плодов. В повышенной концентрации он ингибирует линейный рост осевых органов, вызывает их утолщение и горизонтальную ориентацию.
Теория фитогормонов, разработанная М. X. Чайлахяном еще в 1936-1937 г, послужила основой гормональной концепции цветения растений (в том числе и флоригена), признана во всем мире.
По мере открытия и изучения разных аспектов действия фитогормонов стало очевидно, что все эти процессы связаны с изменением экспрессии определенных генов. В ходе эволюции у клеток выработались приспособления, позволяющие преобразовывать и усиливать приходящие из окружающей среды сигналы химической и физической природы и с помощью генетического аппарата реагировать на них, перестраивая свои обмен веществ и структуру. Настоящая работа была нацелена на изучение механизма действия одного наиболее важных гормонов растений - цитокининов.
