Содержание к диссертации
Введение
1 Индолил-3-уксусная кислота как экологический регулятор: современное состояние проблемы 1 1
1.1 Индолил-3-уксусная кислота в системе межвидовых и внутривидовых взаимодействий 15
1. 1 Химические экорегуляторы. 11
1.1.1 Распространение гетероауксина в природе 15
1.1.2 ИУК в системе взаимодействия ассоциативных микроорганизмов и растений 18
1.1.3 ИУК и злокачественные опухоли 19
1.1.4 Фитогормональное действие гетероауксина 21
1.1.5 Участие ИУК во взаимодействиях биосистем разных уровней организации. 25
1.2 Одноклеточные гидробионты в экологических исследованиях 28
1.2.1 Оценка влияния хемосферы на состояние экосистем 28
1.2.3 Paramecium caudatum для исследования биологической активности химических веществ 33
1.3, Роль воды в функционировании биологических систем 36
1.3.1 Молекулярное строение воды. 36
1.3.2 Участие воды в формировании пространственных структур биосистем 40
1.3.3 Механизм действия низких концентраций биологически активных
веществ 43
2 Материалы и методы исследования 47
2.1 Материалы исследования 47
2.2 Методы исследования. 47
2.2.1 Приготовление чистой воды 47
2.2.2 Приготовление растворов ИУК 48
2.2.3 Определение численности культуры зелёных микроводорослей Scenedesmus quadricauda 48
2.2.4 Определение интенсивности фотосинтеза и дыхания зелёных микроводорослей Scenedesmus quadricauda 49
2.2.5 Определение подвижности Рагаатесшт caudatum в присутствии ИУК 51
2.2.6 Изучение влияния ИУК на активность ацетилхолинэстеразы 52
2.2.7 Исследование фолдинга лизоцима куриного яйца, 54
2.2.8 Измерение светорассеяния водных растворов ИУК 54
2.2.9 Приготовление гидрозолей наночастиц с поверхностями различной полярности 55
2.2.10 Флуоресцентное зондирование гидрозолей наночастиц 56
2.2.11 Определение поверхностного натяжения водных растворов ИУК... 56
2.2.12 Синтез поли-1Ч-винилкапролактама 58
2.2.13 Определение ИУК с помощью водных растворов поли-N- винилкапролактама 59
2.2.14 Определение ИУК с помощью водно-ацетоновых растворов 4-диметиламинохалкона 59
3 Влияние гетероауксина на биологические системы и их модели 61
3.1 Иерархическая схема исследования ИУК как экорегулятора 61
3.2 Влияние ИУК на численность популяции и физиологические свойства микроводорослей Scenedesmus quadricauda 63
3.3 Влияние ИУК на подвижность Paramecium caudatum 71
3.4 Изучение влияния ИУК на свойства биомакромолекул 75
3.4.1 Влияние ИУК на активность ацетилхолинэстеразы 75
3.4.2 Влияние ИУК на фолдинг белка. 79
3.5 Воздействие ИУК на структуру и подвижность приповерхностной воды 86
3.5.1 Молекулярное упругое рассеяние света водными растворами ИУК... 86
3.5.2 Флуоресцентное зондирование поверхности наночастиц как моделей биомолекул и мембран 90
3.5.3 Влияние полярности поверхности наночастиц в гидрозолях на подвижность приповерхностной воды, структурированной ИУК 93
3.5.4 Поверхностные свойства водных растворов ИУК 95
3.5.5 Участие воды, структурированной , ИУК, в процессе лиганд- рецепторного взаимодействия 101
3.6 Подходы к разработке сенсорной системы для определения низких концентраций ИУК 105
3;7 Математическое моделирование влияния химических соединений на
структуру сетки водородных связей воды 109
Выводы 115
Список литературы 117
Приложение 142
- Индолил-3-уксусная кислота в системе межвидовых и внутривидовых взаимодействий
- Материалы исследования
- Иерархическая схема исследования ИУК как экорегулятора
Введение к работе
Актуальность проблемы Экологические взаимодействия (внутривидовые и межвидовые) осуществляются с помощью химических веществ-посредников - экорегуляторов, хемомедиаторов (Шустов, 1994). Химические экорегуляторы действуют в широком диапазоне концентраций и выполняют разнообразные функции. Среди них токсины и противоядия, депрессоры, супрессоры, индукторы, вещества, предупреждающие об опасности, феромоны, криопротекторы, фитогормоны и другие. Многие из них проявляют свою активность в сверхнизких кон-центрациях (10' -10" М). Например, действующая концентрация полового феромона тутового шелкопряда составляет порядка 10"20М (Чиби-сова, 1998), т.е. менее 10 молекул/см3.
Установление молекулярных механизмов указанных взаимодействий позволяет на практике решать экологические проблемы, к которым относится, в частности, оценка устойчивости организмов к внешним воздействиям и направленное конструирование новых экорегуляторов.
Одним из экорегуляторов является индолил-3-уксусная кислота (ИУК), или гетероауксин. ИУК продуцируют высшие растения, грибы, водоросли, бактерии. Она регулирует рост растений, выполняя функцию фитогормона, стимулирует образование цепочек диатомовых водорослей {Skelelonema costatum) в концентрациях порядка 10" -10" М (Mazur, 2001), участвует в симбиотических отношениях между бактериями и растениями. Общепризнанно действие гетероауксина как сигнальной молекулы в высших растениях (Mazur, 2001). ИУК образуется также в животном организме, увеличение, ее содержания в тканях наблюдается при росте раковых опухолей. Для эука-риотических микроорганизмов описано отрицательное действие гетероауксина на рост и размножение инфузорий, присутствие следовых количеств данного соединения (<10"9М) в экстрактах микроводорослей рода
Scenedesmus. Функции ИУК в межвидовых, внутривидовых и межклеточных взаимодействиях разнообразны, но недостаточно изучены. Кроме того, ИУК и ее аналоги активно используются в сельском хозяйстве в качестве стимуляторов роста растений и пестицидов. Это способствует увеличению антропогенной нагрузки данных соединений на экосистемы.
Большой интерес представляет установление механизма биологического действия ИУК на молекулярном уровне. Многочисленные исследования фитогормональной активности гетероауксина не позволяют окончательно определить характер этого действия: является ли оно рецепторным, мембра-нотропным или имеет более сложную природу. Не определена причина немонотонной зависимости биоотклика от концентрации ИУК.
С другой стороны, хорошо известно, что различные виды внешних воздействий оказывают влияние на живые системы посредством воды и водных сред. Установлено, что некоторые физиологически активные вещества - высокоэффективные лиганды разных рецепторов - в микро-, наномолярных и более низких концентрациях изменяют подвижность и структуру воды у поверхности субклеточных структур и их моделей. Это позволяет предположить, что в эффектах ИУК на биосистемы различных уровней организации важная роль принадлежит воде, связанной на поверхности белков и мембран.
Для моделирования действия ИУК на популяцию, организм, клетку можно использовать одноклеточные гидробионты — микроводоросли и инфузории, которые сочетают в себе свойства организма и клетки. Их жизнедеятельность во многом определяется состоянием водной среды и известны методики экстраполяции результатов, полученных с их помощью, на многоклеточные организмы. Изучение влияния ИУК на гидратное окружение субклеточных и макромолекулярных структур целесообразно проводить на макромолекулах, не обладающих сродством к гетероауксину, и на экспериментальных моделях с гидратной оболочкой, имитирующей поверхность клетки.
Таким образом, изучение концентрационных эффектов гетероауксина -активного участника экологических взаимодействий - на биосистемы разных
уровней организации представляет весьма важную и актуальную проблему экологии и биохимии.
Вышеизложенное позволило определить цель и задачи исследований.
Цель и задачи исследования Целью работы явилось выявление концентрационных эффектов индолил-3-уксусной кислоты на биосистемы популя-ционного, организменного, клеточного, субклеточного и молекулярного уровней организации.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Изучить влияние ИУК на численность популяции микроводорослей Scenedesmus quadricauda.
Определить воздействие гетероауксина на экологические показатели одноклеточных гидробионтов:
а) фотосинтетическую активность, дыхание зелёных микроводорос
лей Scenedesmus quadricauda.
б) подвижность инфузорий Paramecium caudatum.
Определить характер действия ИУК на активность фермента ацетилхо-линэстеразы и на фолдинг белка лизоцима.
Исследовать воздействие ИУК на подвижность и структуру приповерхностной воды с помощью экспериментальных моделей биомембран и белков.
Изучить возможность создания сенсорной системы для определения ИУК в водных средах.
Изучить влияние биологически активных веществ, в частности, ИУК, на состояние сетки водородных связей воды с помощью методов компьютерного моделирования.
Научная новизна Определены концентрационные зависимости эффектов ИУК на биосистемы разных уровней организации. Показано, что она в низких концентрациях влияет на динамику численности популяции микроводорослей Scenedesmus quadricauda. Установлено, что зависимость экологи-
ческих показателей микроорганизмов - интенсивности фотосинтеза и дыхания микроводорослей & quadricauda, а также подвижности простейших Paramecium caudatum от концентрации ИУК имеет немонотонный характер. Обнаружено уменьшение активности ацетилхолинэстеразы и увеличение скорости фолдинга белка в присутствии низких концентраций гетероауксина. Экспериментально и методами компьютерного моделирования показано, что в основе перечисленных эффектов ИУК лежит её способность вызывать изменения в структуре сетки водородных связей приповерхностной воды.
Научно-практическая значимость работы Большое значение полученные результаты могут иметь для понимания механизма биологического действия ИУК на молекулярном уровне и её роли в экологических взаимодействиях. Обнаружено изменение формы клеток Scenedesmus quadricauda под влиянием гетероауксина, что свидетельствует об отрицательном воздействии ИУК и ее аналогов на водные экосистемы. Показана возможность создания сенсорной системы для определения низких концентраций (до 10~! М) ИУК в водных средах. Ее действие основано на способности ИУК изменять структуру сетки водородных связей приповерхностной воды. Предложено применять математические модели, описывающие обнаруженные эффекты, для направленного конструирования структурно-функциональных аналогов ИУК с целью их использования в качестве экорегуляторов. Полученные результаты использованы в ме-тодических рекомендациях «Фолдинг белка и изучение влияния на него ве-ществ, снижающих диффузионную подвижность воды» (СГУ, 2005г.), а также применяются в курсе лекций "Молекулярная биология" и в практикуме по молекулярной биологии на биологическом факультете Саратовского государственного университета.
Работа выполнена на кафедре биохимии и биофизики биологического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г.Чернышевского.
Апробация работы Основные результаты и положения работы представлены на конференциях: первой и второй Российской школе-конференции
"Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине" (Саратов, 2002, 2004), студенческих научных конференциях биологического факультета Саратовского государственного университета "Студенческие исследования в биологии" (Саратов, 2003, 2004), втором Всероссийском симпозиуме "Тест-методы химического анализа" (Саратов, 2004), международных конференциях "Saratov Fall Meeting'04" и "Saratov Fall Meeting'05" (Саратов, 2004, 2005), конференции студентов и аспирантов биологического факультета Саратовского государственного университета "Студенческие и аспирантские исследования в биологии" (Саратов, 2005).
Публикации По теме диссертации опубликовано 12 работ.
Личный вклад автора Диссертантом выполнен весь объем экспериментальных работ, проведены расчеты, обработка и анализ результатов, сформулированы положения, выносимые на защиту и выводы, В совместных работах доля участия автора составила 50 - 80 %.
Структура и объём работы Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов и приложения. Работа изложена на 146 страницах, иллюстрирована: 36 рисунками, содержит 3 таблицы, 2 схемы и список литературы, включающий 241 источник, из которых 106 на иностранных языках.
Положения, выносимые на защиту
Экологические показатели одноклеточных гидробионтов - численность популяции, интенсивность фотосинтеза и дыхания микроводорослей Scenedesmus quadricauda и подвижность простейших Paramecium caudatum - немонотонно зависят от концентрации ИУК в водных средах.
Активность фермента ацетилхолинэстеразы и характерное время фол-динга белка лизоцима уменьшаются под действием ИУК. Подвижность и структура воды у поверхности систем, моделирующих свойства биомембран и белков, изменяются в присутствии ИУК.
В приповерхностной воде в присутствии ИУК выполняются необходимые условия фазового Я-перехода (порядок-беспорядок).
«
%
4. С помощью растворов поли-Ы-винилкапролактама и 4-диметиламинохалкона определяются низкие концентрации гетероаук-сина в водных средах, что служит основой для создания, сенсорных систем на ИУК.
Индолил-3-уксусная кислота в системе межвидовых и внутривидовых взаимодействий
Гетероауксин - индо ли л-3-уксусная кислота (ИУК) - это химическое соединение широко распространённое в живой природе. Его находят как у эукариотов, так и у прокариотов (Гамбург, 1976). ИУК (C10H9NO2) - белое кристаллическое вещество. На свету быстро темнеет. В водных растворах ИУК легко разрушается под действием света (Иванова, 1999). Хорошо растворяется в спиртах, в серном эфире и этилаце-тате, плохо - в воде. В горячей воде растворимость увеличивается. Калиевая соль ИУК хорошо растворима в воде. ИУК быстро разлагается в кислой среде, в щелочной среде - более стабильна (Безуглова, 2002). Впервые гетероауксин был обнаружен в початках кукурузы А. Хааген-Смитом с сотрудниками (Haagen-Smith, 1946), затем последовали работы, в которых присутствие этого вещества в растениях было доказано самыми различными методами. В кристаллическом виде ИУК впервые была выделена из мочи человека в трёх различных соединениях (Kogl, 1931).
В настоящее время хорошо известно, что ИУК является регулятором роста растений, т.е. фитогормоном. ИУК и родственные ей соединения называют ауксинами. При исследовании различных производных ауксинов были сформулированы общие принципы строения, которым должны удовлетворять молекулы, чтобы иметь гормональную активность. Это наличие ароматического кольца, карбоксильной группы, боковых цепей с четным числом углеродных атомов (Bundurski, 1995; Sitbon, 2000).
Ауксины, в частности ИУК, найдены у всех сосудистых растений, включая мхи, папоротники, хвойные и покрытосемянные растения. Они обнаружены во всех органах растений (семена, эндосперм, семядоли, плоды, концевые меристемы, листья, корни) (Blake, 2002; Kowalczyk, 2003;Yang, 2003). Обычно более высокое содержание их отмечается в молодых органах на стадии меристематического роста. Распределение ауксина в органе также может быть неодинаковым в зависимости от типа дифференциации клеток (Гамбург, 1976; Kojima, 1997; Zelena, 2000). Ауксины обнаружены в зеленых, бурых и красных водорослях, присутствие их в сине-зелёных водорослях пока не исследовано. Имеются доказательства, что ауксин, содержащийся в водорослях, представляет собой ИУК (Таутс, 1971; Mazur, 2001; Zhang, 1993).
Большая часть экстрагируемой из растений ИУК находится в «связанной» форме (Дёрфлинг, 1985; Reinecke, 1995). Свободная форма ИУК образуется при её гидролизе ферментом мирозиназоЙ. Обычно связанные формы ИУК в большом количестве находятся в стареющих органах, в семенах (Koukourikou-Petridou, 2003; Tartoura, 2004). В аномально растущих тканях растений обнаружен высокий уровень свободных ауксинов (Рункова, 1978; Candeias,1994).
Показано, что личинки галлообразующих насекомых (Henderson, 1995, 1996) и нематоды выделяют ауксиноподобные вещества или их предшественников в окружающие растительные ткани (Goverse, 2000; Karczmarek, 2004). ИУК и её производные найдены в тканях животных и в их выделениях (Севастьянов, 1958). Функции гетероауксина в организме млекопитающих остаются неясными.
Установлено, что ИУК синтезируется в растительных, животных и бактериальных клетках из аминокислоты триптофана (Ніс, 1997; Sitbon, 2000). У растений предшественником гетероауксина является L-триптофан, у животных ИУК может образовываться из его энантиомера, что было продемонстрировано при внутрибрюшинном введении крысам D-триптофана (Bundursti, 1995; Sitbon, 2000). Грибы и бактерии также способны синтезировать ИУК из триптофана и других субстратов и накапливать её в питательной среде. Мало известно о содержании ИУК в клетках этих организмов (Гамбург, 1976; Barazani, 1999; Yurekli, 2003).
Материалы исследования
В экспериментах использовали сверхчистую воду, полученную пропусканием дистиллированной воды через систему высокой очистки «Водолей» (фирма «Аквилон», Россия).
В экспериментах использовали индолил-3-уксусную кислоту (ИУК), фирмы Aldrich, чистоты 98 %. Исходный раствор ИУК (1,0 г/л) был получен трехкратным ультразвуковым дезинтегрированием по 30 с при максимальной мощности на ультразвуковом дезинтеграторе «UD-И-automatic» (Германия), остальные растворы с концентрациями 5,7 10"5 - 5,7 10"19 М готовили методом последовательного разведения.
Определение численности микроводорослей проводили по стандартной методике (Владимирова, 1962).
Ход работы. В склянки с притёртыми пробками наливали 100 мл водорослей и добавляли 11 мл водного раствора ИУК, создавая в среде определённую концентрацию вещества (5,7х10"5 - 5,7х 10"19 М). Водоросли инкубировали в течение 24 ч. Половину склянок с водорослями выдерживали в темноте, другую половину на свету. С помощью камеры Горяева определяли плотность культуры перед постановкой и по окончании эксперимента.
Для определения численности клеток водорослей камеру Горяева предварительно накрывали покровным стеклом и притирали его до образования радужных колец интерференции. После чего перемешивали в колбе водоросли и затем пипеткой наносили по одной капле произвольного объёма на верхний и нижний края покровного стекла. После того, как камера Горяева заполнялась водорослевой культурой, её помещали под объектив микроскопа и подсчитывали число клеток в 25 больших квадратах, а затем по формуле определяли количество клеток водорослей в 1 см раствора:
В каждой пробе подсчитывали клетки водорослей в двух камерах с последующим вычислением среднего арифметического (Владимирова, 1962). Оптимальной считалась плотность не менее 10000 клеток тест-культуры на 1 мл.
Определение фотосинтетической активности и дыхания S. quadricauda проводили путём оценки количества растворённого кислорода в среде инкубирования методом Винклера при 24-часовой экспозиции.
Метод Винклера основан на связывании в щелочной среде растворённого в воде кислорода, который выделился в процессе фотосинтеза, с его последующим окислением йодидом калия - в кислой среде (Владимирова, 1962).
Ход.работы. В склянки с притёртыми пробками наливали. 100 мл водорослей и добавляли 11 мл водного раствора ИУК, создавая в среде определённую концентрацию вещества (5,7 10"5 - 5,7х10"19 М). Водоросли инкубировали в течение 24 ч. Половину склянок с водорослями выдерживали в темноте, другую половину на свету. Параллельно в тех же условиях ставили контрольные склянки - без ИУК.
После инкубирования в каждую склянку добавляли последовательно 1 мл NaOH+KJ (33 г NaOH растворяли в 100 мл воды, затем добавляли 20 г KJ) и 1 мл 50% раствора МпСІ2. После этого содержимое склянок тщательно перемешивали. Затем в каждую склянку добавляли по 1 мл H2SO4 (конц.) для растворения образовавшегося осадка. После этого проводили титрование 0,02 н тиосульфатом натрия: 50 мл жидкости из склянки титровали тиосульфатом натрия до появления слабо-жёлтой окраски, после чего добавляли 3-5 капель 0,5% раствора крахмала, и жидкость дотитровывали до полного исчезновения синей окраски.
Иерархическая схема исследования ИУК как экорегулятора
Зелёные протококковые водоросли Scenedesmus quadricauda широко распространены в пресных водоёмах. Поскольку они относительно быстро реагируют на изменение условий окружающей среды, и их культивирование отличается простотой и дешевизной, их используют как тест-объекты для определения уровня воздействия химических веществ на живые организмы.
Известно, что микроводоросли рода Scenedesmus продуцируют ИУК в малых количествах: за семь суток культивирования на свету в условиях аэрации смесью 2 % СОг/воздух 1 клетка выделяет в среду 3.8+0.1 х 10 18 моль (Mazur, 2001). Авторы предположили, что ИУК являлась веществом-посредником между одноклеточными водорослями на определенном этапе эволюции и участвовала в возникновении многоклеточных форм жизни растений (Mazur, 2001). Возможно, ИУК и в настоящее время выполняет функцию медиатора в культуре микроводорослей. Однако механизм действия ге-тероауксина в этих клетках не изучен.
В связи с этим, большой интерес представляет изучение воздействия ИУК на микроводоросли S. quadricauda, используя их как модель популяции, растительного организма и клетки.
Цикл деления у одноклеточных водорослей длится несколько часов, поэтому по динамике общей численности клеток удобно определять уровень действия на них химического соединения (Галактионов СТ. и Юрин В.М., 1980; Omar Н.Н., 2002)..
Нами изучалось воздействие ИУК на рост микроводорослей S.quadricauda. Исследования проводили по методике, описанной в подразделе 2.2.1. Данная методика используется в биотестировании водных сред.
На рис. 9 представлено изменение индекса численности S. quadricauda в зависимости от концентрации ИУК (5,7x10"5 - 5,7x10" М) на свету и в темноте. Индекс численности определялся как отношение количества клеток в среде, содержащей ИУК, к количеству клеток в среде без ИУК. За 100% принята численность клеток в среде без ИУК. Из рис. 9 видно, что число клеток водорослей на свету волнообразно изменяется в зависимости от концентрации ИУК. Нами обнаружено снижение численности клеток, хотя не вполне достоверное, под действием вещества в концентрации 5,7х10"5 М. Подобный эффект был описан для водорослей Caulerpa: ИУК в концентрации выше 10 5 М ингибировала их рост. Кроме того, нами выявлено ингибирующее действие гетероауксина на рост культуры в низких концентрациях: 5,7х10"13 М, 5,7 10 17 М, 5,7 10 19М, то есть обнаружен эффект малых доз гетероауксина на популяцию микроводорослей.
В темноте количество микроводорослей в растворах ИУК по сравнению с контролем не меняется. Исключение составляет 5,7х 10"7 М раствор гетероауксина, в котором происходит значительное увеличение количества клеток. Таким образом, в темноте ИУК в концентрациях, стимулирующих рост высших растений и водорослей (10 -10" М) оказывает аналогичное действие на микроводоросли. Известно, что насыщение СОг культуральной среды микроводорослей рода Scenedesmus приводит к увеличению продукции ИУК этими клетками (Mazur, 2001), что подтверждает энергозатратный механизм биосинтеза ИУК. Вероятно, активность ИУК также в большей степени проявляется в клетках с запасом внутренней энергии, что характерно, для растительной клетки в темное время суток, когда превалирует процесс дыхания.
Рисунок 10 - Изменения формы клеток микроводорослей S. quadricauda и их содержимого под влиянием разных концентраций ИУК. Фотографии получены при помощи цифровой камеры-окуляра для микроскопа SCOPETEK, модель DCM 35
