Введение к работе
Актуальность темы дпссертапип. Практическое решение проблем вельского хозяйства не может быть эффективным без решения фун-іаментальньїх задач физиологии растений. В настоящее время разработка этих задач неразрывно связана с расширением сельскохозяйственного освоения трудных в климатическом отношении территорий, z выращиванием растений в условиях широкомасштабного и многопланового обострения экологической ситуации, комбинированного воздействия неблагоприятных факторов. Потери урожая от неблагоприятных природно-климатических условий достигают 30-70% (Шевелуха, 1991). В связи с этим требуются углубленные исследования механизмов адаптации растений к повреждающим воздействиям, изучение их устойчивости при экстремальных или чрезвычайных условиях существования.
В современной адаптологии наибольшее вниманйё"уделяется проблеме стресса. Стресс является одним из научных понятий, который стал символом уходящего века. Учение о стрессе явилось мощным стимулом развития современной биологии. Несомненно, оно будет определять одно из основных направлений развития человеческой мысли века грядущего. Концепция стресса достаточно стара. Однако интерес к этой проблеме продолжает нарастать. Об этом свидетельствует огромное количество публикаций, настоятельно требующих объединения и осмысления. Кроме того, в последние годы получен важный фактический материал, требующий корректировки и развития некоторых ранее сделанных выводов. Для физиологии растений проблема стресса (неспецифического адаптационного синдрома) имеет особую актуальность, так как фитострессология находится еще в стадии становления. Понятие стресса здесь используют неоправданно широко и часто весьма вольно (Веселовский и др., 1993). Не решены многие ее фундаментальные аспекты. Только познав глубинные механизмы неспецифического адаптационного синдрома растений, молено рассчитывать на разумную помощь человека растению при неблагоприятных условиях существования, на плодотворный поиск способов увеличения их устойчивости.
Исследование адаптационного синдрома представляет существенное значение и для теоретической биологии, так как содерисит данные для анализа одного из наиболее важных свойств живого -раздражимости (реактивности), т. е. способности реагировать на изменения внешней и вігутренией среды. Адаптационный синдром
представляет собой реакцию клетки на действие различных раздр^ жителей (Браун, Моженок, 1987).
Постоянный интерес к изучению реактивности растений об; словлен следующими причинами. Во-первых, растения находятся постоянно изменяющихся условиях произрастания (температуры, ос вещения, влажности и др.). Во-вторых, растения агрофитоценозо подвергаются влиянию различных минеральных и органических в< ществ. В последние годы в практику растениеводства введено болі шое число новых ксенобиотиков направленного действия. Исследс вание ответной реакции растений, неспецифических и специфиче ских характеристик ответа, его зависимости от видовых особеннс стей и физиологического состояния объекта важно для обеспечени наиболее эффективного и безопасного их использования. Наконеи изучение ответной реакции растений на различные раздражители не обходимо для познания общих закономерностей реактивности живої системы. При узкой специализации современной биологии потреб ность в понимании общих законов ощущается особенно остро. Сле дует подчеркнуть, что проблема раздражимости, многие годы почт забытая фитофизиологами, в настоящее время возрождается в связи интенсификацией исследований регуляции биосистем, поскольку ре активность является результатом интегральной деятельности все: систем регуляции.
Связь работы с крупными научными программами, темами. Ра бота выполнялась при поддержке Международного научного фонда области точных наук (индивидуальный грант, 1994 г.) и образовани по программе «Соросовские доценты» (1997 г.). Исследования про водились по следующим темам: 1. Исследование взаимоотношени энергетического и ионного обмена растительной клетки с выявленн ем вклада мембранных каналов в этот процесс (1986-1990 гг.; про грамма «Фундаментальные "научно-исследовательские работы»; уі верждена Отделением биохимии, биофизики и химии физиологиче ски активных соединений АН СССР; № 01.87.0009071). 2. Выясне ние механизмов регуляции образования углеводов, белков и липидо в фотосинтезирующих тканях растений. Поиск, выделение и изуче ние механизма действия эндогенных регуляторов - пептидов и липи дов (1987-1990 гг.; шифр: 2.28.6.2; утверждена Отделением биохк мии, биофизики и химии физиологически активных соединений А1 СССР; № 01.87.0 009070). 3. Клеточная стенка: биосинтез и функ циональная роль ее компонентов (1991-1995 гг.; утверждена РАН, Js 01.9.30 004740). 4. Исследование физиолого-биохимических осно
з интродукции и акклиматизации растений с внедрением интродуцен-тов в народное хозяйство Татарстана (1996-1998 гг.; шифр: Ботсад-11; утверждена Госкомвузом РФ; № 01.9.60 002005). Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - раскрытие механизмов стрессовой реакции растений и увеличения их устойчивости в ходе адаптации к неблагоприятным воздействиям. Главное внимание было сосредоточено на анализе неспецифических и специфических характеристик стресса.
Исходя из указанной цели, были поставлены следующие основные задачи:
изучить функциональное состояние плазмалеммы и энергетического аппарата растительных клеток (определяющих в значительной степени их общее физиологическое состояние), а также клеточной стенки на различных этапах стрессовой реакции;
выявить изменения метаболизма в условиях стресса;
изучить особенности роста и морфогенеза растений при различных воздействиях и стрессовых условиях существования;
исследовать влияние адаптогенных соединений на течение стрессовой реакции клеток растений;
провести диагностику устойчивости некоторых сортов пшеницы различных экотипов к чрезвычайным условиям существования (энергетическому и субстратному голоданию), характеризующей их резервные возможности; "
представить основные положения современной теории стресса в связи с общими законами реактивности клеток.
Объект и предмет исследования. В зависимости от конкретной задачи работы, объектами изучения были целые растения (проростки пшеницы и гороха) и упрощенные системы или модели (отсеченные корни проростков пшеницы, отсеченные листья алоэ, культура изолированных зародышей гороха). Основной объект изучения - отсеченные корни 4-7 дневных проростков пшеницы. Методология и методы проведенного исследования. Изучение проблемы стресса у растений включало как экспериментальные, так и теоретические разработки. Интенсивность дыхания определяли в аппарате Варбурга (Семихатова, Чулановская, 1965). Люминесценцию флавопротеидов и пиридиннуклеотидов измеряли методом люминесцентной спектроскопии (Карнаухов, 1978). Содержание калия в корнях оценивали методом озоления (Ермаков и др., 1972). К+ в среде определяли на пламенном фотометре. Измерение мембранного потенциала осуществляли стандартным микроэлектродным методом
(Пахомова и др., 1991). Определение тепловыделения проводили н микрокалориметре (Жолкевич, 1968), содержания глюкозы - мєтодоа Бертрана (Ермаков и др., 1972). Продолжительность жизни пророст ков и отсеченных корней оценивали по функциональному состоянии корневых клеток, которое определяли микроэлектродным методом I по окрашиванию тканей тетразолом (Третьяков и др., 1982). Гибелі клеток оценивали микроскопически. Эксперименты по ассимиляцш 14С02 проводили по методике Вознесенского с соавт. (1965). Клеточ ные стенки экстрагировали и фракционировали по методу Nishitani Masuda (1982). Для полуколичественного определения кетоновьп тел в растительных тканях предложено использование метода, осно ванного на применении диагностических полосок КЕТОФАИ («Lachema», Чехия). Изменение рН среды не влияет на их окраску Количественное определение ацетона в листьях проводили предва рителыюй перегонкой и титрованием по методу, описанному Дроздовым и Матеранской (1970). Содержание хлорофилла определялі спсктрофотометрическим методом, оводненность и содержание сухо го вещества - весовым методом. Объем корней измеряли объемоме ром Сабинина - Колосова (Гродзинский, Гродзинский, 1973). Куль туру изолированных зародышей и проростков гороха выращивали пс методу Здруйковской-Рихтер (1974) и Калинина с соавт. (1980), про ростки пшеницы - в водной культуре (Алексеева и др., 1984), проро стки гороха в нестерильных условиях - в водной культуре (Пахомов; и др., 1996) и на влажной фильтровальной бумаге (Пахомова, Рудне ва, 1988).
Научная новизна и значимость полученных результатов. Прове денная работа явилась одной из первых попыток построения обще! теории стресса. Выдвинуто положение о том, что продукты катабо лизма в условиях стресса могут являться стресс-лимитирующимі факторами клеток растений.
Предложена простая и удобная модель для изучения общих за кономерностей неспецифического адаптационного синдрома - отсе ченные корни растений. На примере этой модели установлены об щие закономерности функционирования биосистем в условиях голо дания.
Предлагается считать голодание одним из биологических стрес совых факторов растений. Полученные в работе данные проливаю свет на недостаточно изученную физиологию голодания растений Впервые показана специфическая особенность хронического голода ния гетеротрофных растительных клеток - метаболизация компонен
тов клеточной стенки как возможных резервных источников эндогенного питания. Проведена диагностика устойчивости некоторых сортов пшеницы к энергетическому и субстратному голоданию. Впервые показано явление кетоза как специфической особенности стрессового состояния растительных тканей в условиях голодания при пониженной температуре среды. Предложена его экспресс- диагностика в растительных тканях.
При использовании отсеченных корней в качестве модели исследования стрессовой реакции растительных клеток получены данные, проясняющие сущность ее механизмов. Установлено, что репарационные процессы клеток отсеченных корней (восстановление мембранного потенциала, ионного гомеостаза и поглотительной функции) в ходе неспецифического адаптационного синдрома зависят от энергетического состояния клеток, а явления суперкомпенсации (гиперполяризация мембран и развитие поглотительной способности) - от синтеза белка. Явления суперкомпенсации рассматриваются как структурно-функциональный «след» многочасовой адаптации отсеченных корней. Высказано предположение о том, что эти явления связаны с синтезом короткоживущего белка(ов), регулирующего электрогенез клеток. Впервые получены данные, свидетельствующие о том, что при многочасовой инкубации отсеченных корней происходит изменение состояния электрогенного. К+/Н+-обмена - от электрического сопряжения (3-4 ч) до химического сопряжения, (5-6 ч). Выдвинута гипотеза, согласно которой режим функционирования транспортной Н^-АТФазы может зависеть не только от содержания К+ во внешней среде, но и от исходного физиологического состояния клеток корней. Показано изменение режима функционирования ми-тохондриального аппарата в клетках корней (in vivo) в этих условиях. Рассматривается один из механизмов сдерживания окисления глюкозы в условиях голодания, связанный с изменением метаболического состояния митохондрий. Впервые выдвинуто предположение о переходе митохондрий в стрессовое состояние в клетках растений при неспецифическом адаптационном синдроме. Установлено, что изменения барьерной функции плазмалеммы, режима функционирования ее НҐ-насосов и митохондрий, а также степени энергизации клеток обусловливают изменение физиологического состояния и реактивности клеток корней. В зависимости от физиологического состояния корней дыхательные яды могут действовать как ингибиторы или активаторы функциональной активности клеток (или не влиять на нее). Получены данные, свидетельствующие о снижении эффекта Пастера на началь-
б ном этапе неспецифического адаптационного синдрома клеток ко, ней.
Обосновано положение о том, что изменения, наблюдающие( на начальном этапе обратимой альтерации клеток растений (в а стоянии физиологической депрессии) имеют в значительной СТЄПЄІ: защитно-приспособительное значение.
Впервые показана возможность экзогенной регуляции неспещ фического адаптационного синдрома клеток отсеченных корней помощью дибазола - соединения, относящегося к классу адаптогено
Зарегистрировано изменение морфогенеза проростков горо> (ветвление побега) в стрессовых условиях (в культуре in vitro). Уст; новлено, что это явление обусловлено влиянием термостабильног биологически активного фактора(ов) предположительно пептидно природы, выделяемого в среду культивирования и выступающего качестве специфического регулятора роста и развития. Практическая значимость полученных результатов. Показан возможность использования мембранного потенциала для диагност* ки разных состояний растительных клеток. Функциональное соек» ние растений необходимо учитывать при применении различны соединений в научно-исследовательской работе (в частности, инп биторов различных процессов) и в растениеводстве (минеральны удобрений, фунгицидов и т.п.). Выдвинутое в работе положение о адаптивном значении увеличения проницаемости мембран на не чалыюм этапе неспецифического адаптационного синдрома клето указывает на необходимость корректного использования в практик сельского хозяйства соединений, оказывающих стабилизирующе действие на мембраны.
Разработана доступная методика диагностики устойчивост различных сортов пшеницы к чрезвычайным условиям существова ния (энергетическому и субстратному голоданию), характеризующе их резервные возможности. Предложена экспресс-диагностика кетоз растительных тканей. Предложено использование гадолиния в каче стве блокатора пассивной протонной проницаемости плазмалеммі клеток при исследовании ее транспортных механизмов.
Полученные на модельной системе данные позволяют рекомен довать испытание в полевых условиях дибазола как соединения, бла гоприятно влияющего на течение неспецифического адаптационноп синдрома растений и увеличивающего их адаптивную устойчивость і действию неблагоприятных факторов.
В практику научно-исследовательской работы предложена простая и удобная модель исследования стрессового состояния растений - отсеченные корни. Эту модель можно рекомендовать и для исследования разных режимов функционирования внутриклеточных систем, их переходных состояний и поиска эндогенных регуляторов этих систем. Не исключено, что использование изолированных корней может быть полезным в решении и прогнозировании некоторых вопросов медицины, связанных с проблемой голодания. Полученные данные о фазных изменениях физиологического состояния отсеченных корней необходимо учитывать при работе с изолированными органами и тканями, являющимися популярными объектами биологических исследований.
Полученные в работе данные о неспецифической ответной реакции ростовой функции растений на различные раздражители и ее сезонной зависимости необходимо учитывать при проведении работ по скринингу биологических регуляторов во избежание некорректных выводов.
Описанные результаты рекомендуется использовать в научных учреждениях АН и АСХН России и Беларуси. Основные положения общей теории стресса, представленные в диссертации, могут быть использованы в ВУЗах для лекционных курсов по стрессологии биосистем.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
І.При отсечении корней наблюдается типичная стрессовая реакция. Отсеченные корни могут служить удобной моделью исследования общих закономерностей функционирования клеток в условиях стресса. Специфической особенностью стрессовой реакции гетеротрофных растительных тканей в условиях голодания является ме-таболизация компонентов клеточной стенки как резервных источников эндогенного питания.
2. Состояние физиологической депрессии клеток корней в условиях стресса имеет защитно-адаптивное значение. В этой фазе неспецифического адаптационного синдрома в ходе катаболизма происходит образование полифункциональных соединений, обладающих стресс-лимитирующим действием и регулирующих анаболические процессы клеток в стадии резистентности.
З.В ходе неспецифического адаптационного синдрома отсеченных корней происходят изменения барьерной функции плазмалеммы, режима функционирования ее І-Ґ-насосов и митохондрий, а также
степени энергизации клеток, обусловливающие изменение реак тивности, устойчивости и физиологического состояния клеток I целом. 4. Любой стресс наряду с неспецифическими изменениями характе ризуется определенными особенностями (в частности, измененное морфогенеза растений в культуре in vitro и явлением кетоза в условиях голодания растительных тканей при пониженной температуре). Личный вклад соискателя. Измерение люминесценции флавопро-теидов и пиридиннуклеотидов проводили в лаборатории микроспек-тралыюго анализа Института биофизики РАН (г. Пущино-на-Оке) совместно с с.н.с. К.Б. Асланиди; измерения мембранного потенциала - н.с. Института биологии КНЦ РАН (КИБ КНЦ РАН) А.Н. Ценце-вицким, тепловыделения - совместно с асе. кафедры физиологии растений КГУ Д.В. Пахомовым. Исследование ростовой функции и морфогенеза проростков гороха проводилось в группе регуляции раннего онтогенеза растений КИБ КНЦ РАН (с участием Рудневой С.Э., Гошох А.А., Стариковой Н.А.), руководимой соискателем. В работе также принимали участие студенты КГУ и КГСХА (Кротова Ю.В., Кольцова Н.В., Лосева Н.В.), выполняющие в разные годы дипломные работы под руководством соискателя. Остальные исследования проверены самостоятельно. В обсуждении результатов принимали участие Л.Н. Воробьев], Л.Х. Гордон, И.А. Чернов, Ф.Д. Самуилов. Всем вышеперечисленным коллегам соискатель выражает глубокую признательность.
Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации были представлены на ежегодных отчетных конференциях Института биологии КНЦ РАН (Казань, 1982-1994 гг.), Всесоюзных конференциях молодых ученых (Казань, 1983, 1988; Пушино, 1984; Москва, 1990), итоговой научной конференции Казанского филиала АН СССР (Казань, 1984), республиканской научно-производственной конференции молодых ученых (Казань, 1984), Всесоюзных Саби-нинских семинарах (Москва, 1984-1987), Казанском отделении Всесоюзного биохимического общества (Казань, 1986), Всесоюзных школах-семинарах (Звенигород, 1984-1986), 2 Съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990), 3 Съезде Всероссийского общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993), ежегодных отчетных конференциях Казанского государственного университета (Казань, 1995-1997), Международном рабочем совещании по дыханию растений (Сыктывкар, 1995), симпозиуме «Биология
клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 1995), симпозиуме «Биологическое разнообразие. Интродукция растений» (Санкт-Петербург, 1995), ежегодных симпозиумах «Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология» (Москва, 1996-1997), республиканской научной конференции «Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан» (Казань, 1997), Юбилейной конференции Казанской государственной сельскохозяйственной академии (КГСХА), посвященной 75-летию (Казань, 1997), ежегодной отчетной конференции КГСХА (Казань, 1998).
Оггублпкованность результатов. По материалам диссертации опубликовано 46 работ (24 статьи в научных журналах, 9 статей в сборниках, 13 тезисов докладов и выступлений на конференциях), 3 работы находятся в печати. Опубликованные материалы занимают 288 стр. печатного текста.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 211 страницах текста и состоит из общей характеристики работы, 5 глав и заключения. В работе представлено 19 таблиц, 33 рисунка и 4 фотографии, занимающих 53 страницы текста. Количество использованных источников - 544.
