Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Липиды в растительных организмах (обзор литературы) 16
1.1. Общие сведения о липидах 16
1.1.1. Липиды и их место в живых клетках 16
1.1.2. Растительные липиды 18
1.1.3. Липиды в составе мембран 32
1.2. Изменение состава липидов растений при воздействии различных абиотических факторов 40
1.2.1. Липиды как показатель экологического состояния 40
1.2.2. Классификация экологических факторов 41
1.2.3. Экологические факторы, влияющие на метаболизм липидов 44
1.2.4. Изменение липидов в процессе развития растений 45
1.2.5. Влияние света на состав липидов 49
1.2.6. Влияние температуры на состав липидов 53
1.2.7. Влияние водного дефицита на состав липидов 61
1.2.8. Влияние атмосферных компонентов на состав липидов 62
1.2.9. Влияние засоления на состав липидов 66
1.3. Влияние ионов тяжелых металлов на растения 67
1.3.1. Современное понятие «тяжелых» металлов в биологии 67
1.3.2. Механизмы токсичности тяжелых металлов 71
1.3.3. Влияние ионов тяжелых металлов на липиды и их метаболизм 76
1.3.4. Экологические аспекты влияния тяжелых металлов на растения 83
Глава 2. Материалы и методы исследования 91
2.1. Растительные объекты 91
2.2. Места отбора растительного материала 95
2.3. Постановка экспериментов 97
2.3.1. Лабораторные эксперименты 97
2.3.2. Натурные эксперименты 99
2.4. Выделение и анализ липидов 102
2.4.1.Общие липиды и их разделение 102
2.5. Идентификация липидов 104
2.6. Количественные методы анализа липидов 107
2.7. Определение содержания тяжелых металлов в растениях 108
2.8. Определение барьерных свойств мембран 109
2.9. Статистическая обработка материала 109
Глава 3. Вариабельность липидного состава растений различных таксономических групп 110
3.1. Липиды представителей отдела Rhodophyta 111
3.2. Липиды представителей отдела Phaeophyta 114
3.3. Липиды представителей отделов Chlorophyta и Charophyta 117
3.4. Липиды представителей отдела Lycopodiophyta 131
3.5. Липиды представителей отдела Equisetophyta 145
3.6. Липиды представителей отдела Polypodiophyta 147
3.6.1. Липиды некоторых видов отдела Polypodiophyta, обитающих в условиях умеренного климата 148
3.6.2. Состав полярных липидов некоторых видов отдела Polypodiophyta в зависимости от стадии роста 154
3.6.3. Липиды некоторых видов отдела Polypodiophyta, обитающих в условиях тропического климата 159
3.6.4. Состав липидов у разных органов Salvinia natans 165
3.7. Липиды представителей отдела Pinophyta 171
3.8. Липиды представителей отдела Magnoliphyta 171
3.9. Сравнительный анализ состава липидов растений разных такономических групп 181
Глава 4. Вариабельность липидного состава растений в разных экологических условиях 189
4.1. Состав липидов растений водоемов и водотоков 189
4.1.1. Водные растения, их экологическая классификация 189
4.1.2. Липиды растений «урбанизированных» озер 198
4.1.3. Липиды растений эстуария реки Волги 205
4.1.4. Липиды растений Средней Волги 207
4.1.5. Липиды растений «заповедных» озер 215
4.1.6 Липиды растений ручьев 227
4.1.7. Липиды растений болот 231
4.1.8. Сравнительный анализ состава липидов водных растений 234
4.2. Состав липидов наземных растений 241
4.2.1. Сезонная динамика полярных липидов в листьях папоротников Dryopteris filix-mas и Matteuccia struthipteris 241
4.2.2. Сезонная динамика фосфо- и бетаиновых липидов у Pteridium aquilinum 256
Глава 5. Влияние абиотических факторов на состав липидов в экспериментальных условиях 265
5.1 Влияние ионов тяжелых металлов на физиолого-биохимическое состояние Potamogeton perfoliatus 265
5.1.1. Характеристика объекта исследования 266
5.1.2. Обоснование выбора концентрации тяжелых металлов 267
5.1.3. Обоснование выбранного методического подхода 271
5.1.4. Аккумуляция ионов металлов 278
5.1.5. Влияние ионов металлов на физиологическое состояние 282
5.1.6. Влияние ионов металлов на общие липиды 287
5.1.7. Влияние ионов металлов на состав фосфолипидов 293
5.1.8. Влияние ионов металлов на состав гликолипидов 305
5.1.9. Влияние ионов металлов на состав жирных кислот 316
5.1.10. Влияние ионов металлов на липиды листьев разного возраста 319
5.2. Влияние биогенных элементов на состав липидов растений 324
5.2.1. Влияние повышенных концентраций фосфора и азота на липидный состав листьев Potamogeton perfoliatus 324
5.2.2. Влияние недостатка фосфора на липиды папоротника Matteuccia struthiopteris 330
5.3. Влияние ионов тяжелых металлов на физиолого- 344
биохимическое состояние папоротника Matteuccia struthiopteris
5.3.1. Влияние ионов меди и свинца на рост листьев 346
5.3.2. Влияние ионов меди и свинца на общие липиды 348
5.3.3. Влияние ионов меди и свинца на состав полярных 351 липидов
5.3.4. Влияние ионов меди и свинца на состав жирных кислот 356
Выводы 360
Литература 362
Приложения 414
- Влияние ионов тяжелых металлов на липиды и их метаболизм
- Липиды некоторых видов отдела Polypodiophyta, обитающих в условиях умеренного климата
- Сезонная динамика полярных липидов в листьях папоротников Dryopteris filix-mas и Matteuccia struthipteris
- Влияние повышенных концентраций фосфора и азота на липидный состав листьев Potamogeton perfoliatus
Введение к работе
Актуальность проблемы
Липиды - один из четырех главных классов биомолекул, которые наряду с углеводами, белками и нуклеиновыми кислотами, обеспечивают жизнедеятельность клетки любой организации живого: от прокариот до многоклеточных эукариотических организмов. Растительные липиды играют важную роль в росте и воспроизводстве, фотосинтезе, определяют ценность ряда этих организмов как пищевого сырья (Васьковский, 1997; Browse et al., 1998; Harwood, 1998; Wallis et al., 2002). Это группа природных веществ крайне разнообразна по структуре, функциям и составу продуктов, образующихся в процессе их метаболизма (Ohlrogge, Browse, 1995; Антонов, 1996; Jaworski, 1997; Ben-ning, 1998; Joyard et al., 1998; Гринштейн, Кост, 2001; Харакоз, 2001; Dormann, Benning, 2002; Hagio et al., 2002).
Особая роль среди этой группы соединений отводится мембранным ли-пидам. Уже на самых ранних этапах биологической эволюции мембраны и липиды, как главные их структурные составляющие, отделили живую клетку от окружающей среды. Одновременно с изменением геохимических процессов на Земле шла эволюция представителей мира живого и эволюция мембран. Неоспоримость роли липидов в эволюции живых организмов подчеркивается тем фактом, что липидный метаболизм является одним из пяти основных моментов, наряду с метаболизмом аминокислот и синтезом белков, энергетическим и ферментативным метаболизмом, метаболизмом нуклеиновых кислот и метаболизмом Сахаров, используемых для сравнительных эволюционных построений (Margulis, 1996; Воронцов, 2004; Яблоков, Юсуфов, 2004).
С экологической точки зрения представляет интерес участие липидов, как одного из главных компонентов биологических мембран, во взаимодействии со средой обитания. Состав липидов клетки и, в особенности, клеточных мембран, является отражением процессов их синтеза и деградации, а также об-
мена с окружающей средой (Harwood 1994; Kaniuga, 1999; Zielinska et al., 2000; Чиркова, 2002; Тарчевский, 2002; Ветчинникова, 2004).
В последние годы окружающая среда претерпевает значительные изменения (Фелленберг, 1997, Calow, 1998, Заварзин, 2001). На современном этапе техногенное влияние на живые организмы становится сравнимым по своим масштабам и значению с такими важнейшими факторами как температура, свет, вода и др. (Одум, 1986; Розенберг и др., 1999; Коршиков, 1996; Янин, 2003, Левич и др., 2004; Кулагин, 2006). При этом следует учитывать, что загрязнение окружающей среды становится тем внешним фактором, к которому растения эволюционно не приспособлены (Aziz, Larher, 1998; Calow, 1998; Усманов и др., 2001; Духовский и др., 2003). В связи с этим на всех направлениях научной и хозяйственной деятельности нарастает потребность оценить адаптивный потенциал растений. Для того, чтобы изучить адаптационный потенциал организмов разного уровня организации, нужно знать, какова реакция организма на отклонение того или иного фактора от экологического оптимума, какие механизмы способствуют приспособлению к изменяющимся условиям среды (Усманов и др., 2001; Кулагин, 2006).
Адаптация - одно из основных биологических явлений, реализующихся на разных уровнях организации живых систем: от молекулярного до биосферного (Селье, 1960; Хочачка, Сомеро, 1988; Озернюк, 1992; Чиркова, 2002; Платова, 2005). Приспособления к отдельным факторам среды или к комплексу природных условий, проявления их на онтогенетическом и эволюционном уровнях с участием разных механизмов позволяют считать способность к приспособлению одним из наиболее общих свойств живых существ.
Границы, внутри которых возможно приспособление к окружающим условиям, составляют основу глобального процесса взаимодействия организма и среды и являются «экологическим пределом» процессов жизнедеятельности (Озернюк, 1992; Rama Deli, Prasad, 1999; Larsson et al., 2002; Кузнецов, Дмитриева, 2005).
Исследование адаптации на биохимическом уровне предполагает исследование структуры и функции жизненно важных молекул клетки в норме и при различных воздействиях на нее. Изменчивость биохимических параметров в ответ на изменение факторов среды позволяет превентивно регистрировать изменения в обмене веществ, наступающие, как правило, до появления видимых отклонений от нормы. Это дает возможность определять пределы адаптивных возможностей и судить о степени устойчивости и чувствительности организмов (Новицкая, Сурова, 1999; Berglund et al., 2000; Прасад, 2003; Немова, 2005).
Изучение биохимического разнообразия ответных реакций необходимо и для решения задач, связанных с охраной природы, рациональным природопользованием, тестированием и мониторингом природных сред (Сидоров, 1983; Булгаков, 2002; Левич и др., 2004). Особенно актуальны эти вопросы для водных экосистем, поскольку все антропогенные воздействия - затрагивают ли они литосферу, атмосферу, педосферу или урбанизированную среду - так или иначе, выходят на гидросферу через атмосферные осадки, почвенный сток, миграцию подземных вод и другие процессы, связанные с круговоротом воды (Брагинский, 1998; Фелленберг, 1997).
В литературе имеются многочисленные данные о качественном и количественном составе липидов различных видов растений (Eichenberger, 1993; Kates, 1990; Dembitsky, 1996; Kunzler, Eichenberger, 1997; Васьковский, 1998; Хотимченко, 2003). Однако роль этого класса соединений в адаптационных процессах недостаточно ясна. В связи с этим концепция данной работы может быть представлена как выяснение участия липидной составляющей клеточного метаболизма различных систематических групп растений в процессе их взаимодействия с внешней средой, испытывающей влияние различных факторов, в том числе и антропогенного происхождения, а также участие липидов в адаптационных процессах растений разного уровня организации.
10 Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы явилось выявление адаптивной роли различных групп липидов в процессе эволюции, онтогенеза и при кратковременных стрессовых воздействиях на различных представителей царства растений.
В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи:
Изучить и провести сравнительный анализ качественного и количественного состава липидов растений, относящихся к разным таксономическим группам Rhodophyta, Phaeophyta, Chlorophyta, Charophyta, Psiloto-phyta, Lycopodiophyta, Equisetophyta, Polypodiophyta, Pinophyta, Magno-liophyta.
Исследовать липидный состав различных жизненных форм растений в зависимости от условий их обитания (водные и наземные растения).
Оценить сезонную динамику количественного содержания различных групп липидов растений одного вида в различных условиях обитания.
В модельных лабораторных и полевых исследованиях выявить зависимость изменения липидных характеристик от воздействующих факторов среды.
Выявить закономерности в изменении состава липидов растений в длительных (отдельные стадии филогенеза и онтогенеза) и кратковременных (стрессовых) процессах.
Положения, выносимые на защиту:
Качественный и количественный состав липидов растений различных групп является характерным признаком их систематической принадлежности и определяется условиями среды их обитания. Различия в количественном составе исследованных групп липидов растений различных жизненных форм, типов экотопов и в зависимости от сезона вегетации свидетельствует об их адаптивной роли в жизни растений.
Содержание бетаинового липида ДГТС является характерным для определенной группы растений и зависит от экзо- и эндогенных факторов.
Ионы тяжелых металлов аккумулируясь в различных органах, как водных, так и наземных растений, воздействуют на их физиолого-биохимические показатели. Направленность и степень воздействия на растения зависит от природы металла, концентрации, продолжительности действия и проявляется в изменении липидного спектра.
Повышенное содержание азота, как одного из биогенных элементов, не приводит к существенному изменению состава липидов растений. Недостаток биогенного элемента фосфора вызывает количественные изменения в содержании некоторых групп липидов растений.
Научная новизна Впервые определен состав липидов 156 видов растений из отделов Rhodophyta, Phaeophyta, Chlorophyta, Charophyta, Psilotophyta, Lycopodiophyta, Equisetophyta, Polypodiophyta, Pinophyta, Magnoliophyta. Уточнены литературные данные о присутствии бетаиновых липидов в высших растениях. Впервые показано, что вариабельность количественного уровня липидов, в том числе бетаинового липида ДГТС, меняется не только в зависимости от таксономического положения растений, но и от стадии их развития, условий обитания и при воздействии антропогенных факторов. В результате проведенных исследований выявлены основные группы липидов, наиболее устойчивые и наиболее вариабельные к изменениям условий обитания.
Изучено влияние ряда факторов (температуры, содержания таких макроэлементов, как фосфор и азот) на качественный и количественный состав липидов высших растений.
Впервые проведены систематические исследования влияния ионов металлов (Cu+2, Pb+2, Cd+2, Zn+2, А1+3) на физиологическое (рост и развитие) и биохимическое (общие липиды, содержание и качественный состав фосфо- и глико-липидов, жирных кислот) состояния водных (Potamogeton perfoliatus) и наземных растений (Matteuccia struthiopteris). Показаны особенности аккумуляции ионов металлов в зависимости от возраста растения и типа ткани. Выявлен
характер и направленность изменений липиднои компоненты клеток растений при воздействии ионов тяжелых металлов в диапазоне концентраций 1- 1000 мкмоль/л.
Теоретическое значение работы
Сравнительный анализ липидов растений различной систематической принадлежности, стадии их развития, а также вариабельность состава липидов в разных условиях обитания позволяет расширить наши представления о закономерностях процессов жизнедеятельности. Результаты проведенных исследований позволяют не только выявить закономерности адаптивной роли липидов различных таксономических групп растений в зависимости от воздействующих факторов внешней среды, но и применить полученные данные в качестве дополнительного критерия в хемотаксономии растений и в биогеохимических исследованиях.
Практическая значимость работы
Выявленные устойчивые и изменчивые компоненты липидного спектра позволяют использовать их в качестве дополнительных критериев при разработке системы оценки уровня устойчивости и адаптивного потенциала растений в условиях антропогенного загрязнения окружающей среды, а также оценки состояния водных экосистем.
Реализация результатов исследования
Результаты исследований используются при чтении спецкурсов в Волжском университете им. В.Н. Татищева (г. Тольятти), ГОУ ВПО «Самарский государственный университет».
Связь темы диссертации с плановыми исследованиями
Работа выполнена в период 1989 - 2006 гг. в лабораториях: химии природных соединений (1989-1993 годы), экологической биохимии (1993-2006 годы) Института экологии Волжского бассейна РАН. Исследования проводились в рамках следующих НИР: «Разработать количественные методы биоиндикации факторов загрязнения экосистем» (1989 - 1995 гг.); «Провести поиск и разра-
ботать биохимические методики оценки воздействия антропогенных факторов на водоросли, грибы, лишайники» (1989 г.); «Биоиндикация природных и антропогенных процессов в бассейне Средней и Нижней Волги» (1991 - 1995 гг.); «Биохимические аспекты индикации антропогенного воздействия на организмы различных уровней организации» (Программа ОБН РАН «Проблемы общей биологии и экологии; рациональное использование биологических ресурсов», 2001 - 2005 гг.); «Структурно - функциональная организация водных экосистем бассейна Средней и Нижней Волги в условиях комплексного воздействия антропогенных факторов» (Государственная регистрация № 0120.0 412472), выполняемой по заданию Президиума РАН. Кроме того, работа проводилась при финансовой поддержке грантов РФФИ 04-04-96506-р «Механизмы устойчивости растений в условиях антропогенного загрязнения тяжелыми металлами» и РФФИ- 05-04-52027 «Развитие МТБ для проведения исследований по области знаний 04 в изучении механизмов устойчивости растений в условиях антропогенного загрязнения тяжелыми металлами».
Личный вклад автора
Автором определены цели и задачи, подготовлена программа исследований, осуществлено планирование экспериментов и выбор методов, организация полевых и лабораторных исследований. Сбор материалов и подготовка проб к анализу осуществлялся при непосредственном участии автора. Автором лично выполнена обработка и обобщение результатов.
Апробация работы
Основные результаты работы были представлены и докладывались на 5-ой Международной конференции по химии и биотехнологии биологически активных природных продуктов (Варна, Болгария, 1989); 15-ом Международном конгрессе по биохимии (Иерусалим, Израиль, 1991); на П-ой научно-практической конференции «Экологические и социально-практические проблемы региона Самарской Луки» (Тольятти, 1997); IV съезде общества физиологов растений (Москва, 1999); 20-ом Симпозиуме по липидам Северных стран
(1999, Дания); 14-ом Международном симпозиуме по липидам растений (Кардифф, Великобритания, 2000); Всероссийской конференции по водным растениям «Гидроботаника 2000» (Борок, 2000); IV республиканской конференции «Актуальные экологические проблемы республики Татарстан» (Казань, 2000); Международном симпозиуме «Сигнальные системы в растительной клетке» (Москва, 2001); XI Международном симпозиуме по биоиндикаторам «Современные проблемы биоиндикации и биомониторинга» (Сыктывкар, республика Коми, 2001); II съезде биохимического общества (Санкт - Петербург, 2002); 3-ем конгрессе Федерации Европейского общества по физиологии растений (Херсонисос, Крит, Греция, 2002); 1-ом Европейском симпозиуме по фундаментальным и прикладным аспектам липидов растений (Аахен, Германия, 2003); Международной конференции «Экологические проблемы бассейнов крупных рек 3» (Тольятти, Россия, 2003); V съезде Общества физиологов растений России (Пенза, 2003); Всероссийской научно-практической конференции «Экологические проблемы загрязнения водных ресурсов Волжского бассейна, современные методы и пути их решения» (Волгоград, 2004); 16- ом Международном симпозиуме по липидам растений (Будапешт, Венгрия, 2004); Международной научной конференции «Татищевские чтения: актуальные проблемы науки и практики» (Тольятти, 2005), Международной конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок, 2005).
Публикации
Общее количество опубликованных работ составляет 70. По теме диссертации опубликовано 36 работ, из них 20 статей в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК, 13 статей в международных журналах, 3 статьи в региональных сборниках.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы, включающего 586 источников, из которых 336 на иностранных языках, 12
приложений. Работа изложена на 413 страницах, содержит 93 таблицы, 77 рисунков.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность всем соавторам: Богдановой Е.С., Гущиной И.А., Козлову В.Г., Мурзаевой СВ., Саксонову СВ., Сидоренко В.М., Ужамецкой Е.А., Филину В.Р., Юниной В.П. за помощь при сборе материала, обсуждении полученных результатов. Особая благодарность - профессору, д.х.н. В.М. Дембицкому, под чьим руководством начиналась эта работа. Неоценимую помощь в отборе растительного материала, проведении анализов липидов оказала Таранова Л.М. Все статьи, опубликованные в зарубежной печати, были подготовлены с помощью Солдатовой Т.К., за что автор искренне ей благодарен. Большую помощь в проведении хроматомасс-спектрометрических анализов оказал Резанка Т. Огромная благодарность д.б.н. Макуриной О.Н. за консультативную помощь при обсуждении полученных результатов, а также Костиной Н.В. за помощь при подготовке материалов диссертации.
Влияние ионов тяжелых металлов на липиды и их метаболизм
Липиды - один из четырех главных классов биомолекул, которые наряду с углеводами, белками и нуклеиновыми кислотами, обеспечивают жизнедеятельность клетки любой организации живого: от прокариот до многоклеточных эукариотических организмов. Известно, что все жизненно важные процессы либо осуществляются белками, либо протекают при обязательном участии белков ферментов, катализирующих и регулирующих химические реакции, протекающие в организме. Но, как отмечал, Е.М. Крепе (1979), «... биохимическая наука показывает, что белки в живых организмах функционируют, как правило, при обязательном участии различных сложных липидов, без которых большинство функций, выполняемых белками, реализоваться не могут». Главными функциями липидов, независимо от того, клетке какого организма или ткани они принадлежат, являются - барьерная, запасная и метаболическая (Sitte, 1977; Бергельсон, 1975; Крепе, 1981; Gurr, Harwood, 1991; Gunston et al., 1994; Иванова и др., 1997). Каждая из функций выполняется разными по химическому составу соединениями. Поэтому этот класс веществ является крайне различным по структуре, функциям и составу продуктов, образующихся в процессе их метаболизма (Mazliak, 1977; Ohlrogge, Browse, 1995; Антонов, 1996; Jaworski, 1997; Benning, 1998; Joyard et al., 1998; Гринштейн, Кост, 2001; Хара-коз, 2001; Dormann, Benning, 2002; Hagio et al., 2002).
В отличие от других главных составляющих клетки (протеинов, углеводов, нуклеиновых кислот) липиды часто определяют как сложные соединения, которые не растворяются в воде, а экстрагируются из клетки неполярными органическими растворителями (Бергельсон, 1975). В литературе можно найти различные классификации липидов. Однако наиболее простым и удобным, на наш взгляд, является разделение липидов на группы в зависимости от их химического строения, которая приведена в работе В.В. Васьковского (1997). По этому признаку различают три группы липидов: простые липиды (I); сложные липиды (II); оксилипины (III). К простым липи-дам относятся соединения, содержащие одну длинную углеводородную цепь с функциональной группой, которая, как правило, является карбоксильной, или группой, утратившей карбоксил. Липиды первой группы построены из нескольких блоков, соединенных между собой связями, расщепляющимися при гидролизе, чаще всего сложноэфирными или амидными. В этих липидах могут быть и простые эфирные связи. Сложные липиды обычно делят на две подгруппы, которые называют нейтральными липидами и полярными липидами. Липиды третьей группы - оксилипины образуются из некоторых полиеновых жирных кислот в результате действия специфических ферментов липоксигеназ. Нейтральные липиды из второй группы могут быть разделены на пять основных классов: 1) триглицериды; 2) воски; 3) стерины и их эфиры; 4) N-ацетилэтаноламиды; 5) церамиды. Среди полярных липидов второй группы обычно называют два важнейших класса: фосфолипиды и гликолипиды.
Кроме вышеназванных существуют другие виды классификации, которые группируют липиды по самым разным химическим признакам, например, сфинголипиды, сульфолипиды, липиды с простой эфирной связью и т.д. Биологическое и практическое значение этих классов существенно различно (Васьковский, 1997). Фосфолипиды и гликолипиды явлются производными трехатомного спирта - глицерина (1) и присутствуют во всех живых организмах. В фосфолипидах две гидроксильных группы глицерина (1) (sn-\ и sn-2- положения) связаны с жирными кислотами (Rn), а третья - гидроксиль-ная группа (sn-З - положение) присоединена к фосфорной кислоте.
Фосфат, в свою очередь, соединяется с другими небольшими гидрофильными группами - остатками холина, серина или этаноламина.В результате молекула фосфолипида состоит из двух частей: полярной «головки», часто несущей отрицательный электрический заряд, на долю которой приходится 1/4 всей длины молекулы, и двух гидрофобных «хвостов» (Christie, 1982; Кузнецов, Дмитриева, 2005).
Гликолипиды - это продукты соединения глицерина с углеводами. Как и у фосфолипида, молекула гликолипида содержит два длинных гидрофобных хвоста и полярную головку, содержащую один или несколько остатков Сахаров и не содержащую фосфата.
Если не связывать название липидов с присутствием остатков сахаридов, фосфора или других гетероатомов, то полярные липиды называют ацилглице-ролипидами, то есть производными глицерина и жирных кислот. Этот тип липидов является наиболее общим для большинства клеток (Kinney, 1993; Miquel, Browse, 1994).
Несмотря на достаточно большое сходство химического строения липид-ных молекул, из которых состоят мембраны клеток разных представителей живого, растительные липиды имеют ряд отличительных особенностей.
Вегетативные клетки растений содержат приблизительно 5 - 10% мае. липидов от сухого веса (Гудвин, Мерсер, 1986). По данным Ohlrogge и Browse (1995) каждая четверть сантиметра в листе растения может содержать только 0,2 мг липидов, это количество может насчитывать -400 см2 мембран, подтверждая тот факт, что липиды мембран содержат в слое только 2 молекулы толщиной 5-8 нм. Если бы клетка мезофила листа была увеличена в 1 миллион раз, то толщина мембраны была бы менее 1 см.
В отличие от других организмов защитную функцию растений выполняют такие соединения как воски, кутины, суберины - липиды, которые входят в покровные ткани растений и необходимы для предотвращения потери влаги и защиты от патогенных микроорганизмов или вредных веществ. Наружная поверхность клеточных стенок эпидермальных клеток покрыта гидрофобной кутикулой, которая состоит из кутана и воска. Кутин - основной полимер кутикулы. Он состоит из сложной смеси жирных гидроксикислот, связанных вместе эфирными связями в трехмерную структуру (Гудвин, Мерсер, 1986). Типичная структура восков представлена соединением (2).
Липиды некоторых видов отдела Polypodiophyta, обитающих в условиях умеренного климата
Поверхность, которая отграничивала эту систему от внешней среды, уже можно было считать в некотором роде мембраной. Экспериментально показано (Ивков, Берестовский, 1981), что ФЛ способны спонтанно образовывать в воде замкнутые бислойные мешочки (везикулы или коацерваты), устойчивые в широком диапазоне изменений температуры, кислотности среды и ионной силы, в то время как белки образуют устойчивые агрегаты, как правило, только в том случае, если они денатурированы. При определенном соотношении заряженных и незаряженных молекул липиды могут существовать в виде одиночного стабильного бислоя, способного сорбировать на поверхности различные белки. Хорошая проницаемость бислоя для воды, аминокислот и некоторых других малых молекул и малая проницаемость для больших молекул и многих ионов должны были увеличить вероятность синтеза биополимеров и привести к возрастанию концентрации макромолекул внутри таких везикул. При этом в ограниченном объеме может долгое время существовать целый ансамбль различных биополимеров, причем макромолекулы могут находиться в нативной форме, частично сорбируясь на мембране, частично оставаясь в растворе. Простота строения липидных молекул позволяет предположить, что бислойные липид-ные мицеллы существовали задолго до появления значительно более сложных по строению полипептидов и полинуклеотидов (Бурлакова, 1981; Ивков, Бере-стовский, 1981; Воронцов, 2004).
В процессе эволюции усложнялась организация живого: от одноклеточных - к многоклеточным организмам, от бактерий - к низшим растениям, от низших растений - к высшим (Яблоков, Юсуфов, 2004). Одновременно с этим происходило формирование, отбор и специализация структурных единиц биологических мембран в различных организмах. Этот процесс можно назвать процессом эволюционной адаптации. Результатом такой адаптации стало разнообразие живого мира. Так, в животных и дрожжах ФЛ (такие, как ФХ, ФЭ и ФГ) являются главными мембранными липидами (Harwood, 1980; Ивков, Бере-стовский, 1981). У растений около 75 % общих мембранных липидов листьев составляют ГЛ (МГДГ и ДГДГ) и количественно превосходят ФЛ (Bishop, 1984; Slabas, 1997; Joyard et al., 1993, 1998a, 1998b). Причем, достаточно убедительной и доказательной теории для объяснения факта количественного преобладания ГЛ над ФЛ в высших растениях до сих пор не существует. Например, по мнению немецких исследователей Dormann и Benning (2002) синтез ФЛ во многих организмах (в том числе и в растениях) является фосфат зависи 38 мым процессом: при ограниченном содержании фосфора в питательной среде или почве уровень ФЛ в клетках растений снижается, а нефосфорных липидов (например, ГЛ) - увеличивается. В связи с этим они высказывают мнение, что смещение биосинтеза липидов в сторону увеличения количества ГЛ в зеленых тканях сделало в свое время растения менее зависимыми от питательного фосфата, чем другие эукариоты, содержащие преимущественно ФЛ мембраны. Однако, представители английской школы биохимии, например, J. Harwood (1998), считают, что для объяснения этого факта в настоящее время не существует достаточного теоретического обоснования. Для морских организмов действительно фосфатный анион является малодоступным, но для наземных организмов эти аргументы, по мнению этого автора, не являются убедительными.
В настоящее время этот вопрос остается открытым и интенсивно изучается. Если окажется, что действительно содержанием фосфора как питательного макроэлемента можно контролировать синтез липидов, то результатом этого может оказаться возможность получения растений с заданным составом липидов, необходимых для целевого использования (Dormann, Benning, 2002). В этой связи решение многих глубоких теоретических вопросов часто оказывается важным в практическом смысле.
Можно привести еще один пример нерешенного вопроса с точки зрения эволюционной целесообразности липидов. Речь идет о сравнительно недавно открытой группе бетаиновых липидов (БЛ). Один из наиболее часто встречаемых липидов этой группы - ДГТС был обнаружен впервые в одноклеточной морской водоросли Ochromonas danica (Chrysophyceae) (Brown, Elowson, 1974). Установлено, что эти липиды синтезируются некоторыми бактериями (Benning et al., 1995, Geiger et al., 1999), грибами (Dembitsky, 1996; Kunzler, Eichenberger, 1997; Vaskovsky et al., 1991,1998), водорослями (Eichenberger, 1993; Khotim-chenko et al., 1990; Xu, Eichenberger, 1999; Jones, Harwood, 1992; Haigh et al., 1996) и лишайниками (Dembitsky, 1992). Что касается высших растений, то Б Л найдены в мохообразных (Бычек, 1994, Dembitsky, Rezanka, 1995; Kunzler, Ei 39 chenberger, 1997) и папоротникообразных растениях (Sato, 1992; Sato, Furuya, 1983; 1984). При этом даже в пределах одного филогенетически достаточно близкого таксона, например, такого как род, обнаружены виды, как содержащие ДГТС так и не содержащие его (Rozentsvet et al., 2000).
Отсутствие БЛ у высших цветковых растений, по-видимому, связано с тем, что синтез этой группы липидов был утрачен в процессе эволюции. Какие причины привели к этому результату, пока неясно. Интерес к этой группе липидов связан с тем, что молекула ДГТС (13) имеет общий структурный фрагмент с ФХ (3), а многие организмы, продуцирующие ДГТС, имеют низкий или нулевой уровень ФХ. В связи со структурной аналогией этих липидов существует предположение об их взаимозаменяемости в структуре мембран и об эволюционной значимости замены синтеза ДГТС на синтез ФХ (Geiger et al., 1999). Однако экспериментальных результатов для подтверждения или опровержения вышеупомянутой гипотезы пока еще недостаточно. Предстоит выяснить, действительно ли все или большинство семенных растений в процессе эволюции утеряли присущую их предкам способность к синтезу ДГТС. Возможно, этот липид все же образуется у некоторых семенных растений в количестве, достаточном для того, чтобы его можно было обнаружить современными методами, но не во всех органах, и не на всех этапах жизненного цикла растения. В конечном счете, необходимо выяснить физиологическую роль ДГТС и других БЛ, и какие причины приводят или уже привели к прекращению его синтеза.
Сезонная динамика полярных липидов в листьях папоротников Dryopteris filix-mas и Matteuccia struthipteris
В ходе развития и трансформации клеток могут происходить существенные изменения и в скорости обмена и в составе мембранных липидов. При этом относительное содержание липидов в мембране и вязкость углеводородной части бислоя зависят от функциональной активности этих мембран. В растущих и делящихся клетках, как правило, мембраны более «жидкие» и содержат больше липидов (Tevini, 1977; Biswal et al., 1982).
В процессе развития растений в синтезе липидов принимает участие целая группа ферментов, которые действуют не одновременно. Например, количественный состав жирных кислот, образованных в начальный период развития растений, не соответствует составу ЖК на более поздних стадиях онтогенеза. Продукты, входящие в состав внешней кутикулы, синтезируются на начальных стадиях до образования фотосинтетических мембран. При удлинении стебля и появлении первых листьев синтез большей части липидов растения концентрируется на формировании ГЛ и полиненасыщенных ЖК - главных компонентов мембран хлоропласта (Gurr, Harwood, 1991). В табл. 1.5 сведены данные многих исследователей, касающиеся основных стадий развития растения и процессов синтеза липидов, им соответствующие (Thomson, Zalik, 1973; Wellburn A., Well-burn F., 1973; Tevini, 1977; Harwood, 1980; Gurr, Harwood, 1991).
На первой стадии семена содержат зародыши растений и запас необходимых питательных веществ (Гэлстон и др., 1983). Первоначально при прорастании эти запасы мобилизуются для выхода ацетил - коэнзима А и глицерол-3- фосфата - предшественников формирования липидов. Затем происходит развитие хлоропластов, в которых начинается синтез ЖК для сложных липидов. В зрелых листьях состав липидов становится постоянным, но липидный обмен происходит с высокой скоростью (Tevini, 1977). В тканях листьев около 70% общего белка и 80% общих липидов присутствуют в хлоропластах (Hampp, Schmidt, 1976). Поэтому, любые изменения в мембранах хлоропласта будут отражаться эквивалентными изменениями в общих липидах листьев.
При цветении и образовании плодов происходят большие изменения в липидном обмене. Во время образования семян происходит появление многих новых ферментов, включаемых в синтез липидов. Старение же листьев сопровождается очень быстрыми потерями хлоропластных липидов. При этом ГЛ быстро деацилируются, а освобожденная линоленовая кислота становится предметом атаки окислительных фементов, таких как липоксигеназа (Тарчев-ский, 1993; Гречкин, Тарчевский, 1999). Повреждение хлоропласта также приводит к окислению фотосинтетических пигментов, сопровождаемое постепенным пожелтением листьев. При старении ухудшается состояния мембран, увеличивается их проницаемость, что приводит к увеличению оттока веществ из листьев. Увеличение проницаемости мембран вызывает переход вещества из одного компартмента в другой, что способствует разрушению веществ и усиливает старение. Например, при выделении из вакуолей кислот клеточного сока происходит превращение хлорофилла в феофитин, в результате лист желтеет.
Конечная форма растения определяется и генетической программой, заложенной в оплодотворенной яйцеклетке, и действием внешних факторов, способных влиять на реализацию этой программы. Генотип задает пределы изменчивости растения, а от среды же зависит, каким будет в конечном счете (в этих пределах изменчивости) реализуемый тип развития (Гэлстон и др., 1983;Албертсидр., 1986).
Свет является необходимым фактором для роста и для синтеза специфических липидов. Собственно сам фотосинтез растений есть ни что иное, как преобразование и запасание солнечной энергии (Tevini, 1977; Климов, 1996).
Способность растений адаптироваться к различной интенсивности света была обнаружена при изучении фотосинтеза при разных световых условиях (свет - темнота). При этом были обнаружены, наряду с изменениями в фотосинтезе, изменения в архитектуре хлоропластов (Boardman, 1977; Anderson, 1986).
С точки зрения метаболизма липидов в растениях свет является участником биосинтеза хлоропластных липидов (Anderson, 1986; Tevini, 1977). Развитие тилакоидных мембран является обязательным для формирования фото-синтетически полноценного хлоропласта. Мембраны тилакоидов являются местом транспорта электронов и входят в состав фотосинтетического аппарата ФС I и ФС И. Поскольку тилакоидные мембраны большей частью состоят из ГЛ (МГДГ и ДГДГ), то именно эти липиды определяют физико-химические свойства тилакоидных мембран (Murphy, 1986) и являются незаменимыми для биогенезиса, архитектуры тилакоидных мембран и фотосинтетической активности (Joardan et al., 2001; Yamaryo et. al., 2003). Замечено, что содержания ГЛ, ФГ и линоленовой кислоты, главной кислоты МГДГ, значительно увеличивается при световой экспозиции, хотя эта кислота может синтезироваться и в темноте (Tevini, 1977). На свету происходит синтез пигментов, в частности каротиноидов. Скорости различных реакций синтеза липидов, например, реакций с участием жирнокислотной синтазы, также увеличиваются при световой экспозиции (Ohlrogge, Jaworski, 1997).
Таким образом, для процесса фотосинтеза и биогенезиса липидов зеленые растения нуждаются в солнечном свете. Однако электромагнитное излучение Солнца, кроме лучей видимого спектра (380 - 770 нм), содержит ультрафиолетовые лучи (УФ - лучи), составляющие около 7 % общей солнечной радиации, достигающей поверхности Земли. По физиологическому воздействию на живые организмы ультрафиолетовую часть спектра делят в зависимости от длины волны на три части: область А (400 - 320 нм), область В (320 - 280 нм) и С (280 - 180 нм).
Влияние повышенных концентраций фосфора и азота на липидный состав листьев Potamogeton perfoliatus
Показано, что в бактерии Anacystis nidulans при изменении температуры среды кроме изменения ненасыщенности ЖК может происходить изменение длины их углеводородной цепи (Quoc, Dubacq, 1997). Что касается высших растений, то, например, в листьях люцерны, выращенной при температуре 15, 20 и 30С, наблюдались изменения содержания ГЛ и ФЛ. При этом концентрация ФГ, ФИ, СХДГ уменьшалась, а МГДГ, ФХ и ФЭ возрастала с понижением температуры роста. Содержание кислоты 18:3 в МГДГ повышалась, а кислот 16:0 и 18:2 понижалось. В ФХ состав жирных кислот не менялся (Kuiper, 1970). В липидах листьев и хлоропластов райграса, выращенного при 15С, содержалось меньше кислот 16:0 и 18:2 и больше 18:3 жирных кислот, чем в липидах листьев и хлоропластов этого же вида растений, выращенных при 30С (Hofaecker-Klett, Beringer, 1975). Количество ли-ноленовой кислоты было больше в МГДГ и ДГДГ в листьях райграса, выращенного при температуре 15С, чем при 30С.
Новицкой с сотрудниками (1999, 2000) было проведено исследование липидов культурных растений в условиях понижения температуры роста. Ими показано, что снижение температуры роста до 6С в растениях огурца вызывало снижение содержания глико- и сульфолипидов, а среди фосфолипидов -ФГ, которое коррелировало с полным прекращением фотосинтеза и последующей гибелью растений. У томатов, как более холодостойких растений, выращенных в тех же самых условиях, уменьшение содержания хлоропласт-ных липидов было незначительным. В отличие от огурцов у томатов при этой же температуре сохранялась высокая интенсивность фотосинтеза. Из полученных результатов авторы делают вывод о том, что при понижении температуры важное значение имеет как увеличение ненасыщенности жирных кислот, так и сохранение высокого уровня липидов мембран хлоропластов (Новицкая и др., 1999,2000). Изменение в составе липидов в ответ на низкотемпературный стресс было исследовано в целом ряде работ по криозакаливанию древесных, травянистых и культурных растений. Так, увеличение содержания липидов в процессе естественного закаливания к морозу древесных растений описано в ряде экспериментальных и обзорных работ (Верещагин, 1958; Дограмаджян и др., 1969; Ермаков, 1975; Сопин, Гаврилова, 1987; Шаяхметов и др., 1990; Alden, Hermann, 1971;Whitaker et al., 1997; Yu, Willemot, 1997). В процессе закаливания к морозу происходит накопление ФЛ в проростках озимой и яровой пшеницы (Redshaw, Zalik, 1968; De la Roche et al., 1972; De la Roche, Andrews, 1973; Willemot, 1975), ржи (Redshaw, Zalik, 1968), ячменя (Wilson, Crawford, 1974), корнях и целых растениях люцерны (Grenier et al., 1974a, 1974b), коре тополя (Yoshida, Sakai, 1973) и белой акации (Siminovitch et al., 1968, 1975) и узлах кущения озимой пшеницы (Панкова, Хохлова, 1977), в листьях кукурузы после заморозков до - 3С (Винтер, Буренкова, 1969), в наклюнувшихся семенах бобов (Бухольцев, 1969) после закаливания при температуре 6С. При общем увеличении количества ФЛ при низкотемпературном закаливании наиболее сильно увеличивается концентрация ФХ, которому отводят важную роль в процессе закаливания к морозу (Родионов и др., 1973; Yoshida, Sakai, 1973; Grenier, Willemot, 1974a, 1974b; Uemura, Steponkus, 1997).
Все перечисленные выше растения относятся к группе хорошо закаливающихся холодостойких растений. В листьях же слабозакаливающихся теплолюбивых растений, таких как хлопчатник и фасоль, концентрация ФЛ в процессе закаливания снижается, за исключением ФК и ФИ, содержание которых увеличивается (Wilson, Crawford, 1974). Как отмечают Родионов и соавторы (1973, 1977), возможно, что в листьях этих растений уже при закаливающей температуре (12С) происходит расщепление ФЛ, о чем обычно свидетельствует накопление ФК.
В отношении ГЛ многими авторами отмечается, что при закаливании происходит снижение их количества, как например, в листьях хлопчатника и фасоли (Wilson, Crawford, 1974) или существенно не меняется как у ячменя (Wilson, Crawford, 1974) и картофеля (Родионов и др., 1973). Концентрация триглицеридов в процессе закаливания может возрастать, как показано на корнях люцерны (Grenier, Willemot, 1974а).
Что касается ненасыщенных ЖК, то увеличение их количества в процессе закаливания к холоду наблюдалось в суммарных липидах корней люцерны (Gerloff el al., 1966; Grenier, Willemot 1974a, 1974b) и проростках озимой и яровой пшеницы (Redshaw, Zalik, 1968; De la Roche et al., 1972, 1973). Увеличивалась ненасыщенность ЖК в ФЛ листьев хлопчатника, фасоли и ячменя, а также в проростках риса (Wilson, Crawford, 1974). Количество ненасыщенных кислот увеличивается в основном за счет увеличения процентного содержания кислоты 18:2 при снижении содержания кислот 16:0, 16:1, 18:0 (Суворова, 1999). Общее количество индивидуальных жирных кислот, особенно линоле-новой, возрастало в процессе закаливания озимой пшеницы (Willemot, 1975).
Одной из теорий, объясняющих гибель теплолюбивых растений тропического и субтропического происхождения при низких положительных температурах от 12 до 0С, была предложена автором (Lyons, 1973). Согласно этой теории причиной повреждения мембран теплолюбивых растений является переход липидов мембран из жидкокристаллического состояния в твердый гель. При этом фазовый переход в липидах приводит к сжатию молекул липидов и увеличению размера пор в мембранах, что вызывает увеличение, как проницаемости мембран для ионов, так и энергии активации мембранных ферментов. Поскольку скорость реакций, катализируемых мембранными ферментами, снижается после фазового перехода быстрее, чем скорость реакции, катализируемых растворимыми ферментами, то нарушается баланс в метаболизме. В результате этого накапливаются токсические вещества (ацетальдегид, этанол и др.), которые при длительном воздействии отравляют растения. Кроме того, увеличение энергии активации мембранных ферментов при переходе липидов из жидкокристаллического состояния в твердый гель приводит к недостатку АТФ, прекращению движения протоплазмы, что способствует повреждению и гибели растений. При краткосрочных воздействиях низких температур возможен возврат к нормальному метаболизму, так как фазовые переходы в липидах обратимы, а нарушения в метаболизме не столь велики.
Исходя из этой теории, главным результатом изменений в составе липи-дов в ответ на изменение температурного режима является поддержание необходимой текучести мембраны. Текучесть мембраны определяется рядом физических и химических свойств и поддерживается следующими факторами: 1) изменением ненасыщенности жирных кислот; 2) увеличением длины цепи жирных кислот; 3) изменением молекулярных видов; 4) изменением соотношения липидных классов; 5) изменением соотношения липид/белок в мембранах. В табл. 1.6 приведены температуры фазового перехода из геля в жидкую фазу для ФХ с различной степенью г/ис-ненасыщенности (Хочачка, Сомеро, 1988). Включение одной г/ис-двойной связи в ацильную цепь понижает точку плавления липида на 50С, а вторая г/ис-двойная связь понижает ее дополнительно на 15С. Интересно, что добавление любых последующих двойных связей или преобразование диеновой кислоты в триеновую, не дает дополнительного преимущества для текучести.
