Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Природа и классификация лектинов
1.1. Распространение, химический состав и классификация лектинов 16
1.2. Углеводная специфичность лектинов и участие Сахаров, связанных с лектинами в синтезе полисахаридов 20
1.3. Применение лектинов в биотехнологии, иммунодиагностике и лечении болезней 26
1.4. Лектины растений и их возможные функции в организме 32
1.5. Приемы и методологические исследования лектинов 43
Глава 2. Объекты и методы исследований
2.1. Объекты исследований 50
2.2. Выделение лектинов 51
2.3 Определение гемагглютинирующей активности 51
2.4. Определение углеводной специфичности 52
2.5 Определение степени угнетения гемагглютинации в присутствии углеводов. 53
2.6 Аффинная хроматография лектинов 54
2.7 Получение иммунных сывороток на лектины 55
2.8 Иммунохимический анализ лектинов методом двойной диффузии55
2.9 Электрофоретические методы фракционирования лектинов в полиакриламидном геле 56
2.10. Определение N-концевых аминокислот динитрофторбензольным методом 56
2.11. Выделение дезоксинуклеопротеинов и гистонов 57
2.12. Биохимическое фракционирование гистонов 58
2.13. Получение иммунных сывороток на ДНП 59
2.14. Истощение сывороток диспергированным ДНП и лектинами 59
2.15. Методы и аппаратура для автоматизированного исследования хлорофилл-белкового комплекса 60
2.16. Выделение хлоропластов из вегетативных органов растений 61
2.17. Твердофазный иммуноферментный анализ лектинов 63
2.18. Выявление гемагглютинирующей активности лектинов методом реплик 65
Глава 3. Содержание, гемагглютинирующая активность и иммунохимическая специфичность лектинов зерновых культур
3.1. Лектины семян пшеницы и эгилопса 66
3.1.1. Содержание лектинов в семенах различных видов эгилопса 67
3.1.2. Содержание лектинов в семенах диплоидных видов пшеницы 69
3.1.3. Содержание лектинов в семенах тетра- и гексаплоидных видов рода Triticum 70
3.1.4. Агглютинирующая активность лектинов пшеницы и эги лопса с разным геномным составом 74
3.1.5. Иммунохимический анализ лектинов доноров геномов пшеницы 76
3.1.6. Гемагглютинирующая активность гистонов клеточного ядра 80
3.1.7. Иммунохимический анализ ДНП и идентификация гистонов 85
3.1.8. Сравнительный анализ гистонов пшеницы и других злаков по иммунохимической специфичности и эритроагглютинирующей активности 86
3.2. Лектины семян трибы просовидных 90
3.2.1. Характеристика эколого-географических групп проса по гемагглютинирующеи активности лектинов и электрофоре-тическим спектрам проламинов 91
3.2.2. Иммунохимический анализ лектинов проса и сорго 99
3.2.3. Сравнительный электрофоретический анализ проламинов проса и сорго 103
3.2.4. Иммунохимический анализ лектинов сорго 106
3.3. Лектины гречихи 110
Глава 4. Лектины клубней картофеля 117
4.1. Количественное содержание лектинов в клубных картофеля 119
4.2. Иммунохимический анализ лектинов различных видов картофеля секции Tuberosum Buk (Petote Dumort) 120
4.3. Геномный анализ S. tuberosum по лектинам 126
4.3.1. Сравнительное иммунохимическое изучение лектинов культурных и дикорастущих диплоидных видов картофеля с геномом А 126
4.3.2. Сравнительный иммунохимический анализ лектинов диплоидных видов картофеля с геномом В 128
4.3.3. Дифференциация геномов полиплоидных видов картофеля по лектинам 130
Глава 5. Молекулярная гетерогенность и активность лектинов в онтогенезе растений 134
5.1. Молекулярная гетерогенность лектинов картофеля 135
5.2. Содержание, активность и полиморфизм лектинов в проростках и листьях зерновых культур 139
5.2.1. Лектины пшеницы в онтогенезе растений 139
5.2.2. Содержание и гемагглютинирующая активность лектинов в вегетативных органах кукурузы 146
5.3. Динамика содержания и гемагглютинирующеи активности лектинов в онтогенезе гречихи 151
5.3.1. Содержание лектинов в вегетативных органах гречихи 152
5.3.2. Гемагглютинирующая активность лектинов листьев гречихи 158
Глава 6. Углеводная специфичность и N-концевые аминокислоты лектинов
6.1. Углеводная специфичность пектинов 160
6.2. Характеристика лектинов по N-концевым аминокислотам 169
6.2.1. Фракционирование и идентификация ДНФ-аминокислот метчиков и ДНФ-лектинов методом тонкослойной хроматографии 169
6.2.2. N-концевые аминокислоты фракций гистонов ядра 174
6.3. Действие гербицидов на N-концевые аминокислоты лектинов пшеницы 176
Глава 7. Структурная организация хлорофилл-белковых комплексов хлоропластов
7.1. Лектины субклеточных структур 180
7.1.1. Лектины хлоропластов 181
7.1.2. Характеристика ХБК кукурузы и картофеля по содержанию лектинов, нуклеиновых кислот и оптическим свойствам 187
7.2. Характеристика хлоропластов кукурузы по электрокинетическим свойствам 199
Глава 8. Физиологическая роль лектинов в защитных реакциях растений 204
8.1. Лектин-углеводное взаимодействие во взаимоотношениях растения-хозяина и патогена 205
8.1.1. Лектины и биологические свойства семян 208
8.1.2. Исследование состояния ХБК при заражении бурой ржавчиной методом РГА и лазерно-оптической фотометрии 212
8.2. Значение лектинов в защитной реакции растений пшеницы к пыльной головне 215
8.3. Действие фунгицидов и биопрепаратов на содержание и ГА лектинов 218
8.4. Влияние активного ила на гемагглютинирующую активность лектинов 224
8.5. Гумат натрия как активатор повышения содержания и гемаг-глютинирующей активности лектинов 226
8.6. Связь устойчивости растений к абиотическим и биотическим факторам с активностью лектинов 229
8.6.1. Гемагглютинирующая активность лектинов в клубнях после раневого стресса 230
8.6.2. Лектины хлорофилл-белковых комплексов пшеницы и сорных растений при применении гербицидов 231
8.7. Влияние минерального питания на лектины растений 249
Глава 9. Лектины лекарственных растений 258
Заключение 279
Выводы 290
Список литературы 295
- Углеводная специфичность лектинов и участие Сахаров, связанных с лектинами в синтезе полисахаридов
- Содержание лектинов в семенах тетра- и гексаплоидных видов рода Triticum
- Лектины пшеницы в онтогенезе растений
- Влияние минерального питания на лектины растений
Углеводная специфичность лектинов и участие Сахаров, связанных с лектинами в синтезе полисахаридов
В связи с тем, что лектины обладают свойствами обратимо и избирательно связывать углеводы (Марков, 1983) характеристика углеводной специфичности определяет ценность их как инструментов исследования.
На сродство пектинов к углеводам обратили внимание исследователи, которые обнаружили, что моносахариды подавляют гемагглютинирующую активность пектинов (Rice et, al., 1974; Tsuda, 1979). При этом углеводы выступают в качестве гаптенов и блокируют активные центры пектина. На основе принципа блокирования активности антител гаптеном изучена специфичность взаимодействия с углеводами многих пектинов, как чистых, так и в экстрактах из растений (Луцик, Панасюк 1981, Антонюк и др., 1983; Kegge, Riioliger, 1997).
Специфичность взаимодействия пектинов с углеводом зависит главным образом от положения гидроксилов при третьем и четвёртом атомах углерода и D-формы или L-формы пиранозного цикла углевода. Исходя из этого все углеводы были разделены на 4 группы (Peumans et al., 1982; Quatrano et. al., 1983).
I 3,4 - ОН цис, a - форма, (a - фукоза, a - галактоза)
II 3,4 - ОН цис, D - форма (D - галактоза )
III 3,4 - ОН транс, D - форма (D - глюкоза, D - манноза )
IV 3,4 - ОН транс, a - форма (D- глюкоза)
Для однозначной интерпретации результатов исследования гликопротеинов животных тканей первостепенный интерес представляют лектины, специфичные к следующим углеводам: D - маннозе, D - галактозе, N - ацетил - D - галактозамину, N - ацетил - D - глюкозамину, a - фукозе, сиаловой кислоте (Favero et, al., 1991; Flemming, 1991). В силу этого, связывание лектинов специфично, но специфичность эта ограничена. Именно эта ограниченная специфичность делает лектины столь ценным орудием исследования Так, конканавалин А не только способен выполнять свою природную функцию, но может вызывать агглютинацию столь разнообразных объектов, как эритроциты, опухолевые клетки, гликоген. Объединяет эти объекты одно - присутствие остатков глюкозы или маннозы (Ghyka et al., 1991; Кравцов и др., 1989; Frotschl et al., 1989; Troganis et al., 1989).
Установлено, что существуют лектины, которые диффундируют 2-ацетамидо-2-дезоксисахара от соответствующих им нейтральных гексоз (Limenez-Barbera, 1997). В соответствии с этим во II и III группы были введены подгруппы 2- ацетоамидо -2-дезокси-сахара . Дальнейшим уточнением углеводной специфичности лектина является дифференцирование а и Р аномерных форм углеводов. Например, КонА, лектины гороха обладают специфичностью к а - глюкозидам. Лектины, специфичные к эритроцитам человека группы А, связываются с а - N- ацетогалактозаминными остатками, лектины анти-В специфичны к остаткам а -галактозы (Roberts, Loro, 1981; Varani et. al., 1983; Jrimura, Nicolson, 1983). Взаимодействие лектинов с олиго-и полисахаридами более сложно по сравнению с моносахаридами, оно точнее моделирует связывание лектинов с природными углеводсодержащими макромолекулами. Это в первую очередь относится к лектинам, у которых более высокое сродство к ди - и трисахаридам. Активный центр этих лектинов комплементарен к нескольким углеводным остаткам, связанным в определенную структуру (Луцик, 1981).
Лектин-углеводные взаимодействия, на фоне перечисленного, малоизвестны неспециалистам при всей грандиозности того значения, которое они имеют в биологии . По формулировке доктора Яна Коцурека, одного из лидеров современной лектинологии, лектины - это белки, не относящиеся к классу иммунных (иммунные белки - иммуноглобулины - антитела), способные к обратимому связыванию с углеводной частью гликоконьюгатов без нарушения ковалентной структуры любых из узнаваемых гликозильных лигандов (Игнатов, 1997).
Ещё на заре современного учения о ферментах была широко распостранена идея соотношения субстрата (вещества, на которое действует фермент) со структурой фермента по принципу соответствия «ключа к замку» . Высочайшая специфичность углеводов рецепторной зоны клеток или молекулярной структуры к ферменту или лектину, то есть комплементарность, лежит в основе многих важных биологических эффектов. Лектины и ферменты, вернее их доменные центры, выступают в качестве чувствительнейших биосенсоров, детектирующих определённые углеводные последовательности в олигосахаридах, которые являются специфическими лигандами в углевод-белковом взаимодействии (Schaal et al., 1984).
Таким образом, лектины, с одной стороны, входя в структуру тканей животных, растений, микроорганизмов, принимают участие как в регулировании их метаболизма, так и в защите от некоторых агентов внешней среды. С другой стороны, лектины, будучи выделенными из живых объектов, могут стать ценными биохимическими реагентами, использование которых получит своё развитие в экспериментальной цитохимии, диагностике некоторых заболеваний и, наконец, в биотехнологических процессах выделения некоторых сложных углеводсодержащих веществ (Игнатов и др., 1995; Игнатов, 1997, Степаненко, 1978; Павлова 1989;). К настоящему времени достаточно тщательно изучены только два лектина: агглютинин сои и лектин Phaseolus vulgaris. Структура олигосахаридного компонента соевого агглютинина показана на схеме: D -Mann - D - маннопираноза, D- GLc NaAc - D - N - ацетилглюкозамин, Asp - аспарагин.
Типичным представителем запасных гликопротеинов служит вицилин, один из двух главных запасных белков бобовых растений. В качестве примера гликопротеиновых ферментов можно назвать бромелаин из стеблей ананаса и пероксидазу хрена(Гудвин, Мерсер, 1986).
Все растительные гликопротеины, изученные до настоящего времени, имеют одну общую структурную особенность: их олигосахаридный компонент состоит из ряда остатков D - маннопиранозы, часто связанных вместе гликозидными (а - 1—»2) связями и присоединенных (р 1—И) - связью к двум остаткам (3 - D - N - ацетилглюкозамина (Ziska et al., 1993). Один из этих остатков в свою очередь соединен гликозидной связью с атомом амидного азота остатка аспарагина белковой части гликопротеина: (D-Mann)n -D-Mann((31 -+4)D-GlcNAc((31 - 4)D-GlcNAc(p 1 -амидньшІчГ) Asp
Путь биосинтеза полисахаридов заключается в следующем: гликозильные остатки, переносятся последовательно от молекул -доноров этих остатков к молекуле - рецептору или затравке . В данном случае роль доноров гликозильных остатков выполняют полипренилфосфат-сахара, а затравкой служит полипренилфосфат (Гудвин, Мерер, 1986;Подгорский, Коваленко, 1989; Луцик, Кусень, 1989).
Исследованием очищенных аффинной хроматографией лектинов семян четырех сортов Vicia faba L. было выявлено, что сорта, слабовосприимчивые к симбиозу с клубеньковыми бактериями, различаются по углеводной специфичности. Показано также, что сортовые особенности кормовых бобов могут зависеть от их лектинового фонда (Косенко, 1999).
С помощью лектинов с разной углеводной специфичностью, меченных пероксидазой, изотиоцианатом родамина и коллоидным золотом, проведено гистохимическое изучение гликопротеинов клеточных мембран (Миляева и др., 1999). Обнаружены определенные различия и сходство в гистохимических реакциях Rudbeckia и Perilla с различными лектинами.
С помощью аффинной хроматографии проведена очистка лектина из семян Erythrina americana (Ortega et al., 1990). Показано, что мономерная форма лектина, который является гликопротеином, имеет мол. м 30000. Углеводная часть лектина была представлена Ы-ацетил-О-глюкозамином, маннозой, фукозой и ксилозой в молярном отношении 4:3:1:1.
Гемагглютинирующая активность лектина отражала видовую специфичность, не подавлялась при обработке 0,1 М ЭДТА и ингибировалась галактозой, лактозой и лактозамин-содержащими олигосахаридами или гликозилпептидами.
В лаборатории Сато (Sato et al., 1991) методами ELISA и аффинной хроматографии изучали специфичность к углеводам нового лектина из семян Tetracarpidium conophorum. Установлено, что наиболее эффективно этот лектин связывает олигосахариды с концевыми N-ацетиллактозаминными звеньями (Gaipi-4 GlcNAc), хуже - фрагменты с Gal (3 1-3 GlcNAc или замещенными NeuAc или Fuc остатками Gal или GlcNAc. Разветвленные (полиантенные) олигосахариды активнее взаимодействуют с лектином, чем более простые структуры. Высшее сродство к лектину проявляют триантенные комплексные цепи, причем важное значение имеет ветвь... GlcNAc р 1-4 Man а 1-3...Исследуемый лектин входит в большую группу известных Gal-специфичных лектинов (DSA, PHA, LLA) и может использоваться для разделения и идентификации углеводных цепей гликопротеинов.
Содержание лектинов в семенах тетра- и гексаплоидных видов рода Triticum
Уровень содержания лектина в покоящихся зерновках диплоидных видов рода Triticum представлен в таблице 3.1.1. Как видно из таблицы, различные образцы вида Т .urartu существенно различаются по содержанию АЗП на одно зерно. Так, наибольшее количество лектина обнаружено у образца И-363363 (770 нг/зерно). Наименьшее количество лектина зарегистрировано у образца И-33871 (100 нг/зерно). Анализ содержания АЗП в образцах вида Т. monococcum также выявил гетерогенность по этому показателю у разных представителей этого вида от (260 до 670 нг/зерно) и, как видно из таблицы, менее значительную в сравнении с T.urartu. Исследование диплоидного вида T.boeoticum показало, что наибольшее содержание лектина обнаруживается в образце к-40118 (234 нг/зерно), а в трех других исследованных образцах количество лектина было почти втрое ниже .
В целом же можно сказать, что виды T.urartu и T.monococcum характеризуются значительно большим уровнем АЗП в семенах по сравнению с T.boeoticum. Поскольку масса одного зерна у различных образцов пшеницы, особенно видов T.monococcum и T.boeoticum, различается, колебания в содержании лектина на грамм одного зерна несколько сужаются, хотя и остаются по-прежнему существенными. Так, например, у Т. boeoticum образцы к-27161 и к-40118 различаются по содержанию АЗП на 1 зерно более чем в 3 раза, а с учетом массы одного зерна меньше, чем в 2 раза, также и в образцах к-39471 и к-240063 Т. monococcum. содержанию АЗП, уровень которого колеблется в пределах от 300 до 400 нг/зерно. Такие же закономерности сохраняются и в случае пересчета количества АЗП на массу одного зерна.
Нами проведен специальный опыт по сравнительному анализу лектина в семенах различных образцов T.dicoccum, различающихся по годам репродукции и месту произрастания (Чишмы-Башкортостан и Дербент-Дагестан). Какой-либо закономерности в количественном изменении содержания АЗП в сухих семенах от репродукции и срока хранения не выявилось. Например, семена образца К-30092, репродуцированные в Дербенте в 1973 и 1985 годах (семена предоставлены ВИР), характеризуются близким содержанием лектина независимо от срока хранения семян (1973г-357 нг/зерно, 1985 Г.-365 нг/зерно). Произрастание одних и тех же образцов в Башкортостане или Дербенте разных годов репродукции заметно не сказывалось на изменении содержания лектина в сухих семенах.
Результаты анализа количественного содержания лектина в семенах гексаплоидных видов рода Triticum представлены в таблице 3.1.3. Для анализа были взяты сортообразцы видов T.spelta и T.aestivum. Как видно из данных таблицы 3.1.3, образцы этих видов характеризуются высокой гетерогенностью по содержанию АЗП. Причем вариабельность уровня содержания лектина проявляется намного сильнее при учете количества белка на грамм зерна. Так, например, содержание АЗП в расчете на грамм зерна у образцов T.spelta варьирует от 7,9 мкг (к-52465) до 33 мкг (к-13296). Остальные переменные по этому показателю занимают промежуточное положение.
Исследование уровня содержания лектина в сортообразцах T.aestivum показало, что минимальное количество белка отмечено в семенах образцов к-45717,к-46228, к-26574, а также у сортов Саратовская 55 и Саратовская 36. Наибольший уровень лектина среди сортообразцов T.aestivum был обнаружен у сорта Санзар 2 (46 мкг/г зерна), обладающего высокой устойчивостью к пыльной головне. Относительно высоким уровнем содержания АЗП характеризуется сорт Жница. Сорт Заря, Московская 35, Симбирка обладают промежуточным содержанием лектина с учетом как на 1 зерно, так и на грамм зерна. Хотя известно, что сорт Заря и к-45717 являются высокоиммунными к возбудителям твердой головни и корневых гнилей, каких -либо существенных отличий в содержании АЗП между устойчивыми и восприимчивыми сортами не обнаружено. Возможно, для установления четкой корреляции между содержанием лектина и устойчивостью к твердой головне необходимо использование больших количеств сортообразцов с различными типами устойчивости.
В целом, у тетраплоидов (геном АВ) и гексаплоидов (геном ABD) содержание лектинов в семенах несколько ниже, чем у диплоидного вида T.urartu (геном А). Однако с возрастанием плоидности пшениц увеличивается масса зерна. Большая выборка, использованная нами в анализе, позволила получить надежные данные о довольно высокой степени зависимости между содержанием АЗП в пшенице и ее плоидностью.
Образцы внутри видов пшениц с различной плоидностью характеризуются весьма значительной гетерогенностью по содержанию АЗП. Аналогичные результаты получены на исследованных нами образцах эгилопса, которые также вариабельны по содержанию АЗП. Интересно отметить, что максимальный зарегистрированный уровень АЗП имеет место у образцов T.urartu, достигающий 60-70 мкг/г зерна. У всех остальных образцов содержание лектина внутри вида исследованных видов рода Aegilops располагается в интервале 4-40 мкг/г зерна. Условия выращивания растений не влияют на уровень содержания лектина в семенах. Этот показатель, по видимому, довольно стабилен и не зависит от года репродукции и места произрастания.
Лектины пшеницы в онтогенезе растений
. У яровой пшеницы в начальный период развития растения главную роль в поглощении этих веществ играет первичная корневая система, а с периода цветения - вторичная, состоящая из узловых корней. В анатомическом плане зародышевые корни отличаются от узловых тем, что у последних имеется пояс арматурных клеток с утолщениями. Характерной особенностью пшеницы является процесс кущения, благодаря которому формируется растение. Онтогенез пшеницы складывается из двух периодов: фаза вегетативного роста при которой идет формирование корешков, стебля, листьев и генеративная фаза, при которой происходит формирование колоса, колосков, цветков, зерновок.
Действие экологических факторов (экстремальные условия) вызывают в генотипе разнообразные ответные защитно-приспособительные реакции. Каждый генотип обладает своей индивидуальной нормой реакции, т.е. гомеостазом, и, определенным образом модифицируя, адаптируется к среде. Интересно отметить, что у разных генотипов изменения физиологических функций в ответ на одинаковое экстремальное воздействие качественно сходны и носят лишь количественный характер. На разных этапах онтогенеза пшеничное растение обладает различным уровнем устойчивости. Обычно он низок в период прорастания и повышается к фазе кущения. Критический период - фаза выхода в трубку или колошение.
Исходя из описанных в предыдущих главах предполагаемых свойствах и функциях лектинов нами было изучено распространение и локализация их в различных тканях и органах пшеничного растения в онтогенезе. Обнаруженная нами высокая иммунохимическая специфичность лектинов, а также отсутствие единых структурных особенностей, позволяет анализировать каждый орган растения пшеницы во все периоды вегетирования растения. Выделяют восемь основных фаз: всходы, кущение, выход в трубку, колошение, цветение, молочная, восковая и полная спелости зерна. Объектом исследования был взят сорт яровой пшеницы Башкирская - 24. Это связано с тем, что замена аборигенных, но пластичных сортов высокоинтенсивными, но с меньшей приспособленностью, не способствует урожайности и приводит к ее вариабельности по годам (Неттевич, 1982).
Исследования лектинов первичной и вторичной корневой системы пшеницы показали, что они отличаются как по содержанию так и по гемагглютинирующей активности (ГА). Характер корневой системы в селекции на засухоустойчивость рассматривается как один из важнейших признаков. Кроме того, зародышевые корни особенно сильно подвергаются нападению со стороны возбудителей корневых гнилей. Возможно этим объясняется повышенное содержание и высокая ГА лектинов зародышевых и колеоптиальных корней первичной корневой системы. В то же время, в тканях узловых корней в период цветения резко повышаются изучаемые параметры расположенных выше, содержание и ГА лектинов также высокое, чем у нижних корней, у которых тоньше кора и арматурный пояс, меньше число крупных сосудов и пучков флоэмы (Овчинников и др., 1964). Хорошее развитие корневой системы дает раннее образование вторичных корней (не менее 6-8). Проводимые нами исследования корневой системы пшеницы применительно к лектинам направлены на выявление, в первую очередь, путей повышения их содержания и ГА в первичной корневой системе, которые найдут отражение в последующих разделах.
Изучение прочносвязанных с мембранами и растворимых форм лектинов корней пшеницы показало, что основная часть (2/3) их находится среди цитоплазматических белков и только одна седьмая или одна четвертая части содержится во фракции клеточных стенок и плазматических мембран, в клетках корней проростков лектины преимущественно представлены в растворимой форме. В случае определения суммарных лектинов из вторичных корней на VII1 этапе онтогенеза было выявлено, что связанных лектинов становится больше, что, возможно, обусловлено возрастом и биологическим состоянием корней, т.к. корни залегают глубоко (до 1,5 м) под землей. Мембраносвязанные лектины обладают большой активностью в отношении клеток, что косвенно указывает на их активное участие в поглощении воды и минеральных веществ из почвы, синтезе различных биополимеров.
Из тканей конуса нарастания образуются листья, которые отходят от стеблевых узлов. Первыми развиваются прикорневые листья, которые связаны с подземными узлами стебля. На стебле образуются от 7 до 10 листьев, из них 4-5 прикорневые, а остальные стеблевые.
Исследования показали, что высокой ГА обладают лектины из узла кущения и конуса нарастания. Возможно, это связано с преобладанием в этих органах бифункциональных лектинов. Бифункциональные лектины обладают помимо лектиновой еще и ферментативной или другой биологической активностью, участвуют как экзо- и эндогенные регуляторы метаболических процессов. Еще предстоит выяснить о регуляторных возможностях лектинов на молекулярном и клеточном уровнях в отношении ферментов.
Прикорневые листья, которые связаны с подземными узлами стебля, обладают низкой ГА лектинов, чем остальные стеблевые. Интересно отметить, что листья различных ярусов также различаются межу собой по содержанию и ГА лектинов (табл.5.2.2).
Исследования по динамике накопления лектинов в листьях показали, что содержание их находится в прямой зависимости с площадью ассимиляционной поверхности листьев и абсорбцией света ХБК. Главным условием этих различий является последовательное появление новых листьев, генеративных органов при изменении их физиологического состояния, в основе которых лежат фенологические фазы. В онтогенезе растения по мере формирования новых ярусов листьев меняется роль отдельных листьев в создании ассимилятов. У пшеницы с возрастанием ярусности увеличивается количество хлоропластов и количество лектинов в ХБК. Интенсивность фотосинтеза и ГА лектинов флагового листа максимальна до колошения. После колошения флаговый лист значительно снижает фотосинтез. С помощью гемагглютинации определяли присутствие лектиновой активности и. содержание лектинов в экстрактах из недозревших и зрелых для оплодотворения пыльцы (рис. 5.2.2). В этих пыльниках обнаружены различия в содержании и активности лектинов.
Влияние минерального питания на лектины растений
Наше знание физиологии взаимоотношений растения-хозяина и паразита в настоящее время может дать лишь ограниченную информацию для селекции устойчивых форм на основе специфической устойчивости ген-на-ген. Необходимы дальнейшие исследования для расшифровки механизмов более общей неспецифической устойчивости, что важно для преодоления трудностей, связанных с появлением новых физиологических рас. В этой связи следует указать на возможную роль баланса питательных веществ при совместимой комбинации хозяина и патогена. Пищевые взаимоотношения должны оцениваться по степени, а не по типу устойчивости и могут вызываться как особыми потребностями паразита, так и потребностями растения-хозяина в питательных веществах и кофакторах или изменением содержания ингибирующих и тормозящих рост веществ в тканях растения - хозяина. Возможная роль лектинов в этом процессе практически неизвестна.
В связи с тем, что существует настоятельная необходимость поисков типов действительно неспецифической устойчивости, требуется знать значительно больше об особом физиологическом действии минерального питания растений на динамику в содержании и активности лектинов. Как известно, несовместимость является результатом высокоспецифических реакций, определяемых соответствующими генами хозяина и паразита.
Возникает вопрос, как этот процесс переключается. Сначала происходят специфические реакции, повреждающие клетку хозяина, которыми начинается цепь неспецифических реакций.
Физиологическое состояние растений резко изменяется при взаимодействии хозяина и паразита. Основное направление физиологических процессов, по-видимому, почти одинаково в тканях, пронизанных грибом, и в тканях зараженных вирусами, если не учитывать, что эти процессы возникают при различных комбинациях хозяина и паразита. Поэтому мы ставили вопрос о том, что действительно ли результаты исследований лектинов отражают только тип стандартной реакции, происходящей в растениях в период критического напряжения и независимы от типа триггерной реакции. Мы должны констатировать тот факт, что биохимические различия между совместимыми и несовместимыми парами сорт-раса не содержат информации о действительной причине несовместимости. В более ранних работах можно найти много примеров неправильной интерпретации таких явлений. В общем, необходимо располагать большей информацией, чтобы понять причинность явлений при взаимодействии хозяина-паразита. Необходимы эксперименты с использованием антиметаболитов, лектинов и ингибиторов ферментов для снижения и усиления устойчивости; необходимо использование меченых соединений, дающих возможность проследить их пути и пути их метаболитов в тканях. Мы твердо придерживаемся принципа: отношения ткани хозяина и паразита являются в действительности проявлением активности живых организмов, независимо от степени совместимости.
В этой связи представляет большой интерес поиск и внедрение способов и приемов повышения иммунитета растений к заражению вредными организмами. Так, рядом исследователей были обнаружены эффекты ингибирования вирусов при обработке растений микроэлементами (солями бора, меди, цинка, кобальта и никеля).
Возникновение индуцированной устойчивости . под влиянием микроэлементов связано с глубокими метаболическими изменениями в растениях (Страхов, 1959). В длительном эксперименте в полевых условиях нами показана перспективность предпосевной обработки семян пшеницы солями никеля, кобальта и меди в защите растений от комплекса почвенных грибных патогенов. Положительный эффект от использования данного приема состоит в снижении заболевания, повышении урожая и качества продукции. Для познания молекулярных механизмов устойчивости под влиянием микроэлементов, проводили исследования лектинов в корнях и проростках пшеницы.
При заражении корневыми гнилями наблюдалось, с одной стороны, падение содержания ИУК, а с другой - повышение содержания АБК. В этой связи необходимо отметить, что увеличение АБК при стрессовых ситуациях рассматривается как проявление неспецифической реакции растительного организма. Ф.М. Шакировой и др. (1993) обнаружена индукция накопления АЗП под влиянием АБК. Повышение уровня ИУК при грибных заболеваниях Ю.Т.Дьяков (1994) рассматривает как фактор, способствующий повреждению растений. Обработка микроэлементами снижает степень развития корневой гнили, что приводит к уменьшению содержания ИУК и увеличению АБК. Микроэлементы усиливают также абсорбционные свойства листьев. При использовании их возрастает содержание ГА растворимых и мембраносвязанных лектинов хлоропластов, что находится в прямой зависимости от содержания хлорофилла и абсорбции света листьями (г-0,6). Таким образом, микроэлементы, природные регуляторы роста, защитно-стимулирующие составы, влияя на активность лектинов и фитогормонов, повышают болезнеустойчивость растений и стимулируют продукционный процесс.
Обработка микроэлементами приводила в незараженных растениях к повышению уровня АБК и изменению содержания и ГА лектинов. Отсюда следует, что микроэлементы (0,1% MnS04 + 0,05% NiS04 + 0,05% C0SO4) способны индуцировать изменение баланса гормонов, лектинов и соответственно обеспечивают перестройку метаболизма растительного организма к возможным стрессам. Обработка никелем, кобальтом и медью зараженных корневыми гнилями семян пшеницы существенно меняла индуцированное патогенезом лектиновую активность. При этом также возрастало содержание АБК и ГА лектинов по сравнению с контролем (рис. 8.7.1).
После обработки семян микроэлементами отмечено снижение заболевания корней и проростков корневыми гнилями. Приведенные выше данные об эффектинности обработок семян солями кобальта, никеля и меди на проявление симптомов заболевания на растениях подтверждены результатами полевых опытов по изучению их влияния на показатели урожая.
В условиях Башкортостана на черноземных почвах наибольшее значение для урожая проса имеют микроудобрения. Опыты показали высокую отзывчивость проса на обработку солями марганца, никеля и кобальта. При обработке семян микроэлементами путем замачивания применялись: 0,1% раствор MnS04, 0,05% раствор CoS04 и NiS04. Замачивание семян в этих в растворе проводили в 2 - 3 приема, с выдерживанием по 5-6 часов. Опыты проводили с с.Скороспелое 66.
Исследования показали, что предпосевная обработка семян этими микроэлементами не вызывет задержки прорастания высеянных семян, более того под влиянием марганца, никеля и кобальта повышалась энергия прорастания, всхожесть и сила начального роста семян. При внесении этих микроудобрений с семенами происходило более мощное развитие корневой системы. Активность лектинов и абсорбционные свойства определяли в фазе кущения проса (на 20-ый день после полных всходов). Установлено, что в корнях и листьях гемагглютинирующая активность лектинов во всех вариантах опытных растений значительно повышается (табл. 8.7.1). Замачивание семян микроэлементами усиливает также абсорбционные свойства листьев.
