Введение к работе
Актуальность проблемы. Для получения стабильных и гарантированных урожаев картофеля необходим свободный от патогенов безвирусный посадочный материал [Шмыгля, Лодочкин, 1983; Трофимец и др., 1985; 1988; 1994]. Одним из путей решения данной проблемы является использование в качестве оздоровленного материала микроклубней (клубни картофеля размером до 10 мм, получаемые в условиях in vitro) [Остапенко, 1983; Мелик-Саркисов и др., 1985; Трофимец и др., 1985; Макаров, 1990; Овчинникова, 1992]. В связи с этим, актуальна задача совершенствования способов получения микроклубней с целью повышения производительности процесса и сведения к минимуму возможности повторного заражения. Исследователи США и Японии предлагают для получения микроклубней картофеля использовать "замкнутые системы" биореакторов - одного из перспективных направлений повышения эффективности процесса массового получения первичного безвирусного материала. Выбор обоснован имеющимися положительными результатами по разработке технологии клонального микроразмножения в биореакторах для лилии, гладиолусов, гиацинта, филодендрона и др. [Липский, 1993; Takayama, Akita, 1994]. Известные в настоящее время типы биореакторов для получения микроклубней картофеля являются не промышленными, а модельными лабораторными установками [McCown, Joyce, 1991; Akita, Takayama, 1994]. Поэтому, создание эффективной промышленной биореакторной установки по получению микроклубней картофеля предусматривает на первом этапе работы изучение физиологических процессов, связанных с каждым этапом клубнеобразования и выявления возможностей воздействия на направление и их скорость.
Цель работы состояла в изучении и регулировании этапов столоне- и клуб-необразования в культуре in vitro на жидких питательных средах в биореакторах модельных конструкций, а также разработка подходов к созданию технологии массового получения оздоровленных микроклубней картофеля.
Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Подобрать оптимальные условия культивирования и изучить динамику развития столонов и формирования микроклубней картофеля на жидких питательных средах в биореакторах модельных конструкций;
-
Выявить для сортов картофеля разных фупп спелости универсальный режим синхронизации развития столонов;
-
Провести скрининг веществ регуляторного действия для выявления соединений, снимающих апикальное доминирование, индуцирующих развитие латеральных столонов и изучить их влияние на клубнеобразование;
4. Выявить преимущества практического применения пневмоимпульсного
биореактора для получения микроклубней картофеля;
5. Провести оценку семенных качеств микроклубней картофеля в условия*
вегетационного опыта в почвенной культуре.
Научная новизна работы. Впервые доказана принципиальная возможность применения, созданного в Отделе биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН, пневмоимпульсного биореактора для получения оздоровленных микроклубней картофеля. Подобран универсальный режим синхронизации развития столонов при воздействии на исходные стеблевые экспланты пониженными положительными температурами. Оптимизирован для условий in vitro метод определения физиологической зрелости микроклубней картофеля при помощи водного раствора 2,3,5-трифенилтетразолийхлорида.
Практическая значимость работы. Разработана и успешно апробирована лабораторная модель пневмоимпульсного биореактора и показана принципиальная возможность использования в практике всей технологии получения оздоровленных микроклубней картофеля. Выявленны в ходе экспериментов особенности физиологических этапов (столоне- и клубнеобразование) в биореакторах на жидких питательных средах, что необходимо учитывать при разработке технологии массового получения оздоровленного семенного материала картофеля. Показана практическая возможность использования микроклубней, получаемых в биореакторах модельных конструкций, в качестве полноценного оздоровленного посадочного материала.
Апробация работы. Результаты работы доложены на: научных семинарах Отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР (Москва, 1994; 1996) и биологического факультета МГУ имени Н.П.Огарева (Саранск, 1997); XXIII научной конференции "Огаревские чтения" (МГУ им.Н.П.Огарева, Саранск, 1994); V планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия" (ИБХ, Москва, 1S95).
Основные положения работы были представлены на: XXIV научной конференции "Огаревские чтения" (МГУ имени Н.П.Огарева, Саранск, 1995); III Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1995); III Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (ТСХА, Москва, 1995); Всемирном конгрессе по биологии in vitro (USA, San Francisco, 1996).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре работы, подана заявка на изобретение, одна статья принята в печать.
з Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения,
обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (четыре главы), заключения, выводов и списка цитируемой литературы.
Работа изложена на Y2.V страницах машинописного текста, содержит 26 рисунков, 5 таблиц, иллюстрирована 12 фотографиями. Список цитируемой литературы включает 197 наименований, из которых 118 зарубежные.
Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке Государственной научно-технической программы России "Новейшие методы биоинженерии" направление "Генная и клеточная инженерия".
